全 文 ：　　　 　　　 　　　第 28卷第 3期Vol.28, No.3 　 　 西 华 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )JournalofXihuaUniversity· NaturalScience 　 　
2009年 5月
May.2009
文章编号:1673-159X(2009)03-0076-03
　　收稿日期:2008-09-01
　　作者简介:李燕平(1984-),女,四川自贡人 ,硕士研究生 ,主要研究方向为食品生物技术。
　　通讯作者:袁永俊 ,男 ,博士 ,教授。电话:028-87711997, E-mail:yyja9791@sina.com。
苯酚 -硫酸法测定牛肝菌多糖含量
李燕平 ,袁永俊 ,张黎明 ,徐梦虬
(西华大学生物工程学院 ,四川 成都 610039)
摘　要:苯酚-硫酸法是测定多糖的常用方法 , 影响该法显色的因素较多 , 对不同多糖物质 , 其最佳显色条件不
同。本试验研究了显色时间 、显色温度 、苯酚及硫酸用量对牛肝菌多糖含量测定的影响。在此基础上 ,采用正交试
验设计法确定牛肝菌多糖的最佳显色条件为:显色时间 25min、显色温度 70 ℃、5%的苯酚 1.2 mL及硫酸 8.0mL。
关键词:牛肝菌;多糖;苯酚-硫酸法;含量测定;显色条件
　　中图分类号:TS207.3 　　文献标识码:A
DeterminationoftheContentsofPolysaccharidesinBoletusby
Phenol-sulfuricAcidMethod
LIYan-ping, YUANYong-jun, ZHANGLi-ming, XUMeng-qiu
(SchoolofBioengineeringofXihuaUniversity, Chengdu610039 China)
Abstract:Phenol-sulfuricacidmethodiscommonlyusedformeasuringpolysaccharide.However, manyfactorsaffectthecolored
conditionsanddifferenttypesofpolysaccharideshavediferentcoloredconditions.Inthistest, colorimetricmethodforthedetermina-
tionofpolysaccharidesinboletuswasemployedbymeansofphenol-sulfuricacid.Theauthorsinvestigatedtheinfluenceofdiferent
time, temperature, diferentcontentsofphenolandsulfuricacidonthecontentstestofpolysaccharide.Furthermore, orthogonalexperi-
mentswerecarriedouttoconfirmtheoptimalconditions, whicharetime:25min, temperature:70℃, phenol:1.2mLandsulfuricacid:
8.0mL.
Keywords:boletus;polysaccharide;phenol-sulfuricacidmethod;contentdetermination;coloredcondition
　　近年来我国对多糖的研究进展很快 ,多糖具有
多方面的生物活性和功能 ,如能增强机体免疫功能
及抗癌等多方面的作用[ 1] 。文献报道 [ 2] ,美味牛肝
菌多糖对机体中枢免疫器官胸腺利脾的增长 ,以及
淋巴细胞的增长 ,均有明显的免疫功能和促进作用 ,
另外还具有抗衰老的功效 。
测定多糖含量广泛采用苯酚-硫酸比色法 [ 3] ,但
影响该法显色的因素较多 ,且对不同的多糖物质 ,其
检测的最佳显色条件不同 [ 4] 。目前 ,未见用苯酚 -硫
酸法测定牛肝菌多糖含量的报道。本试验以巴山美
味牛肝菌作为测定样品 ,采用正交设计 L9(34)优化
显色条件 ,研究苯酚 -硫酸法测定牛肝菌多糖含量 ,
得到最佳显色条件 ,对于牛肝菌多糖提取工艺的优
化评价具有重要意义 。
1　仪器 、材料与方法
1.1　仪器与材料
UV-2600紫外可见分光光度计 ,尤尼柯 (上
海)仪器有限公司;苯酚(A.R.)、硫酸(A.R.)、葡
萄糖(A.R.)、乙醇(A.R.),均为科龙化工试剂厂
生产;巴山美味牛肝菌 ,市售。
1.2　实验方法
1.2.1　牛肝菌多糖的提取
参考文献 [ 5]对多糖的提取方法:称取牛肝菌
粉末 0.2 g,用 80%乙醇 100 mL回流提取 1 h,过
滤 ,菌粉用 80%乙醇洗涤(10mL×3),以去除单糖 、
双糖 、低聚糖等干扰性成分 [ 6] 。菌粉连同滤纸置于
烧瓶中 ,用 100mL水加热提取 1 h,过滤 ,菌粉用热
水洗涤(10 mL×3),洗液并入滤液 ,将滤液移入 250
第 3期 李燕平 等:苯酚-硫酸法测定牛肝菌多糖含量 　　　
mL容量瓶中 ,稀释至刻度 ,备用 。
1.2.2　测定方法
精密吸取多糖溶液 0.8 mL置于 10 mL干燥比
色管中 ,加入 5%的苯酚 1.2 mL,混匀 ,迅速滴加浓
硫酸 8 mL,即刻摇匀 ,于 70 ℃水浴中加热 25 min,
采用流水冷却后于 486 nm处比色测吸光值。
1.2.3　牛肝菌多糖含量的计算
据文献报道[ 6] ,采用苯酚-硫酸法测定多糖时 ,
大部分以葡萄糖作为标准品 ,并证实是可行的 。本
试验也采用葡萄糖作为测定多糖的标准品 ,根据得
到的葡萄糖浓度 C、样品质量 W样和样品液的稀释
因素 D计算多糖含量(%), 见下式:多糖含量 =
CD/W样 ×100%。
2　结果与分析
2.1　显色条件的选择
2.1.1　最大吸收波长的选择
吸取一定标准葡萄糖溶液和牛肝菌多糖溶液按测
定方法分别显色 ,全波长扫描 ,扫描图谱见图 1和图 2。
由图 1和图 2看出 ,牛肝菌多糖经苯酚-硫酸法显色后 ,
其最大吸收峰为 486nm,与葡萄糖基本相同 ,所以测定
牛肝菌多糖含量时使用的吸收波长为 486nm。
图 1　牛肝菌多糖的吸收光谱
图 2　葡萄糖的吸收光谱
2.1.2　显色温度的影响
吸取多糖溶液 0.8mL于 10mL干燥比色管中 ,
加入 5%的苯酚 1.0 mL,混匀 ,迅速滴加浓硫酸 5
mL,即刻摇匀 ,于不同温度水浴中加热 15 min,采用
流水冷却 ,再加水至刻度 ,于 486 nm处测定吸光值 ,
见表 1。温度越高 ,越利于反应充分 ,吸光值越大 ,
故选择温度 100 ℃为宜。
表 1　不同显色温度下的吸光值
温度 /(℃) 40 60 80 100
吸光值 0.056 0.059 0.066 0.070
2.1.3　显色时间的影响
改变加热时间 ,置沸水浴中加热 ,其他条件同
2.1.2,测定吸光值 , 结果见表 2。由表 2可知 , 在
10min到 60 min显色较稳定 ,可见时间对显色的影
响不大 , 20 min吸光值达到最大 ,故显色时间选择
20min为宜 。
表 2　不同显色时间的吸光值
时间 /min 10 20 30 40 50 60
吸光值 0.065 0.074 0.071 0.068 0.066 0.066
2.1.4　苯酚用量的影响
改变苯酚用量 ,置沸水浴中加热 20min,其他条
件同 2.1.2,测定吸光值 ,结果见表 3。由表 3可知 ,
当苯酚用量达到 1.0 mL后 ,吸光度变化相对较小 ,
故选择 1.0 mL为宜 。
表 3　不同苯酚用量时的吸光值
苯酚用量 /mL 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2
吸光值 0.042 0.068 0.078 0.076 0.077 0.075
2.1.5　硫酸用量的影响
改变硫酸用量 ,加入 5%的苯酚 1.0mL,至沸水
浴中加热 20 min,其他条件同 2.1.2,测定吸光值 ,
结果见表 4。由表 4可知 ,随着硫酸用量增大 ,其吸
光值也越大 ,故选择 8.0mL为宜。
表 4　不同硫酸用量时的吸光值
硫酸用量 /mL 2 4 6 8
吸光值 0.004 0.024 0.136 0.203
2.1.6　最佳显色条件的选择
在单因素试验的基础上 ,采用正交试验优选最
佳显色条件 ,因素与水平见表 5,试验结果及方差分
析见表 6、表 7。
表 5　L9(34)正交设计表
因素
A
显色时间
/min
B
显色温度
/(℃)
C
5%的苯酚
/mL
D
浓硫酸
/mL
1 15 40 0.8 6
2 20 70 1.0 7
3 25 100 1.2 8
77
　　　 西华大学学报·自然科学版 2009年
表 6　正交试验结果分析
试验号 A B C D 试验结果第一次 第二次 第三次 合计∑yi
1 1 1 1 1 0.143 0.154 0.116 0.413
2 1 2 2 2 0.193 0.191 0.190 0.574
3 1 3 3 3 0.186 0.181 0.195 0.562
4 2 1 2 3 0.199 0.183 0.200 0.582
5 2 2 3 1 0.148 0.167 0.166 0.481
6 2 3 1 2 0.161 0.167 0.173 0.501
7 3 1 3 2 0.211 0.204 0.199 0.614
8 3 2 1 3 0.198 0.184 0.196 0.578
9 3 3 2 1 0.126 0.126 0.125 0.377
∑(1) 1.549 1.609 1.492 1.271
∑(2) 1.564 1.633 1.533 1.689
∑(3) 1.569 1.440 1.657 1.722
k1 =∑(1)/9 0.172 0.179 0.166 0.141
k2 =∑(2)/9 0.1737 0.181 0.170 0.188
k3 =∑(3)/9 0.1743 0.160 0.184 0.191
极差 R 0.0023 0.021 0.018 0.050
表 7　方差分析表
方差来源 偏差平方和 自由度 均方 F F临界值 显著性
A 0.00003 2 0.00002 0.22 F0.1(2, 18)=2.62
B 0.00246 2 0.00123 13.67 F0.05(2, 18)=3.55 ＊＊＊
C 0.00164 2 0.00082 9.11 F0.01(2, 18)=6.01 ＊＊＊
D 0.01405 2 0.00703 78.11 　 ＊＊＊
误差 Se 0.00154 18 0.00009
总和 ST 0.01972 26
　　由试验结果表 6可知 , 4个因素对吸光值的影
响程度依次为 D>B>C>A, 最佳水平组合为
A3B2C3D3 ,即显色时间 25min、显色温度 70℃、5%
的苯酚 1.2mL以及浓硫酸 8.0mL。由方差分析结
果(见表 7)表明 ,温度 、苯酚用量及硫酸用量对牛肝
菌多糖显色都有非常显著性影响 ,而显色时间对其
无显著影响 。
2.2　标准曲线的绘制
精密称取已干燥至恒重的无水葡萄糖 100 mg
置 100mL容量瓶中 ,加水稀释至刻度 ,摇匀 。再吸
取该标准溶液 10mL于 100mL容量瓶中 ,加水稀释
至刻度 ,摇匀 , 该标准葡萄糖溶液浓度为 0.1 mg/
mL。精密吸取 0.1 mg/mL标准葡萄糖溶液 0.1、
0.2、0.4、0.6、0.8mL,分别置于 10mL比色管 ,各加
水使体积为 0.8 mL,再各加 5%的苯酚 1.2 mL,摇
匀 ,迅速滴加浓硫酸 8.0 mL,摇匀 ,于 70 ℃水浴中
加热 25min,采用流水冷却后于 486nm处比色测吸
光值。另取 0.8mL水 ,同上操作加苯酚 、硫酸进行
显色反应 ,作为空白对照。以吸光值为纵坐标 ,以葡
萄糖浓度为横坐标 ,求得标准曲线回归方程为:y=
0.6917 x-0.0019,相关系数 R2为 0.9994,表明在
所试验的 0.1 ～ 0.8 mg/100 mL范围内呈良好线性
关系 ,结果见图 3。
图 3　葡萄糖标准曲线
2.3　测定牛肝菌多糖含量
将牛肝菌粉末按方法 1.2和 1.3进行提取和测
定 ,求得牛肝菌多糖含量为 3.52±0.15%。
3　结论
苯酚 -硫酸法的显色原理是多糖或寡糖被硫酸
水解成单糖 ,并迅速脱水生成糠醛衍生物 ,该衍生物
再与苯酚络合成有色物质。经试验发现此有色物质
在 486nm处和一定浓度范围 ,其吸收值与糖浓度呈
线性关系 ,从而可用比色法测定多糖 (下转 84页)
78
　　　 西华大学学报·自然科学版 2009年
　　单位体积粗集料的含量 G取集料堆积密度的
0.98倍 。于是初步得到骨胶比为 3.5 ～ 5.0之间 ,
试验可取三个水平为 4.0, 4.5, 5.0。
3　正交试验数据处理
3.1　正交试验表
选定 3因素 、3水平建立正交表(见表 2)。
表 2　正交试验表
w/c G/c r/mm Rh/MPa K2 K1 /(mm/s)
0.28 4.0 6.0～ 10.0 待测 待测 待测
0.28 4.5 10.0 ～ 15.0 待测 待测 待测
0.28 5.0 15.0 ～ 20.0 待测 待测 待测
0.31 4.0 10.0 ～ 15.0 待测 待测 待测
0.31 4.5 15.0 ～ 20.0 待测 待测 待测
0.31 5.0 6.0～ 10.0 待测 待测 待测
0.34 4.0 15.0 ～ 20.0 待测 待测 待测
0.34 4.5 6.0～ 10.0 待测 待测 待测
0.34 5.0 10.0 ～ 15.0 待测 待测 待测
3.2　正交试验数据处理
在建立的正交试验表基础上按上述要求测试出
试件规定的 K1 、K2 、Rh值后 ,对试件的 K1 、K2 、Rh进
行极差分析 ,并根据极差分析结果确定最优的配合
比方案 。然后进行 K1 、K2 、Rh的方差分析 ,根据方差
大小利用 F检验确定各因素的显著性;或由正交试
验的结果利用求解超定方程的方法 ,分别对 K1、K2 、
Rh进行线性回归分析 ,由线性回归分析各函数的系
数大小和正负 ,即可判断各因素的显著性 (包括影
响大小和性质)。
4　结论
根据相似原理的正交试验方法 ,提出了基于骨
料粒径 、骨胶比 、水灰比对透水混凝土的抗压强度 、
透水系数和空隙率的影响;根据试验数据分别采用
极差分析和方差分析 ,或根据正交试验的结果利用
求解超定方程和进行线性回归分析的方法 ,确定各
因素的显著性 。该方法也适合于研究多正因素 、不
同性质和目的混凝土的最佳配合比 ,为实际工程中
对混凝土的设计和施工提供理论和实验依据 。
参　考　文　献
[ 1] 蒋正武 ,孙振平 ,王培铭.若干因素对多孔透水混凝土性能
的影响 [ J] .建筑材料学报 , 2005, 8(5):513-519.
[ 2]张朝辉 ,王沁芳 ,杨江金,等.透水混凝土配合比研究与设计
[ J].混凝土 , 2008(6):120-122.
[ 3] 钱波 ,左玉强 ,王伟 ,等.基于凝土强度的相似正交配合比试
验研究 [ J] .石河子大学学报:自然科学版 , 2008, 26(3):355-358.
[ 4] 蒋亚青 ,王洪波 ,高建明.透水混凝土路面砖 [ J] .建筑砌块
与砌块建筑 , 2001(1):15-16.
[ 5] 王发平 ,邓立明.透水混凝土技术应用 [ J] .青海交通科技 ,
2006(2):54-57.
[ 6] 宋志斌 ,张永顺 ,赵鸿儒.透水性混凝土路面砖材料的正交
试验研究 [ J] .混凝土 , 2007(4):83-84, 94.
[ 7] 苏明.透水混凝土技术应用探讨 [ J] .山西建筑 , 2007, 23
(4):190-191. (编校:李　蓝)
(上接 78页)
含量。苯酚 -硫酸法是测定多糖的常用方法 ,影响该
法显色的因素较多 ,对不同多糖物质 ,其最佳显色条
件不同 。本试验在单因素试验基础上 ,采用正交设
计 L9(34)优化显色条件 ,取得较满意的结果 。由试
验结果和方差分析表明 ,硫酸用量是显色的主要因
素 ,温度 、苯酚用量及硫酸用量对牛肝菌多糖显色都
有非常显著性影响 ,而显色时间对其无显著影响 ,本
试验所确定的最佳显色条件:显色时间 25 min、显
色温度 70 ℃、5%的苯酚 1.2 mL以及浓硫酸 8.0
mL。
参　考　文　献
[ 1] 窦明金 ,靖士侠.部分植物多糖的药理作用 [ J].中国医院
药学杂志 , 1994, 14(2):80-82.
[ 2] 张小燕 ,黄建国.美味牛肝菌———一种营养丰富的保健品
[ J].杭州食品科技 , 2004, 25(4):15-17.
[ 3] DuboisM.GilesKA, HamiltonJK, etal.Colorimetricmethod
fordeterminationofsugarsandrelatedsubstances[ J] .AnalChen,
1956, 28(3):350-356.
[ 4] 涂宗财 ,李敏 ,刘光宪 ,等.苯酚-硫酸法测定油菜花粉多糖
含量的研究 [ J] .食品工业科技 , 2007, 28(4):219-221.
[ 5] 马莺,王静 ,牛天娇.功能性食品活性成分测定 [ M] .北京:
化学工业出版社 , 2005:6-8.
[ 6] 钟建平 ,钟春燕, 赵道辉 ,等.苯酚-硫酸法测定保健食品多
糖的研究 [ J] .中国卫生检验杂志 , 2001, 11(6):675.
(编校:谭金蓉)
84