全 文 ：新疆天山雪莲组培快繁技术的建立
赵海清 ,王晓军 (中国科学院新疆理化技术研究所 ,新疆乌鲁木齐 830011)
摘要 [目的]探讨新疆天山雪莲组培快繁技术。[方法]以新疆雪莲切除根部的无菌苗 ,或无菌苗的真叶 , 或者直接采集野生的新疆雪
莲幼嫩部位作外植体 ,进行愈伤组织诱导培养及丛生芽分化、丛生芽增殖继代培养、生根培养和组培苗移栽试验。[结果]新疆天山雪莲
外植体在MS+NAA 2mg/L+6-BA0.5mg/L和MS+6-BA 1.0+NAA0.1mg/L +2 ,4-D0.1mg/L培养基上可诱导产生大量的丛生芽;在MS
+ 6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0mg/L和MS+6-BA 0.5mg/ L+NAA 0.01mg/ L培养基上交替培养 ,丛生芽继代快速增殖率达 1.0∶3.5;组培苗
在MS+NAA 0.2mg/L培养基上诱导生根 ,生根率达 83%;生根的雪莲组培苗经炼苗和移栽后成活 ,生长健壮。[结论] 该研究建立的快
繁技术为雪莲野生资源保护和产业化发展开拓了一条有效途径。
关键词 新疆雪莲;组织培养;快速繁殖
中图分类号 S 567.23+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)07-02743-02
Establishment of Rapid Propagation Technique in Tissue Culture of Saussurea involucrata Kar.et Kir.from Tianshan Mountain
ZHAO Hai-qing et al (Xinjiang Institute of Physical and Chemical Technique , ChineseAcademy of Sciences , Urumchi , Xinjiang 830011)
Abstract [Objective] The aim was to discuss the rapid propagation technique in tissue culture of Saussurea involucrata Kar.et Kir.from Tianshan
mountain.[ Method] With aseptic seedlings excised root part , their leaves of S.involucrata or the tender parts of wild S.involucrata collected directly
as explants , the callus induction culture , clustered bud differentiation and proliferation subculture, rooting culture and transplant experiment of tissue-cul-
tured seedlings were conducted.[ Result] On the mediaMS+NAA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L andMS+6-BA 1.0+NAA 0.1mg/L +2 ,4-D0.1mg/L ,
the explants of S .involucrata from Tianshan mountain could be induced to generate plentiful clustered buds.In the alternate cultures on the mediaMS+
6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0mg/ L and MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.01 mg/L, the rapid proliferation ratio of clustered bud subculture reached 1.0∶
3.5.The tissue-cultured seedlings were induced to take root on the medium MS+NAA 0.2 mg/L and the rooting rate reached 83%.The rooted tissue
culture seedlings of S.involucrata could survive after domestication and transplant and grow healthily.[ Conclusion] This rapid propagation technique set
up in the study developed an effective approach for the protection and industrialized development of wild S.involucrata resources.
Key words Saussurea involucrata Kar.et Kir.;Tissue culture;Rapid propagation
作者简介 赵海清(1975-),男 ,新疆乌鲁木齐人 ,助理研究员 , 从事
生物化学方面的研究。
收稿日期 2007-09-03
雪莲(Saussurea spp.)为菊科凤毛菊属 5～ 8年生草本植
物 ,是我国典型的高山植物 ,具有重要的药用价值。独特的
生长环境和生理特性孕育出雪莲独特的药效。据中医文献
记载 ,雪莲性温 ,味微苦 ,入肝 、脾 、肾三经[ 1-2] ,具有散寒除
湿 、活血通经 、强筋助阳 、抗炎镇痛 、收缩子宫等功效。民间
常用雪莲治疗风湿性关节炎 、妇女宫寒腹痛 、月经不调 、胎衣
不下 、麻疹不透 、肺寒咳嗽 、阳萎 、高山不适症 、雪盲等病[ 3] 。
近年来 ,雪莲作为民族药和民间药在抗炎镇痛 、抗早孕 、抗衰
老及抑制癌细胞增生方面的作用备受关注[ 4] 。雪莲花原生
植物种类较多 ,其中新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et
Kir.)的品质最佳[ 5-7] 。该类药材主要含有黄酮类 、生物碱 、
内酯甾醇 、多糖及挥发油等化学成分 ,其中主要的次生代谢
物是黄酮及黄酮苷类。近年来 ,野生雪莲因过度采挖 、繁殖
困难 、生长缓慢 ,已被列为国家 3级濒危物种[ 8] 。雪莲生长
缓慢 ,从种子发芽到开花结果约需 5年时间 。雪莲种子萌发
率低 ,采用传统的播种方法进行大规模人工栽培存在困难。
应用植物组织培养方法大规模人工繁育雪莲 ,可以不受季节
和气候的限制 ,从而加快繁殖速度 ,快速扩大种质资源。为
此 ,笔者对新疆天山雪莲组培快繁技术进行了研究 ,以期为
新疆天山雪莲产业化发展开拓一条有效途径。
1 材料与方法
1.1 培养条件 共有 6种培养基:①MS+2 mg/L NAA+0.5
mg/L 6-BA用于诱导愈伤;②MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L
NAA+0.1mg/L 2 ,4-D;③MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA
用于诱导丛生芽;④MS+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA;⑤
MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA用于丛生芽增殖;⑥MS
+0.2mg/L NAA用于生根培养。以上培养基中均加入 0.5%
琼脂 、3%蔗糖 ,pH值调至 5.85 ,培养间温度 25 ～ 26 ℃,光照
时间 12 ～ 14 h/d ,光强 2 500 ～ 3 000 lx ,环境湿度 60%～
70%[ 9] 。
1.2 处理方法 选取颗粒饱满的成熟雪莲种子并放入烧杯
中 ,加适量饮用纯净水 ,滴入 2滴吐温 80 ,浸泡 24 h后 ,进行
灭菌处理。先用 75%酒精浸泡 30 s , 15%H2O2 浸泡 40 min ,
无菌水冲洗 3～ 4次 ,最后用无菌水浸泡 10 min。最后 ,将种
子接种到无激素 1/2MS基本培养基中 。
选取野生新疆雪莲的幼嫩部位(幼嫩叶片和幼嫩茎尖)
作为外植体 ,进行灭菌处理 。先用 75%酒精浸泡 30 s , 0.1%
HgCl2 浸泡 10min ,无菌水冲洗 3～ 4次 ,最后用无菌水浸泡 10
min。切取幼嫩部位(0.5 cm2)接种于装有培养基①的罐头瓶
中诱导愈伤。
2 结果与分析
2.1 种子消毒培养无菌苗生长情况 在无激素 1/2MS基本
培养基中 ,约 5 d种子开始萌发 ,23 d后萌发率达 75%,30 ～
40 d得到带有 2 ～ 4片真叶的无菌小苗。切取真叶(0.5 cm2)
接种于装有培养基②的罐头瓶中 ,进行芽的诱导。在MS+
1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.1mg/L 2 ,4-D上进行初代
培养 ,30～ 35 d后转接到MS+1.0mg/L 6-BA+0.01mg/L 2 , 4-
D上继续培养 , 30 d后可以得到大量的丛芽。切除雪莲无菌
苗的根部接种于装有培养基③的罐头瓶中 ,进行丛生芽的诱
导;25 d后转接到培养基④,可以得到大量的丛芽。
2.2 愈伤繁殖 由表 1可知 ,用 1.8 L生物反应器培养雪莲
愈伤时 ,3%接种量比较合适 ,可以短期内得到大量雪莲愈伤
(图 1A)。
2.3 芽的继代快速繁殖 将雪莲丛生芽转接至MS+0.5
mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA 和MS +0.5 mg/L 6-BA+0.01
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008 , 36(7):2743-2744, 2746 责任编辑 刘月娟 责任校对 马君叶
mg/L NAA继代培养 , 2种培养基交替使用 ,使其快速增殖 ,20
～25 d转接 1次。继代培养时每瓶 4～ 5丛 ,每丛 3个芽 ,随
机抽取 5瓶。
表 1 愈伤繁殖统计结果
Table 1 Results of callus propagation
编号
No.
培养天数
Culture days
d
接种量
Inoculation amount
%
生物量增加倍数
Increased multiple
of biomass
1 20 2.0 4.30
2 20 2.5 4.60
3 20 3.0 6.78
4 20 3.5 3.00
5 20 4.0 2.63
6 20 5.0 1.50
从表 2可以看出 ,5瓶苗共有 23丛 ,共计 243棵苗 ,平均
11棵/丛 , 继代培养增殖率可达 1.0∶3.5(图 1B、1C)。
2.4 生根 雪莲组培苗剥单苗接种于培养基生根(图 1D)。
表2 继代培养第25天雪莲丛生芽发生情况
Table 2 The cluster buds of Saussurea spp.subcultured for 25 d
序号
No.
第1丛
1st
cluster
第 2丛
2nd
cluster
第 3丛
3rd
cluster
第 4丛
4th
cluster
第 5丛
5th
cluster
每瓶总苗数
Total plantlets
per flask
第1瓶 3 7 10 6 26
1 st flask
第2瓶 8 11 15 13 6 53
2nd flask
第3瓶 16 11 17 9 13 66
3rd f lask
第4瓶 20 13 9 12 7 61
4th flask
第5瓶 13 9 11 4 37
5th flask
注:A.生物反应器繁殖愈伤;B.诱导丛生芽;C.继代培养;D.生根;E.温室炼苗;F.移栽天山 3年后部分开始开花。
Note: A.callus propagation in bioreactor;B.induction of cluster buds;C.subculure;D.rooting;E.hardening-plantlets in greenhouse;F.some plants bloomed 3
years after transplanted to Taishan Mountain.
图 1 新疆天山雪莲组培快繁的不同阶段图谱
Fig.5 Pictures of tissue culture and rapid propagation of Saussurea spp.
生根结果见表 3。雪莲组培苗平均生根率达 83%。
表3 雪莲组培苗生根情况
Table 3 Rooting of Saussurea spp.tissue culture plantlets
次数
Times
苗总数
Total plantlets
生根苗数
Rooted plantlets
生根率
Rooting rate∥%
1 1 045 837 80
2 3 425 2 817 82
3 958 817 85
4 5 095 4 261 84
5 1 448 1 203 83
6 2 860 2 423 85
7 1 331 1 116 84
2.5 炼苗 、移栽 将已经生根的雪莲组培苗移栽到温室苗
床 ,苗床上铺有山土 ,山土表面铺 4～ 5 cm厚洗干净的蛭石或
珍珠岩 ,种植密度为 300 ～ 400株/m2。炼苗第 1周要覆盖塑
料薄膜;第 2周逐渐增加透气 ,以便使组培苗尽快适应外部
环境;第 3周取掉塑料薄膜 ,室温保持在 25 ～ 30 ℃(图 1E)。
炼苗 40 ～ 50 d 就可以移栽 ,上天山时间以 6月中旬为
好 ,上山后可以生长 3个月 ,以便幼苗越冬 ,第 2年返青率
高。移栽 3年后部分天山雪莲开始开花 ,见图 1F 。
3 结论与讨论
(1)在雪莲组培苗继代培养的过程中 ,发现长期在MS+
2 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA培养基上丛生继代繁殖会造成
分裂素积累现象 ,主要表现在继代组培苗生长缓慢 、死亡 、黄
叶 、黑根等不良现象。这给后期生根移栽带来不便。当出现
这种情况时 ,要适当调节培养基的激素配比 ,以便在出苗时
得到适宜生根的优良组培苗。为了使雪莲组培苗能够连续
多次继代培养繁殖 ,笔者进行了激素调节。MS+0.5 mg/L
BA+2.0 mg/L NAA和MS+0.5 mg/L BA+0.01 mg/L NAA交
替使用 ,可得到令人满意效果。
(下转第 2746页)
2744 安徽农业科学 2008年
PUC18。应用目标片段的引物 ,以白色菌落为模板 ,能够扩增
到目标片段(1 400 bp)的条带(图 3),条带清晰且没有基因组 、
图 1 转化细菌的蓝白斑筛选结果
Fig.1 The screening results of transformed bacteria by blue-white
spot assay
图 2 白斑细菌提取质粒
Fig.2 Plasmid fromwhite spot bacteria
注:1-质粒;2-阴性对照;3 ,4-目标片段。
Note:1-plasmid;2-negative control;3 ,4-target fragments.
图 3 质粒PCR鉴定结果
Fig.3 PCR amplification results of plasmid
RNA污染 ,表明这 2种方法获得的白色菌斑为带有目标片段
的阳性菌斑。
3 小结与讨论
电穿孔技术是一种转化方法 ,转化效率可以高达 109 ～
1010 cfu/μg。然而很多实验室没有电穿孔技术所需要的特殊
仪器。自 20世纪 70年代早期科恩成功利用氯化钙法将质粒
重组进入大肠杆菌的细胞内开始[ 4] ,大肠杆菌感受态细胞转
化质粒的系统一直被广泛应用。然而常规的CaCl2 溶液制备
感受态细胞方法繁琐 ,对试剂纯度和试验用器皿洁净度要求
很高 ,但是转化效率低 ,感受态细胞不易保存 ,通常现用现制
备。目前也有商品化的感受态细胞制备试剂盒 ,但价格比较
贵。而该改进方法制备感受态细胞操作简便 ,转化效率可高
达 105 ～ 106 ,并且-70 ℃保存可达 1年。该方法是适于实验
室操作的高效感受态细胞制备方法 。
运用该方法进行感受态的制作过程中 ,一个关键的因素
就是大肠杆菌的细胞密度 OD600值应为 0.3～ 0.4。若离心后
出现很多黑色沉淀 ,即细菌碎片 ,则表明有多量细菌死亡 ,此
时细菌状态不好 ,但若只有少量黑色沉淀或对转化效率要求
不高 ,亦可继续进行。吴海燕等对不同转速下 OD600值达到
0.3 ～ 0.4所需的时间段进行研究 ,认为转速为 220 r/min时
所需的时间段为 2.85～ 3.35 h[ 5] 。影响转化效率的另一个重
要的因素是CaCl2 浓度。一般认为 , 50～ 100 mmol/L CaCl2 都
能使用。但涂知明等认为以 75 mmol/L CaCl2 溶于TB溶液中
为佳[ 6] 。该研究加入 50mmol/L CaCl2-15%甘油混合溶液后
转化效率比常规方法提高了 30倍左右。造成这一结果的机
理仍有待进一步研究。
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(上接第 2744页)
(2)在雪莲组培苗规模化生产过程中 ,组培苗生根显得
尤为重要。生根率将直接影响到下一步炼苗的成活率 ,最
终影响组培苗成本 。生根前 2代可以将雪莲组培苗继代培
养在空白的MS培养基上 ,经过 40～ 50 d的培养 ,可以释放
积累的激素 ,有利于生根 ,提高根的质量 ,最终提高成活率。
(3)用烧开的自来水代替蒸馏水 ,用琼脂条代替琼脂粉
可以大大降低成本 ,而且培养效果不受影响 。
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