全 文 ：新疆雪莲水溶性多糖的分离纯化及生物活性研究
刘春兰 ,邓义红 ,杜　宁 ,杨　林
(中央民族大学生命与环境科学学院 ,北京 100081)
　　摘要　采用热水浸提醇沉法从新疆雪莲中提取水溶性粗多糖 XL。此粗多糖经分离纯化得多糖 XL
31
。 XL
31
经
检测为纯多糖。对新疆雪莲多糖 XL31进行清除自由基活性及抑菌活性研究 ,结果表明 XL31对羟自由基及超氧阴离
子自由基具有明显的清除效果 , 但对脂质自由基的清除效果不明显;XL31对细菌有较强的抑制作用 ,对真菌无抑制
作用。
关键词　新疆雪莲多糖;分离纯化;自由基;抑菌作用
中图分类号:R284.2/285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)01-0101-04
基金项目:国家 “ 985”工程———中央民族大学 “ 985”工程重点科研项目(cun985-3-3)作者简介:刘春兰(1962-),女,副教授 ,研究方向:糖化学;Tel:010-68156198, E-mail:liuchunlan888@yahoo.com.cn。
　　雪莲(SausuraeinvolucrateKar.etKir.)系菊科
凤毛菊属的高山草本植物 ,是我国民族药中有代表
性的珍稀名贵药材。雪莲生长在海拔 4800 ～ 5800
米的高山流石坡以及雪线附近的碎石间 ,难以采集 ,
是国家三级濒危物种 。雪莲的化学成分主要有黄酮
类化合物 、糖类 、萜类及其衍生物 、甾体成分 、木脂素
等 〔1〕。目前对野生和离体培养雪莲中主要活性物
质黄酮类化合物的检测研究较多 〔2、 3〕 ,但对其药效
上有独特作用的活性成分 (如多糖等 )研究较
少 〔4、 5〕。有关新疆雪莲多糖的提取 、纯化及其多糖
的清除自由基 、抗菌实验还未见报道。本文对产于
新疆和静县的新疆雪莲进行水溶性多糖提取 、纯化 ,
并进行抗菌及体外清除自由基活性研究 ,为进一步
探讨雪莲多糖的药理活性 ,完善雪莲多糖的质量评
价体系和合理利用新疆雪莲提供依据 。
1 　材料与方法
1.1 　材料与仪器　新疆雪莲 Saussureainvolucrata
Kar.etKir.系菊科凤毛菊属 ,由中央民族大学生命
与环境科学院杨林老师鉴定 ,购自新疆和静县 。大
肠杆菌(1.2385)、枯草杆菌(1.1849)、金黄色葡萄
球菌 (1.1861)、黑 曲霉 (3.5487)、产黄 霉菌
(3.6892)购于中国微生物菌种保藏管理委员会普
通微生物中心。
细菌培养基:牛肉膏蛋白胨培养基 (牛肉膏 3
g、蛋白胨 10 g、NaCl5 g、琼脂 18 g、水 1000 ml, pH
值为 7.0 ～ 7.2)。
真菌培养基:马铃薯培养基(马铃薯 200g、葡萄
糖 20g、琼脂 15 g、水 1000 ml, pH值自然)。
FC-95A馏分自助收集器 (上海青浦沪西仪器
厂), 8002电热恒温水浴锅(天津市中环实验电炉有
限公司),精密电子天平(感量 1/104), LD4-8型离
心机(北京医用离心机), UV-Jasco53型紫外分光光
度计(日本岛津公司), DEAE-SephdexA25, Sephro-
seCL-4B(美国 Pharmacia公司)。
1.2　新疆雪莲粗多糖的提取 〔6〕　准确称取干燥的
新疆雪莲 ,加入 95%的乙醇回流脱脂 , 85℃水浴提
取 ,乙醇沉淀 ,真空干燥后得新疆雪莲多糖粗品。
1.3　新疆雪莲纯化及杂多糖制备　将粗多糖配成
2%溶液 ,链酶蛋白酶与 Sevage法联合脱蛋白 ,重复
三次 〔9〕。加入 pH为 2.5的 95%乙醇至醇浓度达
30%,离心沉淀常规干燥。上清液中继续加入以上
乙醇至醇浓度达 50%,离心沉淀常规干燥 。上清液
中继续加入如上乙醇至醇浓度达 70%以上 ,离心沉
淀常规干燥。
1.4　纯化多糖制备及其纯度鉴定〔7、8〕　加以上乙
醇至醇浓度达 70%以上所得沉淀干燥后采用 DE-
AE-SephadexA-25分离纯化 ,用 0.5 mol/L的 NaCl
溶液洗脱 ,流速 0.75 ml/min,部分收集。
1.4.1 　纸层析纯度鉴定 〔7〕:用新华 1号中速滤纸
(15 cm×40 cm)进行层析 ,溶剂系统为乙酸乙酯:
醋酸:水(4∶1∶1),苯胺-邻苯二甲酸试剂显色 。
1.4.2 　醋酸纤维薄膜电泳纯度鉴定 〔8〕:采用 pH
为 12.5的 0.025mol/L绷酸盐为电极缓冲液 ,电压
250伏 ,电泳时间 30 min,用 0.5%甲苯胺蓝乙醇溶
液染色。
1.4.3　SephroseCL-4B柱层析纯度鉴定 〔9〕:取 5mg
多糖配成 10 mg/ml溶液 ,取 0.5ml上样 , 0.1mol/L
NaCl溶液洗脱 ,流速 0.45 ml/min,每管 2 ml收集 ,
苯酚 -硫酸法测定多糖 ,绘制层析图谱 ,观察结果 。
1.5　清除自由基活性测定
1.5.1 　多糖清除 · OH的测定〔10、11〕:参考 Fenton
反应体系模型 ,采用固定时间反应法 ,在相同反应体
积的反应体系 (8.8 mmol/LH2O2、 9 mmol/LFe2+
0.5 ml、9 mmol/L水杨酸乙醇溶液 0.5 ml)内加入
·101·中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 1期 2008年 1月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2008.01.039
一系列不同浓度的多糖溶液 ,并以蒸馏水作参比 ,与
试剂空白液作比较 ,在 510nm处测量各浓度下的吸
光度 A。按下计算清除率:
清除率 =(A0 -A样品)/A0 ×100%
1.5.2　多糖清除 O-2 ·的测定:参考 Hassan〔12〕的
光化学方法建立实验模型反应体系 ,包括 2.4 ×10-6
mol/LRFV0.3 ml, 0.01 mol/LMet0.3 ml, 1.67×
10
-4 mol/LNBT0.2 ml, 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH
8.0)和不同浓度的多糖溶液 1 ml,将反应体系置于
日光下 30 min后 ,在 560 nm处测量各浓度多糖的
吸光度 A。
1.5.3　多糖清除 R·的测定:参考 R·的反应体
系 〔13〕 ,含 50%乙醇 2 ml, 0.01%大豆油 1 ml, 0.1
mol/LFeSO4-EDTA1 ml, 0.1 mol/L磷酸缓冲液 2
ml及不同浓度的多糖 1ml,将反应体系用紫外线照
射 60min,在不同浓度的多糖溶液中加 20%三氯乙
酸 1 ml,混匀 ,加 0.67%硫代巴比妥酸(TBA),沸水
浴 10min, MDA可与 TBA发生反应生成红色的物
质 ,在 532 nm处测定各浓度下的吸光度 A。
1.6 　抑菌作用研究
1.6.1　最低抑菌浓度确定:细菌:用分光光度计测
定在波长为 550 nm处的细菌培养液 OD值 。培养
液 OD值与培养液内细菌繁殖速度呈正相关 , OD值
升高越快 ,表示培养液内细菌繁殖速度越快 。若细
菌培养液的吸光度与空白对照组一致 ,表明该培养
液中完全没有细菌生长繁殖 ,则该样液浓度即为雪
莲多糖的最低抑菌浓度。
霉菌:用目视观察法确定最低抑菌浓度。
1.6.2　抑菌活性研究:采用原形纸片法 〔14〕 ,分别
刮取供试菌(5种)菌苔于 5 ml无菌水中 ,振荡摇匀
得菌悬液 ,倒入溶化并冷却至 40 ～ 45℃的相应培养
基中 ,摇匀后 ,迅速分装于培养皿中 ,待凝固后 ,取已
消毒过的圆形滤纸(￠6mm)蘸取多糖溶液 ,略干后
贴于培养基平板上 ,同时做一溶剂空白对照 。置恒
温培养箱中培养(细菌 36 ～ 37℃, 18 ～ 24 h;真菌 28
～ 30℃, 48 ～ 72h)后分别观察结果 ,测量抑菌圈宽
度的大小。以上步骤均为无菌操作 ,每个样品设 2
平行样 ,结果求平均值 。
2 　结果
2.1 　新疆雪莲粗多糖提取　新疆雪莲经水提醇沉
后得粗多糖 XL,为灰白粉末状固体 ,溶于水 ,不溶于
乙醇 、乙醚等有机溶剂 。
2.2 　新疆雪莲水溶性多糖的分离纯化　XL经酶
法和 Sevage法联合脱蛋白得初步纯化多糖 XL′,经
干燥后为棕黄色粉末状固体 ,得率为 61.00%。 XL′
经酸性乙醇分级得到三个组分:pH为 2.5的 95%
乙醇至醇浓度达 30%沉淀得 XL1;至醇浓度达 50%
沉淀得 XL2;至醇浓度达 70%以上沉淀得 XL3。
将 XL3上 DEAE-SephadexA-25柱 ,收集 28 ～ 38
管部分 ,乙醇沉淀 ,真空干燥后得多糖 XL31。见图
1。
图 1　多糖 XL31的 DEAE-SephdexA25柱层析谱图
　　XL31经 SephroseCL-4B(1.5 cm×90 cm)柱层
析 ,苯酚-硫酸法检测得一单一对称峰 。醋酸纤维薄
膜电泳呈单一谱带 。纸层析呈单一斑点 。说明它是
分子量均一的纯多糖。见图 2。
图 2　多糖 XL31的 SephroseCL-4B柱层析谱
　　用紫外分光光度法测定蛋白分布 ,结果显示无
蛋白吸收峰。说明 XL31为不含蛋白质的多糖。
2.3　清除自由基活性测定
2.3.1　XL31对· OH的清除作用:采用不同浓度的
新疆雪莲多糖 XL31 ,按照 1.5.1项方法进行 · OH
清除率的测定 ,结果见图 3。结果表明 , XL31对· OH
具有清除作用 ,而且在实验模拟的浓度范围内与浓
度正相关 。XL31在糖浓度为 0.5mg/ml以上时清除
率均高于 30%。说明只有达到一定浓度时 ,新疆雪
莲多糖才具有对 · OH的清除作用。糖浓度在 1.5
～ 2 mg/ml之间 ,清除作用变化不显著 ,清除率达到
68%。本实验采用的自由基模型体系所产生 · OH
自由基浓度远大于体内该自由基的浓度 〔15、16〕 ,体外
实验表明新疆雪莲多糖是良好的 · OH自由基清除
剂。
·102· 中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 1期 2008年 1月
图 3　XL31对羟自由基的清除作用
图 4　XL
31
对超氧阴离子的清除作用
2.3.2　XL31对 O-2 ·的清除作用:采用不同浓度的
新疆雪莲多糖 XL31 ,按照 1.5.2项方法进行O-2 ·清
除率测定 ,结果见图 4。结果表明 , XL31对O-2 ·都具
有很强的清除效果 ,而且在实验模拟的浓度范围内
与浓度相关 。多糖 XL31的清除作用均高于 30%,当
浓度达 0.1 mg/ml时 ,清除率达 70%以上。本实验
采用的自由基模型体系所产生 O-2 ·自由基浓度远
大于体内该自由基的浓度 〔15、17〕 ,体外实验表明新疆
雪莲多糖是良好的 O-2 ·自由基清除剂。
2.3.3　XL31对 R·的清除作用:采用不同浓度的
新疆雪莲多糖 XL31 ,按照 1.5.3项方法进行 R·清
除率测定 ,结果 XL31对 R·几乎无清除效果 ,而且还
有使 R·增多的趋势 。原因可能是在产生 R·的系
统中 ,多糖分子在自由基引发剂存在的条件下发生
了自动氧化 ,产生了新的自由基 ,它清除的 R·达到
了平衡 。因此 ,多糖的浓度越低 ,多糖分子和自由基
引发剂反应的几率越小 ,清除 R·的效果越好 〔17〕。
2.4 　多糖抗菌活性
2.4.1　XL31最低抑菌浓度确定:由表 1可知 ,多糖
浓度为 7.5mg/ml是最低抑菌测试浓度。真菌无最
低抑菌浓度 ,故认为雪莲多糖对真菌无抑制作用。
2.4.2　多糖抗菌活性:从表 2中可知 ,多糖 XL31对
E.c、S.a、B.s均有一定作用 ,对三种细菌的作用大
小趋势为 E.c>S.a>B.s。多糖 XL31对同一细菌的
作用随糖浓度的增加而增强 。当 XL31浓度达 30
mg/ml时 ,对 E.c和 B.s的作用最为显著 。
　表 1 　XL31最低抑菌浓度确定表
菌种
细菌
E.c S.a B.s
真菌
A.n P.c
最低抑菌浓度(mg/ml) 3 5 6　 - -
　　注:E.c———大肠杆菌　S.a———金黄色葡萄球菌　B.s———枯草
杆菌　A.n———黑曲霉　P.c———产黄曲霉 ,下同。 “ -”表示为检测
不到最低抑菌浓度
　表 2 　多糖 XL
31
抗菌活
糖样 浓度(mg/ml)
抑菌圈(mm)
细菌
E.c S.a B.s
XL31 7.5 9.2 8.8 8.4
XL31 15 9.6 9.2 9.0
XL31 30 10.0 9.6 9.8
3　讨论
本实验通过对新疆雪莲多糖进行粗多糖的提
取 ,进一步分离纯化得纯化多糖 XL31 ,并对 XL31进
行抗菌实验及清除自由基活性研究。抗菌实验表明
多糖 XL31对细菌有较强作用 ,对真菌无作用。清除
自由基活性实验模拟产生 · OH、O-2 ·和 R·的 3
个体系 ,其浓度远大于体内这 3种自由基的浓度。
结果发现 ,新疆雪莲多糖 XL31对 O-2 ·和 · OH都具
有明显的清除作用 ,且与浓度正相关;但对 R·几乎
无清除效果。上述结果表明 ,新疆雪莲多糖是一种
清除自由基的良好抗氧化剂 。氧自由基与机体衰老
有很密切的关系 ,故新疆雪莲水溶性多糖可作为抗
衰老保健品或药物在临床上使用 ,但还有待体内实
验进一步证实 。
参 考 文 献
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(2007-06-11收稿)
薄荷非挥发性提取部位的药理活性研究
彭蕴茹 ,钱士辉 ,石　磊 ,罗宇慧
(江苏省中医药研究院 、江苏省现代中药制剂工程技术研究中心 ,江苏南京 210028)
　　摘要　目的:观察薄荷非挥发性提取部位的不同药理活性。方法:以 D-氨基半乳糖造成小鼠急性肝损伤模型 ,
以血清 AST、ALT水平为指标 , 观察薄荷不同提取部位的保肝作用。检测不同时段大鼠胆汁流量 , 观察不同提取部
位对大鼠胆汁分泌的影响。采用体内接种肿瘤 , 观察不同提取部位对小鼠肉瘤 S180及 Lewis肺癌的抑制作用。结
果:薄荷石油醚提取部位有明显的保肝利胆功效 , 而水提部位有一定的抗肿瘤作用。 结论:薄荷非挥发性提取部位
有明显的药理作用 , 且不同提取部位有不同的活性。
关键词　薄荷;非挥发性提取部位;保肝利胆;抗肿瘤
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)01-0104-04
基金项目:国家十五重大科技专项资助项目(编号:2001BA701A62-03);江苏省公益专项资助项目(编号:BM2004525)
　　薄荷为唇形科植物薄荷 MenthahaplocalyxBriq.
的干燥地上部分 ,为我国常用传统中药。薄荷中除
含挥发油外 ,还有黄酮类 、鞣质 、有机酸及香豆精类
等成分 。薄荷中挥发油类成分为其用途最广的成
分 ,广泛用于医药 、日用化工及食品工业中 。目前 ,
在薄荷药材的使用上 ,往往在提取挥发油后即将其
残余药材丢弃 ,这在很大程度上造成了严重浪费 ,不
利于对此药材资源的综合利用。而且 ,目前对薄荷
的基础研究基本上局限于挥发性活性成分的药理及
化学研究 ,而对于其提取挥发油后的茎叶中尚含有
的非挥发性成分的化学成分及药理作用则极少有研
究报道 。据文献报道 ,薄荷中的非发性成分含有丰
富的黄酮类 、三萜酸 、有机酸及鞣质等成分 ,且除挥
发油外的其他成分也具有广泛的药理活性 〔1 ～ 5〕。本
文即是在此基础上 ,先提取薄荷中挥发油类成分 ,再
将残留药材按不同极性溶剂萃取 ,对其不同提取部
位的药理活性进行了筛选 ,以期发现其新的活性成
分及新的药理作用 。这对于今后深入研究和综合开
发利用薄荷药材资源具有一定意义 ,现将结果报道
如下 。
1　材料
1.1　动物　昆明种小鼠 , SD大鼠 ,清洁级 ,购于上
海斯莱克实验动物有限责任公司 ,合格证号:SCXK
(沪)2002-0010。 C57BL/6小鼠 ,雌雄各半 ,清洁级 ,
购于扬州大学比较医学中心 ,合格证号:SCXK(苏)
2002-0009。
1.2　动物饲养环境　清洁级 ,合格证号:SYXK
(苏)2002-0007。
·104· 中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 1期 2008年 1月