全 文 ：第9卷第 4期
1 9 9 2年1 1月
新通大学学报( 自然科学版)
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19 9 2
新疆紫草外植体诱导愈伤组织研究 ’
计巧灵 苟 萍 王卫国
(新获大学生物系 ) (新祖农科院徽生物研究所 )
摘 要
以新扭紫草 ( A rn eb l’a e u c h or m a ( R卿 le ) oJ h sn ot n )幼叶 、 子叶和胚轴作为外植体 ,诱导产生
了愈伤组织 . 幼叶和子叶在 M S B + N A A O . 4 p p m + 2 . 4一 D O . Z p p m + 6一 B A O . 6 p p m 的琼
脂培养基上脱分化双果好 ,愈伤组织为白色半透明状 ,胚轴在 L S + N A A o . 4 P m + IA A I . SP m +
K T 2
.
Op pm 的琼脂培养基上脱分化较合适 ,愈伤组织为红 、 白两种颜色 . 平均脱分化率为 68 . 7% . 这
些愈伤组织有紧密型和松散型两种形态 ,扫描电镜观察了紧密型白色愈伤组织的表面结构 ,可看到
愈伤组织表面有许多突起的胚性细胞团 ,在继代培养过程中 ,多数这种愈伤组织能够再分化 ,形成胚
. 芽 ,
关键词 新珊紫草 ,组织培养 ,胚性愈伤组织
中图分类号 Q 9 4 6· 3 3
紫草是一种中草药 ,在我国中医和新疆民族医药中应用历史悠久 . 近年来 , 随着医药卫生
事业的发展和对紫草药用价值研究的深入 ,紫草的应用越来越广 ,它不仅具有清热凉血 、解毒
透疹 、抗菌消炎作用 ,而且具有抗肿瘤 、抗早孕等作用 l[ ’ , 是一种很有价值的药材 . 在儿种紫草
中 ,新疆紫草经国内外临床应用认为质量最好 aj[ ,其有效成份含量比其他紫草高 3 ~ 6倍以上 sj[
. 新疆紫草主要分布在新疆 ,仅新疆每年就有近百吨紫草远销内地及出口国外 .
紫草药用部分是 3~ 5年生长的根 . 近十年来 , 随着人们无计划地挖掘 , 资源短缺日益严重 .
为此 , 我们进行了新疆紫草组织培养方面的研究 , 以期从这个角度探索其快速繁殖的路子 , 使
新疆紫草资源短缺问题得以缓解 . 本文报导了新疆紫草外植体诱导愈伤组织及愈伤组织生长
情况 ’ -
1 材料和方法
新疆紫草植株及其种子分别于 1 9 9 0年 。月中旬和 8月中旬采 自新疆伊犁地区海拔 2 3 0 0m
左右的高山阳坡上 . 经新疆大学生物系鉴定为新疆紫草 ( A二 eb 她 eu hc or m a( R卿 l。 ) oJ h sn t;o ` .)
采用新疆紫草白色幼叶 、成叶叶段 、幼根段 、根茎段 (根剥去栓皮 )及种子萌发的幼芽子 叶
和胚轴作为外植体 . 成叶叶段 、幼根段和根茎段长约 0 . sc m ,幼叶长约。 . sc m ,分批取材处理 . 第
一批材料经下列四种方法灭菌处理 : 1 70 % lA 。 ( 乙醇 )旦二些二5%安替福民旦二1互二无菌水洗四
次 ; 1 70 % A I。 互全1鱿1。%漂白粉液 l坠丝二无菌水洗四次 ; 。 70 % lA 。 全二丝二0 . 1%升汞竺叉
无菌水洗五 、 六次 ; vI o . 1%升汞液浸没 4~ 6m in ,无菌水洗五 、 六次 . 处理完毕 ,无菌下将外植
体切小 (长约。 . sc m ) . 切除原伤 口 ,接种在 M S 固体培养基 (不加激素 )上 , 2 ~ 26 ℃黑暗培养 ,
介 本文于 19 9 1年 12 月30 日收到 , 为国家自然科学荃金资助项目
第 4期 新疆紫草外植体诱导愈伤组织研究
观察其灭菌情况 .选定适合不同外植体灭菌的最佳方法 ,对第二批材料进行灭菌处理 、切割 ,接
种在诱导培养基上 ,诱使其脱分化 ,产生愈伤组织 . 紫草种子先剥去外种皮 ,经方法 I 灭菌处理
后 ,接种在无激素的 M S 培养基上 ,使之萌发 ,待芽长至 k m 长时 ,切下子叶 ,将子叶 、胚轴接种
在诱导培养基上 . 诱导培养基设计了20 种 ,基本培养基为 M S B 和 L S ,激素组合有 10 种形式 , 见
表 1 .
表 1 诱导培并基激素组合 激素浓度 : p p m
组合号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0
IA A 0 0 0 0 0 0 0 0 1
.
5 1
.
5
N A A 0
.
4 0
.
4 0
.
4 0
.
4 0
,
4 0
.
4 0 0 0
.
4 0
.
4
2
.
4一D 0 . 2 0 . 2 0 . 2 0 . 2 0 , 2 0 。 2 0 . 3 0 , 3 0 0
6一BA 0 . 4 0 . 6 0 . 8 0 0 0 0 . 6 0 0 . 4 0
K T 0 0 0 1
.
5 2
.
0 2
.
5 0 2
.
0 0 2
.
0
培养基含 3%蔗糖 , p H 为 5 . 8~ 6 . 0 ,并以 0 . 6% 的琼脂固化 ,在 2 一 26 ℃下暗培养 , 10 天后
开始统计结果 , 5天统计一次 , 一个半月后 , 比较统计结果 . 选定脱分化快 、产愈伤组织好的培养
基作为基础 ,设计继代培养基 ,将愈伤组织继代培养 ,使其大量增殖 . 继代培养基设计了两种 : I
M S B + N A A O
.
4p p m + 2
.
4 一 D o . Zp p m + 6一 B A O, s p p m + 谷氨酸胺 s o p p m ; 1 L S + N A A o .
4P p m + I A A I
.
s p p m 十 K T I . SP p m , 将胚轴产生的愈伤细胞团大部分转入 I 号继代培养基 , 少
部分转人 I 号继代培养基 ,将其余愈伤细胞团大部分转入 I 号培养基 ,少部分转入 I 号培养
基 . 培养基及培养条件同前 , 5天统计一次生长情况 , 5。夭后汇总结果 , 比较愈伤组织生长情况
继续继代 、见光 , 胚性愈伤再分化产生了胚芽 .
扫描电镜样品制备按徐是雄「` ,的方法 . 用 SJ M一 25 CX I 型扫描电镜进行扫描观察并拍照
2 结果与讨论
2
.
1 无菌培养物的建立
各种外植体经不同方法灭菌处理后 ,效果差异很大 . 幼叶 、成叶叶段经方法 皿处理后效果
最好 , 材料不变色、 不萎蔫 、灭菌较彻底 . 而经方法 I 、 I 处理后 ,叶片常会变褐 、 萎蔫 ,以后逐渐
死亡 , 说明紫草叶片对安替福民和漂白粉溶液中的氯气很敏感 . 幼根段和根茎段用方法 N 处理
效果最好 , 由于根的木栓形成层外细胞层数少 , 乙醇很快渗入 , 使具有分生能力的形成层细胞
丧失活力 . 种胚用方法 I 处理 ,操作简便 ,效果很好 .
2
.
2 愈伤组织的诱导
新疆紫草外植体在上述不同的诱导培养基上脱分化情况差异很大 ,不同的外植体对基本
培养基和激素组合要求不同 ,尤其植物激素是脱分化的关键因素 . 见表 .2
由表 2可见 , 子叶 、胚轴和幼叶比较容易脱分化 , 愈伤组织的诱导率平均在 68 % . 其次是根
茎段 , 由于它是很多基生。卜生长的部位 ,故有一定的分生能力 . 成叶叶段和幼根段愈伤组织诱
导率最低 ,成叶叶段产愈伤团的主要是叶基部位 .
幼叶和子叶脱分化需多种有机元素 ,而胚轴却相反 ,单一有机元素脱分化效果好 , 种类多
反而不太好 ,胚轴接触培养基的部位易发黑 .
新班大学学报 (自然科学版 ) 1 9 92年
农2 愈伤组织的诱导情况
外植体 愈伤组织的诱导 最佳诱导培养荃 ’
来谭 择种 产愈伤块数 诱导率 (% )
块数
幼叶 0 42 6 52 . 5M s B+ 2号激家组合
成叶叶段 52 8 1 5。 4M s B十 7号激素组合
子叶 48 3 57 2 . 9M S B十 2号激素组合
胚轴 2 417 7 0 。 8 L S十 2或10 号激素组合
幼根段 32 2 6. 2 L s + 1 0号激家组合
根茎段 2 6 6 2 3。 1 L + S3号激素组合
, 以产愈伤率最高的为主 .
从产生的愈伤细胞团颜色来看 ,幼叶 、子叶产生的是白色 、 半透明状的 ,而胚轴产生的是白 ,
和红两种颜色的 ,特别是在 L S十 10 号激素组合的培养基上 , 以红色愈伤团为主 .
从脱分化部位来看 ,首先是伤口处易脱分化 ,产生愈伤团 ,随后叶变厚 ,表面凹凸不平 , 胚
轴逐渐变粗 ,表皮撑破 ,组织愈伤化 . 待愈伤团长至黄豆粒大时 ,切下 ,进行继代培养 .
.2 3 愈伤组织的继代生长 :
大部分胚轴愈伤团在 I 号继代培养基上生长较快 ,在生长过程中 ,红色愈伤团上又出现
一些白色愈伤团 ,镶嵌成一个整体 (见图 2) . 红色愈伤组织有两种形态 ,一种为小球状 ,细胞排
列紧密 ,如图 2所示 ,这种愈伤组织生长很快 ,生命力强 . 另一种为小颗粒状 ,细胞排列松散 , 比
前一种透明 ,这种愈伤组织增殖较慢 ,易褐化死亡 . 在 I 号继代培养基上生长的胚轴愈伤团也
能增殖 , 但接触培养基的部位常易发黑 .
叶愈伤团在 I 号继代培养基上生长很快 , 五十天后 ,体积增大很多倍 ,相邻的组织体互相
拥挤 ,连成一大块 ,如图 3 、 4所示 . 但组织形态有差异 , 即使是在同一个培养瓶中也有两种形态
的愈伤组织 ,一种是细胞排列松散 、 半透明的块状结构 (见图 3) . 这种组织体一般只增殖而无再
分化现象 . 另一种是细胞排列紧密 、 稍透明的小球状结构 (见图 4 ) ,这种小球状愈伤在生长过程
中常出现再分化现象 ,根据韩碧文 〔 , 〕关于胚状体发生的理论 ,通过扫描电镜观察 , 我们认为这
是一种胚性愈伤 ,扫描电镜下可见在愈伤组织表层有许多突起的胚性细胞团 (见图 5) . 将这种
胚性愈伤继代 ,光照下培养三周之后 ,可见到其表面长大的胚芽 (如图 6、 7所示 ) . 那么在同一种
培养基及培养条件下 , 甚至在同一块愈伤组织上 ,为什么有些细胞增殖形成了胚性愈伤 , 而有
些细胞增殖后却形成了非胚性愈伤 ?我们推测这与细胞分裂的不均等性及细胞的内源激素水
平等因素有关 .
对新疆紫草不同外植体脱分化及愈伤组织生长情况的研究 ,为这种植物的快速繁殖研究
奠定了基础 .
图 , 版 说 明
1 由种胚萌发的胚芽
2 由胚轴来源的愈伤组织 , 白箭头示红色紧密型愈伤团 ,黑箭头示红色愈伤团中长出的白色愈伤团
3 叶来源的愈伤组织 ,示细胞排列疏松
4 叶来源的愈伤组织 ,黑箭头示细胞排列紧密 、 呈团状的胚性愈伤
5 扫描电镜照片 :星号示在愈伤组织表面突起的胚性细胞团 X 50
6
、
7示由胚性细胞团再分化形成的胚芽 x 6
第4期 新疆紫草外植体诱导愈伤组织研究
1 0 0 新班大学学报 (自然科学版) 1 9 9 2年
参 考 文 _献
1 高菊红 . 紫草的资源 、 化学 、 药理和临床研究概况 . 中草药 , 19 86 ; 17 ( 6 ) : 28 ~ 31
2 韩碧文 . 胚状体发生的细胞学和生理生化研究 . 植物学通报 , 1 9 89 , 6 ( 1 ) : 1~ 4
3 李忠良 ,梁国英 . 三种紫草的质 t 比较 . 中药通报 , 19 82 . 2 : 9一 10
4 徐是雄 . 荔枝雌雄花器官发育过程的扫描电镜观察 . 植物学报 , 1 9 9。 , 3 2 ( 12 ) . 9 05 ~ 908
: 中厕 医学科拳院药物研究所主编 . 中药志 ,第一册 . 北京 :人民卫生出版社 , 19 7 9 , 5 6 9~ 576
S T U D Y O N T H E C A L L U S W E R E I N D U C E D F R O M
S E G M E N T S O F A
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o , 11: : e 11: p r o je e t i n g i n s u r f a e e o f t h e e a l l、 、 e a n b e s e e n
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T h e m a io r i t y o f t h e s e e a l l i e a n f o r m
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