全 文 ：172
云南牛肝菌的内生真菌分离、鉴定
和 ITS序列特征研究
岳万松1，熊 勇1，2，陈毅坚1，2，*
(1.云南民族大学化学与生物技术学院，云南昆明 650500;
2.国家民委—教育部共建民族药资源化学重点实验室，云南昆明 650500)
摘 要:以云南产 4 种牛肝菌:小美牛肝菌［Boletus speciosus Frost］、铜色牛肝菌［Boletus aereus］、黄皮疣柄牛肝菌
［Leccinum crocipodium］、美味牛肝菌(白牛肝)［Boletus edulis］新鲜子实体为材料，经无菌技术分离子实体内部组织培
养，从中获得 5 株内生真菌，其中 YX1－6 分离于黄皮疣柄牛肝菌、YX1－7 分离于美味牛肝菌、QJ3－6 分离于铜色牛肝
菌、QJ3－7 分离于美味牛肝菌、QJ3－8 分离于华丽牛肝菌。根据菌株的形态特征和 ITS序列分析对 5 株菌进行鉴定，结
果表明:YX1－6 为毛栓菌(Trametes hirsuta)，YX1 － 7 为金色毛壳菌(Chaetomium aureum)，QJ3 － 6 为假丝酵母属
(Candida sp.)，QJ3－7 为被孢霉属(Mortierella sp.)，QJ3－8 为散囊菌属真菌(Eurotium sp.)。经 ITS rＲNA二级结构辅助
分析可看出，所获的牛肝菌内生真菌差异较大，揭示了云南野生牛肝菌内生真菌的多样性特征。
关键词:牛肝菌，内生真菌，ITS序列，序列分析
Isolation and identification of endophytic fungi from different Boletus
in Yunnan and ITS region sequence analysis
YUE Wan－song1，XIONG Yong1，2，CHEN Yi－jian1，2，*
(1.School of Chemistry and Bio－technology，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650500，China;
2.Key Lab of National Medicine Supported Jointly by State Ethnic Affairs Commission
and Ministry of Education，Kunming 650500，China)
Abstract:Five strains of fungal endophytes，named YX1－6，YX1－7，QJ3－6，QJ3－7，QJ3－8，were isolated from four
spieces of Boletus specious Frost，Boletus aereus，Leccinum crocipodium，Boletus edulis which were collected in
Yuxi and Qujing areas of Yunnan Province.The morphyological characters of the strains were observed，and their
ITS sequences were amplified and sequenced.Phylogenetic tree was constructed by the obtained molecular data.
The results showed that YX1－6 was Trametes hirsuta.，YX1－7 was Chaetomium aureum.，QJ3－6 was Candida sp.，
QJ3－7 was Mortierella sp.，QJ3 －8 was Eurotium sp..The secondary structure of ITS rＲNA in these five strains
predicted with the softwares of DNA STAＲ，ＲNAVIZ2.0. and MEGA5.1 indicated that fungal endophytes from
Boletaceae were different and diversified.
Key words:boletus;endophytic fungi;ITS sequence;sequence analysis
中图分类号:TS255.1 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2014)19－0172－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2014． 19． 028
收稿日期:2014－01－13
作者简介:岳万松(1990－)，男，硕士研究生，研究方向:生物技术专业。
* 通讯作者:陈毅坚(1966－)，女，博士，教授，研究方向:民族药资源
开发和利用。
基金项目:云南民族大学教育部民委共建重点实验室开放基金项目
(MZY1104);云南省生物技术实验示范中心建设项目(0205
－2001015209);云南民族大学生物技术核心教学团队项目
(0205－02010008)。
牛肝菌科(Boletaceae)是担子菌亚门伞菌目的重
要一科。云南是野生食用菌的王国，目前已知牛肝
菌有 224 种，食用菌 144 种，分别占全国总数的 62%
和 72%。牛肝菌含有多糖、生物碱、甾醇类化合物、
酸类化合物等活性物质，可用于治疗腰腿疼痛、手足
麻木、四肢抽搐等疾病，还具有抗流感病毒、防治感
冒的作用［1］。在云南产量多、味道鲜美、又具经济价
值的有 4 种:小美牛肝菌(地方名见手青)［Boletus
speciosus Frost］、铜色牛肝菌(地方名黑牛肝)［Boletus
aereus］、黄皮疣柄牛肝菌(地方名黄牛肝、黄癞头)
［Leccinum crocipodium］、美味牛肝菌(地方名白牛肝)
［Boletus edulis］［2］。至今，牛肝菌除个别种据报道在
实验室条件下栽培成功［3－6］，绝大多数种类尚不能通
过人工栽培形成子实体［7－8］。目前有关野生食用牛
肝菌的研究主要集中在其营养成分分析［9－10］和化学
成分分析［11－12］，此外，多篇文献［13－15］对牛肝菌活性物
质多糖的免疫、抗肿瘤及抗氧化作用进行了研究
173
分析。
内生真菌定殖于健康的生物组织内，种类繁多，
分布广泛［16］。近年来，内生真菌的代谢产物的研究
倍受关注，大量具有抗菌、抗癌、杀虫等活性的次生
代谢产物从内生真菌中分离出来［17－19］，内生真菌已经
成为开发活性物质资源库。目前国内外对大型真菌
的内生真菌方面的研究甚少，仍需进一步研究。本
文以产自云南的牛肝菌不同种为材料，分离、纯化其
内生真菌并进行形态特征研究，再结合 rDNA ITS 序
列分析进行分子鉴定，确定内生菌株的种属归类，旨
在为牛肝菌内生真菌资源的开发利用提供研究基础
资料。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
牛肝菌 实验用新鲜牛肝菌子实体小美牛肝菌
(地方名见手青)、铜色牛肝菌(地方名黑牛肝)、黄皮
疣柄牛肝菌(地方名黄牛肝、黄癞头)、美味牛肝菌
(地方名白牛肝)，均于 2013 年 8～9 月分别购自云南
省玉溪市和曲靖市集贸市场，新鲜子实体用保鲜袋包
装带回实验室，24h 内完成内生真菌的分离;引物
ITS4、ITS5 和 DNA MarKer 北京博迈德生物;2 ×
Power Taq PCＲ MasterMix 北京百泰克;分离培养基
配制根据参考文献［20］完成;固体培养基Ⅱ KH2PO4
0.5g，MgSO4 0.25g，酒石酸铵 1g，麦芽糖 0.25g，维生素
B1 0.5mL(40μg /L)，葡萄糖 10g，琼脂粉 10g，蒸馏水
500mL(pH6.0)，121℃，灭菌 20min后备用;液体培养
基Ⅱ 配方同上，勿加琼脂粉。
Eppedorf 5331 PCＲ仪 德国;GENE GENIUS 凝
胶成像系统 美国;DYY－GB 电泳仪、DYCP－31DN
电泳槽 北京六一。
1.2 实验方法
1.2.1 牛肝菌内生真菌的分离纯化培养 取新鲜的
牛肝菌子实体，自来水冲洗数次，去除表面杂质，无
菌水冲洗 3 遍，75%乙醇漂洗 3min，再用无菌水冲洗
3～5 次。用无菌解剖刀将牛肝菌子实体的表皮去掉，
将内部的组织切割成 0.5cm左右的小块，接种于培养
基中，28℃恒温培养 5～7d。待组织小块周围有内生
真菌长出后，挑取少许菌丝培养物，纯化培养后，部
分转接至固体培养基Ⅱ斜面上保存备用;另一部分
转接至液体培养基Ⅱ里(培养条件为:150r /min，28℃
恒温培养 3～4d)，每 12h 观察菌种生长情况，最后用
无菌滤纸过滤得到菌丝体，存于－70℃冰箱里待用。
1.2.2 牛肝菌内生真菌菌落特征和显微特征观
察 将分离纯化得到的牛肝菌内生真菌菌株于培养
基Ⅱ平板上三点种植和插片培养 5～7d，菌落长出后
用于观察，插片置于显微镜下观察显微形态特征，对
菌株进行初步鉴定。
1.2.3 牛肝菌内生真菌分子鉴定
1.2.3.1 DNA提取 将分离的牛肝菌内生真菌液体
培养获得的菌丝体用于提取 DNA，总 DNA提取方法
参照 CTAB－SDS 法［21－22］并加以改良，用琼脂糖凝胶
电泳检测样品 DNA质量。
1.2.3.2 PCＲ 扩增、测序 ITS 通用引物(ITS4:
TCCTCCGCTTATTGATATGC; ITS5:GGAAGTAAAA
GTCGTA－ACAAGG)［23］，50μL 反应体系包括:25μL
2 × Power Taq PCＲ Mixture，引物各 2μL，5μL DNA模
板，16μL ddH2O;反应条件:预变性 94℃ 5min，94℃
30s，52℃ 30s，72℃ 30s，35 次循环，72℃ 10min，4℃
保存。扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，采用
Bio－Ｒad凝胶成像系统观察结果。
1.2.3.3 PCＲ产物的纯化、测序及系统发育树的构建
PCＲ产物用多功能 DNA 纯化回收试剂盒回收，送
昆明硕阳科技有限公司测序。测序结果 DNAMAN
进行拼接，MEGA 5.13 分析相关数据，构建发育树，
同时将得到的序列提交 GenBank 数据库，并通过在
线 Blast工具从 NCBI下载 GenBank等数据库内已知
同源序列多条作为参考序列，用 MEGA 5.13 中的
Kimura－ 2 － parameter(K2P)模型，邻接(neighbor －
joining method，N－ J)法构建聚类图。并应用 DNA
STAＲ和 ＲNAVIZ2.0 预测其二级结构。
2 结果与分析
2.1 牛肝菌内生真菌的形态特征
从 4种新鲜牛肝菌子实体内部组织块中分离培养
获得 5 株内生真菌纯菌株，编号为 YX1－6、YX1－7、
QJ3－6、QJ3－7、QJ3－8，5 株内生真菌的菌落特征和显
微特征见图 1，特征描述记录和初步鉴定结果见表 1
(鉴定结果参考中国科学院微生物研究所编写的《常
见与常用真菌》完成［24］)
图 1 牛肝菌内生真菌 YX1－6、YX1－7、QJ3－6、
QJ3－7、QJ3－8 在培养基Ⅱ上的生长特征
Fig.1 Morphology and hyphal structure of YX1－6，YX1－7，
QJ3－6，QJ3－7 and QJ3－8 isolated from boletus
注:A、B、C、D、E 分别为菌株 YX1－6、YX1－7、QJ3－6、
QJ3－7、QJ3－8 在培养基Ⅱ上的菌落特征;a、b、c、d、e 分
别为菌株 YX1 － 6(× 400)、YX1 － 7(× 400)、QJ3 － 6
(× 400)、QJ3－7(× 400)、QJ3－8(× 400)在培养基Ⅱ上
的菌丝显微特征。
2.2 不同牛肝菌内生真菌菌株 ITS 序列 PCＲ 扩增
结果
分离获得的牛肝菌 5 株内生真菌的 PCＲ扩增结
果见图 2。
从图 2 可见，5 株菌序列长度约在 430～630bp 之
间，PCＲ产物均出现比 Marker 清晰明显的条带，说明
实验所提的 DNA质量较好。
2.3 牛肝菌内生真菌 rDNA ITS 序列 NJ 树构建及
分析
分离到的内生真菌分成 5 组:YX1－6、YX1－7、
QJ3－6、QJ3－7 和 QJ3－8 分别各为 1 组，做序列相似
174
表 1 牛肝菌内生真菌特征记录和初步鉴定结果
Table 1 The preliminary identification results endophytic fungi from boletus
菌株编号 采集地 分离材料 菌落特征 显微特征 鉴定结果
YX1－6 玉溪市易门县
黄皮疣柄牛肝
(Leccinum crocipodium)
菌落絮状，白色，渐变为
粉红色，辐射状，边缘
规则。
菌丝透明，分枝多，有
隔，分生孢子多，卵形，
透明
毛栓菌属
(Trametes sp.)
YX1－7 玉溪市易门县
美味牛肝菌
(Blotus edulis)
菌落絮状，浅白色，渐变
为淡红色或粉色渗出
物，匍匐生长，边缘淡褐
色，反面红褐色。
菌丝发达，透明，有隔，
交织，分枝多，孢子圆形
或卵形
金色毛壳菌属
(Chaetomium sp.)
QJ3－6 曲靖市麒麟区
铜色牛肝菌
(Boletus aereus)
菌落絮状，白色，后期产
生淡黄色渗出物，匍匐
生长，菌落反面呈褐色。
有大量假菌丝，其上面
带有芽生孢子或轮生而
分枝的或成短链的芽生
孢子
假丝酵母属
(Candida sp.)
QJ3－7 曲靖市麒麟区
美味牛肝菌
(Blotus edulis)
菌落絮状，较小，白色;
菌丝辐射状整齐排列，
细且长。
菌丝分枝，透明，无隔，
孢子囊顶生，球形或椭
圆形，有时在菌丝短侧
枝顶端也会形成单生分
生孢子
被孢霉属
(Mortierella sp.)
QJ3－8 曲靖市马龙县
华丽牛肝菌
(Blotus magnificus)
菌落生长缓慢，较小菌
落亮黄色渐变为黄褐
色，略带皱纹，具有硫黄
色小粒。
菌丝有隔，分生孢子梗
为淡黄色，椭圆形或椭
圆形
散囊菌属
(Eurotium sp.)
图 2 5 株牛肝菌内生真菌菌株 ITS－PCＲ扩增电泳图
Fig.2 Amplification profile of electrophoretogram
ITS－PCＲ of 5 strains of boletus endophyte
注:M:标准 DNA Marker DL 2000;1:YX1－6;2:YX1－7;
3:QJ3－6;4:QJ3－7;5:QJ3－8。
性比对并构建系统发育树以 NCBI 中的 ITS 序列为
聚类外群，采用 N－J 法对不同牛肝菌内生真菌进行
分析并构建遗传关系树，自举检测 1000 次。所构建
的系统树见(图 3)。
通过在线 BLAST工具从 NCBI 数据库内下载已
知的多条相似序列作为参考序列，比较它们的相似
性，并用 MEGA 5.13 中的 Kimura－2－parameter(K2P)
模型，邻接(neighbor－joining method，N－J)法构建发
育树(见图 3)，NJ 发育树分析结果表明:YX1－6 与
NCBI数据库里的多株 Trametes hirsuta形成自检支持
率为 99%的一个分支，它们亲缘关系较近，且 BLAST
比对结果显示:YX1－6 与 Trametes hirsuta 相似性都
很高，为 99%，鉴定为毛栓菌(Trametes hirsuta)。NJ
发育树分析结果表明:YX1－7 与 NCBI 库里的多株
Chaetomium aureum形成自检支持率为 99%的一个
大分支，二者亲缘关系很近，且 BLAST 比对结果显
示:YX1－7 与多株 Chaetomium aureum 相似性较高，
为 99%，鉴定为金色毛壳菌(Chaetomium aureum)。
NJ发育树分析结果表明:QJ3－6 菌株与 Candida sp
(DQ104728)、Candida sp(KF057545)、Candida sp
(KF057544)等假丝酵母属菌株形成自检支持率为
100%的一个分支，它们的亲缘关系较近，且 BLAST
比对结果显示:QJ3－6 菌株与多株 Candida sp相似性
高达 99%，鉴定为假丝酵母属真菌(Candida sp)。NJ
发育树分析结果表明:QJ3－7 菌株与多株 Mortierella
sp形成自检支持率为 100%的一个分支，亲缘关系较
近，且 BLAST 比对结果显示:QJ3 － 7 菌株与
Mortierella sp(KC180749)相似性高达 100%，鉴定为
被孢霉属菌株。NJ发育树分析结果表明:菌株 QJ3－8
与 Eurotium amstelodami多株菌株形成自检支持率为
96%的一个分支，亲缘关系较近，且 BLAST比对结果
显示:QJ3 － 8 与 Eurotium amstelodami(AF455470)、
Eurotium amstelodami(HQ728257)和 Eurotium rubrum
(AF455528)等多株散囊菌属菌株的的相似性都高达
100%，鉴定为散囊属真菌。
2.4 牛肝菌内生真菌及其 NCBI 数据库相似种 ITS
rＲNA二级结构比较
利用 DNA STAＲ和 ＲNAVIZ2.0 预测并比较牛肝
菌内生真菌及其 NCBI数据库相似种的二级结构，牛
肝菌内生真菌及其 NCBI 数据库相似种编号分别为
YX1 － 6 和 Trametes hirsuta(JN048768、YX1 － 7 和
Chaetomium aureum(HQ607894)、QJ3 －6 和 Candida
sp(DQ104728)、Mortierella sp(FJ810149)、Eurotium
amstelodami(HQ728257)，5 株牛肝菌内生真菌及其
175
图 3 根据 rDNA ITS基因序列构建的牛肝菌内生真菌与参考类群间的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of boletus endophyte based on rDNA ITS and reference taxa
表 2 牛肝菌内生真菌及其 NCBI数据库相似种 ITS rＲNA二级结构比较
Table 2 Contrast and analysis of ITS ribosomal ＲNA secondary structure of
boletus endophyte and their similar species in NCBI database
菌株及其相似种编号 相同点 不同点 鉴定结果
YX1 － 6 和 Trametes
hirsuta(JN048768)
二者都有一大中心环，且各螺
旋区长度、大小、茎环数目基
本相同
菌株 XY1－6 在二级结构的 5端(即开
始端)多出一个螺旋区，总共 10 个螺
旋区
毛栓菌
(Trametes hirsuta)
YX1 － 7 和 Chaetomium
aureum(HQ607894)
二者都有一个大中心环，且各
螺旋区长度、大小、茎环数目
基本相同
菌株 XY1－7 ITS 序列 5端比后者多出
13 个碱基;其 ITS rＲNA 结构 5端比后
者多出一个螺旋区，总共 11 个螺旋区
金色毛壳菌
(Chaetomium aureum)
QJ3 － 6 和 Candida sp
(DQ104728)
二者总体结构大致相似，均由
一中心环及多个螺旋区构成
QJ3－6 菌株在其 ITS rＲNA 二级结构在
3端多出一螺旋区，总共 7 个螺旋区，且
二者在 5端形成的螺旋区也不尽相同
假丝酵母属真菌
(Candida sp.)
QJ3－7 和 Mortierella sp
(FJ810149)
二者有一个中心环及多个螺
旋区构成，每个螺旋上又有或
多或少的大小不一的茎、环结
构，且茎环数目相同
QJ3－ 7 菌株的 5端开始序列为 5 －
UCUUAACUGACU，3 端为 3 － AAACU
AUA;后者 5端为 5 － CUGCG，3端为
3－AACUAUA
被孢霉属真菌
(Mortierella sp.)
QJ3 － 8 和 Eurotium
amstelodami
(HQ728257)
二者有一个中心环及多个螺
旋区构成，每个螺旋上又有或
多或少的大小不一的茎、环结
构，且茎环数目相同
菌株 QJ3 － 8 的 5端开始序列为 5 －
AACGUAACAA，3端为 3－AUACUAUA;
后者 5端为 5 － CGUAACAA，3端为
3－ACUAUA
散囊菌属真菌
(Eurotium sp.)
NCBI数据库相似种 ITS rＲNA 二级结构异同点见
表 2。
3 结论和讨论
本文的实验研究，从云南牛肝菌 4 个种的新鲜
子实体中分得 5 株内生真菌，用经典分类方法和分
子生物学方法鉴定为:YX1 － 6 为毛栓菌(Trametes
hirsuta)，YX1 － 7 为 金 色 毛 壳 菌 (Chaetomium
aureum)，QJ3－6 为假丝酵母属真菌(Candida sp.) ，
QJ3－7 为被孢霉属真菌(Mortierella sp.)，QJ3－8 为散
囊菌属真菌(Eurotium sp.)，从分类结果可见不同种
的牛肝菌的内生真菌也不同，显示了内生真菌的多
样性特征。
进一步用 DNA STAＲ和 ＲNAVIZ2.0 分析软件预
测了它们的二级结构，用于分析研究其分类地位。
分析结果显示各分离菌株及其相似种的 ITS 序列二
级结构均为一个中心环及多个螺旋区构成，每个螺
旋上又有或多或少的大小不一的茎、环结构，说明牛
肝菌内生真菌既具有结构上的共性，又具有鲜明的
个性差异。
真菌种类繁多，形态复杂，因此需要采用形态、
结构、生理生化等表型方面的特征和各种分子生物
学手段进行分类鉴定。该论文对牛肝菌内生真菌的
176
分类鉴定，在形态结构和分子水平上都进行了研究，
所得结果一致并可相互印证，可见对内生真菌分类
研究，采用综合性手段的必要性和可靠性。
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