全 文 ：蒙山牛肝菌液体发酵培养基的优化
徐晓蝶，牟敏捷，朱婷婷，邱国良，郝继伟* (临沂大学生命科学学院，山东临沂 276000)
摘要 ［目的］优化蒙山牛肝菌液体发酵培养基。［方法］以菌丝干重为指标，首先采用单因素试验筛选适于菌丝体生长的最佳碳氮
源，再以正交试验优化碳源与氮源以及无机盐与 VB1 的最佳配比。［结果］蒙山野生牛肝菌优化的液体培养基配方为乳糖 10 g /L，可溶
性淀粉 20 g /L，酵母膏 5 g /L，牛肉膏 10 g /L，KH2PO41 g /L，MgSO4·7H2O 1 g /L。［结论］正交设计法优化的蒙山牛肝菌液体发酵培养
基具有一定的应用价值，可为大规模发酵生产及后继研究提供基础数据。
关键词 正交设计;牛肝菌;液体培养基
中图分类号 S336 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2015)35 －241 －02
The Optimization of Liquid Fermentation Medium of Mengshan Mountain Boletus
XU Xiao-die，MU Min-jie，ZHU Ting-ting，HAO Ji-wei* et al (College of Life Science，Linyin Normal University，Linyi，Shandong
276000)
Abstract ［Objective］The aim was to optimize liquid fermentation medium of Mengshan mountain boletus． ［Method］Adopting mycelial dry of
Mengshan mountain boletus as major index，firstly the single factor method was used to select the best carbon source and nitrogen source for my-
celium growth，and then the optimum ratio of carbon source，nitrogen source，inorganic salt and VB1 was optimized by the orthogonal experiment．
［Ｒesult］The optional liquid fermentation medium of Mengshan mountain boletus were as follow:lactose of 10 g /L，soluble starch of 20 g /L，
yeast extract of 5 g /L，beef paste of 10 g /L，KH2PO4 of 1 g /L，MgSO4·7H2O of 1 g /L． ［Conclusion］The optimized liquid fermentation culture
medium of Mengshan mountain boletus by the orthogonal design has a certain application value，and can provide the basic data for large-scale fer-
mentation and subsequent research．
Key words Orthogonal design;Boletus;Liquid fermentation medium
基金项目 国家级大学生创业创新训练计划资助项目。
作者简介 徐晓蝶(1997 － ) ，女，安徽亳州人，本科生，专业:生物科学。
* 通讯作者，副教授，从事食药真菌开发利用及野生资源保
护方面的研究。
收稿日期 2015-10-20
牛肝菌(Boletus sp)是一种菌根真菌，通常与松树的树
根形成共生菌根，属担子菌亚门层菌纲伞菌目牛肝菌科［1］。
全世界范围内已确定的牛肝菌属共有 130多种，在我国可食
用的有 31种［2］。蒙山牛肝菌是生长在沂蒙山区山林中的一
类野生牛肝菌，具有独特的风味和极高的营养价值，深受当
地人们的喜爱，作为一种药用真菌具有很大的商业开发
潜力。
牛肝菌作为一种菌根真菌，目前尚不能人工栽培，但其
液体发酵培养菌丝的营养成分和其子实体的营养成分基本
一致，通过液体发酵培养牛肝菌将是未来研究的趋势［3］。笔
者利用正交设计法，对野生蒙山牛肝菌液体发酵培养基中的
主要成分进行优化，以期为大规模发酵生产及后继研究提供
基础数据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
1． 1． 1 供试菌种。蒙山野生牛肝菌鲜菇采自蒙山。
1． 1． 2 仪器设备。SW-CJ 超净工作台，高压灭菌锅，DGG-
9075A型电热恒温鼓风干燥箱，SPX-250B-Z 型生化培养箱，
EO2140型分析天平，DKY2型恒温培养摇床，电磁炉。
1． 1． 3 培养基。①母种培养基:马铃薯(去皮)200 g，蔗糖
20 g，麸皮 30 g(煮汁)，VB10． 5 g，KH2PO4 2 g，MgSO4·7H2O 1
g，琼脂 20 g，水 1 000 ml。②液体菌种基础培养基:蛋白胨 3
g /L，葡萄糖 20 g /L，KH2PO4 1 g /L，MgSO4·7H2O 0． 5 g /L，
VB1 0． 5 g /L。③碳源优化培养基:以液体菌种基础培养基中
葡萄糖作对照，分别用乳糖 20 g /L、麦芽糖 20 g /L、蔗糖 20
g /L、可溶性淀粉 20 g /L、甘露醇 20 g /L代替葡萄糖。④氮源
优化培养基:以液体菌种基础培养基中蛋白胨作对照，分别
用酵母膏 10 g /L、牛肉膏 10 g /L、(NH4)2SO4 10 g /L、豆粕 10
g /L代替蛋白胨。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 斜面菌种制备。母种培养基灭菌后摆成斜面，在无
菌条件下采用组织块法将牛肝菌鲜菇接种到斜面培养基中
部，然后置于 25 ℃下培养 15 d左右，即可得到蒙山牛肝菌的
斜面菌种。挑选无污染、健壮的菌种备用。
1． 2． 2 液体菌种制备。液体菌种基础培养基按配方配制好
后，按每瓶 150 ml倒入干净的 250 ml三角瓶中，用透气封口
膜封口并用牛皮纸包裹瓶口，于 121 ℃下灭菌 20 min。冷却
后，取 0． 5 ～1． 0 cm2的母种块接入液体菌种。先 25 ℃下静
置培养 2 d，然后 120 r /min振荡培养 6 d，在瓶中即可看到大
量菌球形成。
1． 2． 3 发酵试验。无菌条件下用灭过菌的玻棒破碎液体菌
种的菌球，然后按 10%(V /V)的接种量用无菌吸管吸取液体
菌种，接种于灭菌后的相应液体培养基中，在 25 ℃、120
r /min的条件下振荡培养 3 d。
1． 2． 4 菌丝重量测定。发酵试验后通过观察剔除污染的试
验处理，如果由于污染影响到试验结果的分析，需要补充相
关试验。将无污染三角瓶中的菌体与培养液的混合物置于
80 目网筛上过筛，通过蒸馏水洗涤后，置于 80 ℃干燥箱内干
燥至恒重，称重。
2 结果与分析
2． 1 不同碳源对菌丝生长量的影响 从图 1 可以看出，蒙
山牛肝菌在乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇
6种培养基中都能生长。其中以乳糖、可溶性淀粉作碳源时，
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2015，43(35):241 － 242，252 责任编辑 李占东 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2015.35.089
菌丝产量最高，所以选用乳糖、可溶性淀粉作为正交试验的
碳源因子。
图 1 不同碳源对蒙山牛肝菌菌丝干重的影响
2． 2 不同氮源对菌丝生长量的影响 从图 2 可以看出，蒙
山牛肝菌对酵母膏、牛肉膏的利用效果较好，且二者的菌丝
产量接近，但对铵盐的利用效果较差，所以采用酵母膏、牛肉
膏作为正交试验的氮源因子。
图 2 不同氮源对蒙山牛肝菌菌丝干重的影响
2． 3 碳氮源组合的优化 碳氮源组合优化基础培养基为
KH2PO4 1 g /L、MgSO4·7H2O 0． 5 g /L、VB1 0． 5 g /L。根据单
因素试验的结果，在基础培养基内添加不同浓度的乳糖和可
溶性淀粉作为碳源，添加不同浓度的酵母膏和牛肉膏作为氮
源，采用 L9(34)正交试验来确定碳氮源的最佳组合。试验因
素及水平见表 1，并设 3 次重复。通过测定菌丝干重来确定
碳氮源的最佳组合。
表 1 碳氮源正交试验的因素与水平 g /L
水平
因素
乳糖
(A)
可溶性淀
粉(B)
酵母
膏(C)
牛肉
膏(D)
1 15 15 5 5
2 20 20 10 10
3 25 25 15 15
正交试验结果见表 2。对表 2 结果进行方差分析，结果
表明，乳糖(A)与酵母膏(C)对试验结果并无显著影响(P ＞
0． 05);而可溶性淀粉(B)与牛肉膏(D)对试验结果有极显著
影响(P ＜0． 01)，进一步结合表 2 极差分析结果 Ｒ(B)＞ Ｒ
(D)＞ Ｒ(A)＞ Ｒ(C)，可知 4因素对试验结果影响大小依次
为可溶性淀粉、牛肉膏、乳糖、酵母膏。
由表 2 可知，处理 A2B2C3D3 菌丝干重最大，A3B2C1D2
与 A2B2C3D3 无显著差异，则二者均为最好水平组合。但从
极差分析结果可知，A2B2C2D2 应为最佳水平组合，该组合在
正交试验表中并未出现，需要作验证试验进行确认。验证试
验结果表明，菌丝干重平均值为 22． 4 g /L，高于其他两组合，
但并无显著差异。因此，A2B2C2D2 虽为该试验最佳水平组
合，但由于乳糖与酵母膏对试验结果无显著影响，因此建议
生产中因降低生产成本的需要可采用的最佳碳氮源组合为
A1B2C1D2，即乳糖 10 g /L，可溶性淀粉 20 g /L，酵母膏 5 g /L，
牛肉膏 10 g /L。
表 2 碳氮源正交试验结果
试验号
因素
A B C D
平均菌丝
干重∥g /L
1 1 1 3 2 19． 9 de
2 2 1 1 1 18． 8 fg
3 3 1 2 3 19． 4 ef
4 1 2 2 1 20． 9 bc
5 2 2 3 3 21． 7 a
6 3 2 1 2 21． 6 ab
7 1 3 1 3 19． 6 e
8 2 3 2 2 20． 5 cd
9 3 3 3 1 18． 7 g
k1 20． 1 19． 4 20． 0 19． 5
k2 20． 3 21． 4 20． 3 20． 6
k3 19． 9 19． 6 20． 1 20． 2
Ｒ 0． 04 0． 21 0． 03 0． 12
注:同列不同小写字母表示差异显著(P ＜0． 05)。
2． 4 无机盐及维生素的优化 以碳氮源最佳组合即乳糖 10
g /L、可溶性淀粉 20 g /L、酵母膏 5 g /L、牛肉膏 10 g /L为供试
基础培养基。在培养基内分别添加不同浓度的 KH2PO4、Mg-
SO4·7H2O、VB1，采用 L9(3
4)正交试验确定无机盐与维生素
的最佳配比，试验因素及水平见表 3，并设 3次重复。通过测
定菌丝干重来确定无机盐与维生素的最佳配比。
表 3 无机盐及维生素正交试验因素与水平 g /L
水平
因素
KH2PO4(A) MgSO4·7H2O(B) VB1(C)
1 0． 5 0． 5 0
2 1． 0 1． 0 0． 05
3 1． 5 1． 5 0． 10
正交试验结果见表 4。对表 4 试验结果进行方差分析，
结果表明，KH2PO4(A)与 MgSO4·7H2O(B)对试验结果有极
显著影响(P ＜0． 05) ;而 VB1(C)对试验结果无显著影响(P
＞0． 05)，进一步结合表 4 极差分析结果 Ｒ(A)＞ Ｒ(B)＞ Ｒ
(C) ，可知 3 因素对试验结果影响大小依次为 KH2PO4、
MgSO4·7H2O、VB1。
由表 4 可知，处理 A2B2C3 菌丝干重最大，与 A2B1C1、
A1B2C2 和 A2B3C2 间无显著差异，但从极差分析结果可知，
A2B2C2 应为最佳水平组合，该组合在正交试验表中并未出
现，需要作验证试验进行确认。验证试验结果表明，菌丝干
重平均值为 22． 8 g /L，与 A2B2C3 相近。考虑到 VB1(C)对试
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242 安徽农业科学 2015 年
果将此在古镇乡村复制，这种做法显然容易导致城乡同质
化。采取城乡优势互补，差别化建设乡村景观，可以保留乡
村的天然优势。赣南又是江西省最大的行政区，应尽量建设
“一村一品”的特色乡村景观。
3． 3 因地制宜，建设宜居绿色乡村 赣南原中央苏区乡村
几乎都处于丘陵或群山环绕地带，且赣南又是一个“堪舆术”
特别兴盛的地方，乡风淳朴，加之客家围屋遗留下来的建筑
技术、装饰工艺等遗产，养成了赣南人民千百年来“天人合
一”的自然和谐观。评价乡村景观是乡村景观规划的基础性
工作，如今在赣南乡村依然保留了先人在村落选址方面的风
水知识，积极探索适合人们居住的生活环境。
3． 4 适度发展乡村旅游产业 乡村经济活动是乡村居民的
主要活动形式，它以特殊的方式、方法和表现形态融于乡村
景观体系之中，构成乡村特有的经济空间［9 －10］。赣南乡村景
观具有明显的比较优势，一是与江西其他地区的乡村聚落景
观有比较大的差异，因为赣南的客家人比例达 90%，无论是
民居还是民风民俗都以比较纯正的客家风貌示人;二是赣南
客家与红色革命两种资源并存，体现了其资源的稀有性和独
特性。适度发展赣南乡村旅游业，不仅可以改善当地的民生
问题，也是传扬当地乡村景观的极好途径。
4 结语
《国务院关于支持赣南等原中央苏区振兴发展的若干意
见》的发展目标实际上给赣南乡村景观的建设与保护提出具
体的实现路径，认为赣南等原中央苏区在解决突出的民生问
题和制约发展的薄弱环节方面要取得突破性进展，特别是对
农村危旧土坯房改造、城镇化率的提升，以及生态建设和环
境保护方面要取得显著成效。但是实现该目标仍然需要付
出艰辛的努力，保护和提升赣南的乡村景观是实现乡村经
济、生态环境可持续发展的现实要求。
参考文献
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105 －108．
(上接第 242页)
验结果无显著影响，因此建议生产中采用的无机盐及维生素
组合为 A2B2C1，即 KH2PO4 1 g /L，MgSO4·7H2O 1 g /L。
表 4 无机盐及维生素正交试验结果
试验号
因素
A B C D(空列)
平均菌丝
干重∥g /L
1 1 1 3 2 20． 3 c
2 2 1 1 1 21． 9 ab
3 3 1 2 3 20． 2 c
4 1 2 2 1 22． 2 ab
5 2 2 3 3 22． 9 a
6 3 2 1 2 21． 2 bc
7 1 3 1 3 20． 0 c
8 2 3 2 2 21． 8 ab
9 3 3 3 1 20． 5 c
k1 20． 8 20． 8 21． 0 21． 5
k2 22． 2 22． 1 21． 4 21． 1
k3 20． 6 20． 7 21． 2 21． 0
Ｒ 0． 16 0． 14 0． 40 0． 50
注:同列不同小写字母表示差异显著(P ＜0． 05)。
3 结论与讨论
该研究表明，蒙山野生牛肝菌液体培养基最佳配方为乳
糖 10 g /L，可溶性淀粉 20 g /L，酵母膏 5 g /L，牛肉膏 10 g /L，
KH2PO41 g /L，MgSO4·7H2O 1 g /L，与张扬等
［4］对红绒盖牛
肝菌的研究、郭永月等［5］对黑牛肝菌的研究、冮洁等［6］对美
味牛肝菌的研究略有差别，主要原因为牛肝菌品种不同。但
以上研究中有一共同点，即其配方中的碳氮源均为有机的，
由此可见牛肝菌在液体培养中对营养物质的需求较全面。
在通过正交设计法优化培养基的过程中，多数人单纯根
据极差法得到最佳组合［4］，往往得出的结论较片面化、理论
化。而极差法与方差分析法相结合得到的结论更加合理、应
用性更强。该试验中得出的最佳配方为乳糖 10 g /L，可溶性
淀粉 20 g /L，酵母膏 5 g /L，牛肉膏 10 g /L，KH2PO41 g /L，Mg-
SO4·7H2O 1 g /L，相较于单纯根据极差法得到的结论可以
减少非显著因素的用量，在生产上可节约生产成本，提高一
定的经济效益。
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252 安徽农业科学 2015 年