全 文 ：植 物 学 报 1 9 9 2 , 3 4 ( 1 2 ) : 9 6 2一 9 6 4
人 e t a B o t朋 i e a S i n 亡e 。
新疆紫草愈伤组织超低温保存 *
李国风 叶和春 董教望 简令成 孙尤华 顾利民
(中国科学院植物研究所 , J匕京 一0 0 0 4 4 )
关键词 新疆紫草 ;愈伤组织 ;超低温保护剂 ;超低温保存
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近年来在国内 、 外对离体培养的植物组织和细胞的超低温保存 , 已 有不少报道艺, 离.5, , ,
但至今尚未见新疆紫草 ( A ; cn ib 。 。 “ hc ; 。 。 。 ) 愈伤组织超低温保存的报道 。 我 们 在 研
究新疆紫草大规模细胞培养 , 成功地建立了两步培养系统和高产细胞系筛选的基础上 ,开
展了离体培养新疆紫草愈伤组织超低温种质保存的研究 。 试图探索新疆紫草无性高产纽
胞系原种保存的方法 ,这对新疆紫草工业性发酵培养具有重要的意义 。
本文于 1 9 9 1 年 2 月收到 , 同年 5 月收到修改稿 。
. 国家 “ 七五 ” 攻关项目
一z 期 李国凤等 : 新疆紫草愈伤组织超低温保存
材 料 与 方 法
采用新疆紫草种子苗的子叶为外植体诱导出的愈伤组织 , 在 改良的 L S 培 养基 上 ,
25 ℃ 暗培养 。 以培养 10 天和 15 天的愈伤组织进行超低温保存处理 。
采用两种冰冻保护剂 : ( 1 ) 10 多 二甲亚矾 ( D M s O ) + 0 . , m ol ZL 山梨醇 ; ( 2) 7 . 5外
D M S O 十 5外 甘油 + 5% 蔗糖 。 将挑选的愈伤组织放入试管内 , 在冰浴条件下加入预冷
的保护剂 , 密封试管 , 继续在冰浴中停留 巧 分钟左右 , 经过保护剂处理的愈伤组织 , 以
l℃ /分钟的冷却 速 度 , 从 。℃ 降 低 到 一 40 ℃ , 在 一 40 ℃ 停 留 2 小 时 后 投 人 液 氮 罐
( 一 1 9 6℃ ) 贮存 18 天后 , 将处理的愈伤组织用 40 ℃ 温水浴快速化冻 , 并以消毒过的培养
液彻底洗条后接种 于继代培养基上 ,在 25 ℃ 温度下暗培养 。
将处哩后恢复生长的和未经处理的愈伤组织 , 每隔 , 天取样 (每次 8 瓶 ) ,称愈伤组织
鲜重 , 经 60 ℃ 烘干至恒重 , 以取样 7 次的平均鲜重和干重 , 绘制出生长曲线 。
同工酶分析采用聚丙烯酞胺凝胶电泳法 〔2 , , 酉旨酶染色用 L un d vk i s : 方法 〔6〕 , 过氧 化物
酶染色用 s ca n d a h os 方法 s1[ ,同工酶谱以 C S 一 9 10 双波长薄层层析仪扫描 。
结 果 与 讨 论
在新疆紫草愈伤组织超低温保存研究中 ,我们采用了两个时期 ,两种不同配方 的保护
剂 , 结果表明 , 用 2 号保护剂处理继代 10 天的愈伤组织 , 经过超低温保存后取出继代培养
几代 , 长出的愈伤组织生长良好 。 此结果 (图 l) 与玉米愈伤组织超低温保存中所 采用的
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川日曰2 号保护剂处理的结果是一致的 , 即 D M S O
十甘油十蔗糖配方的保护剂对新疆紫草愈伤
组织是适宜的 。 选择继代 10 天的愈伤组 织
作为处埋低温时期也是可行的 ,这与廿蔗 、 玉
米愈伤组织超低温保存结果一致 「` · ” 。
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处理 T r e a l m e n .
过氧化物酶 同工酶扫描 图 ( C S一 9 10 薄
层层析扫描仪 )
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. 处理 B . 对 照
图 1 经超 低温处理 和未处理 的愈伤组织生长的 比较 iF g
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人 . T r e a t e d s P e e i m e n B . C o n t r o l
(一 ) 过氧化物酶和酩酶同工酶分析
对经超低温处理后恢复生长的愈伤组织与未经处理的愈伤组织 , 采用聚丙烯酸胺凝
胶 电泳 , 进行醋酶 、 过氧化物酶同工酶分析 ,从 电泳扫描图谱可见 ,处理的和对照的同工酶
6 94 植 物 学 报 34卷
未发生明显的变化 ( 图 2 、 3 ), 但经处理的愈伤组织的酶带染色较深 , 表明酶活性较高 ,在
玉米超低温保存中也观察到类似的情况 〔1] 。
(二 ) 超低温处理的愈伤组织和未经处理的愈伤组织生长速率的比较
从经超派温处理的愈伤组织和未经处理 的愈伤组织的生长曲线 (图 4 ) 表明 , 它们有
大体相似的一条 s 型生长曲线 。 但经
过超低温处理的愈伤组织 与 对 照 比
较生 长较慢 , 生长量少些 。 这与 aB i a j
( 19 7的 41[ 曾观察到的胡萝 卜和烟草细
胞经低温和超 低温处 理 后 生 长延 后
3一 8 周的情况相类似 。 经过 多 次 继
代培养后 ,可逐步恢复正常生 一长。
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酣酶同工酗扫描图 ( C -s 9 10
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图 4 超 低温对愈伤组织生长速率 的影响
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. 鲜重 ;对照 2 .鲜重 , 处理 3 .干重 , 对照 4 . 干重 ,处理
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D r y w e i g h t
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C o n t r o l 4
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D r y w e i g h t
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上述结果表明 , 经过超低温处理后的愈伤组织 , 生长虽然受到一些抑制 , 但是可 以恢
复正常生长 。 醋酶和过氧化物同工酶酶 潜也未发生显著变化 。 因此 , 可以认为本实验结
果为新疆紫草种质保存提供了可能性 。
参 考 文 献
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孙龙华 、 简令成 、 曹孜义 , 19 8 :9 玉米愈伤组织超低温保存的研究 。 植物学通报 , :6 30 一 3 20
莽克强 、 徐乃正 、 方荣祥 , 1 9 7卜 聚丙烯酞胺凝胶电泳 。 科学 出版社 ,北京 , 们 页 。
简令成 、孙德兰 、 孙龙华 , 19 8 :7 甘蔗愈伤组织超低温保存中一些因素的研究 。 植物学报 , 29 : 1 23 一 13 1。
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