全 文 ：2005年 11月
N ovember 2005
色 谱
Chinese Journa l of Chrom atography
Vo.l 23 No. 6
573 ～ 576
收稿日期:2005-06-21
作者简介:王云志 ,男 ,教授 , Tel:(0311)86266335, E-m ail:xyk f@hebm u. edu. cn.
基金项目:河北省自然科学基金资助项目(303470).
1-氧-乙酰大花旋覆花内酯对照品的制备及其
在欧亚旋覆花中的含量测定
王云志 , 　石晓伟 , 　付　焱 , 　程　伟 , 　张嫡群 , 　查建蓬
(河北医科大学新药开发研究室 , 河北 石家庄 050017)
摘要:从欧亚旋覆花的氯仿提取物中分离制备了 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯对照品 , 经紫外光谱 、红外光谱 、核磁共
振和质谱确定结构 , 其相关数据与文献一致 , 纯度为 99. 5%, 符合中药化学对照品含量测定用要求。以所制备的 1-
氧-乙酰大花旋覆花内酯为对照品 ,建立了用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定欧亚旋覆花中 1-
氧-乙酰大花旋覆花内酯含量的方法。色谱条件为 Hypersil ODS-2色谱柱 , 流动相为甲醇-水(体积比为 52∶48),流
速为 1. 0mL /m in。 ELSD的漂移管温度为 90 ℃,载气(空气)流速为 2. 5 L /m in。 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯在进
样量为 1. 37 ～ 8.21μg时与其峰面积的线性关系良好(r =0.999 8)。平均加样回收率为 100. 2%, 相对标准偏差
(RSD)为 1. 3%(n =6)。该法准确 , 简单 ,省时 , 重复性好 ,适用于欧亚旋覆花的质量控制。
关键词:高效液相色谱;蒸发光散射检测;1-氧-乙酰大花旋覆花内酯;对照品;欧亚旋覆花
中图分类号:O658　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-8713(2005)06-0573-04
Preparation and Determ ination of 1-O -Acetylbritannilactone
in Inu la Britannica L.
WANG Yunzhi, SHI X iaow ei, FU Yan, CHENGW ei, ZHANG Diqun, ZHA J ianpeng
(Departm ent ofN ew Drug Developm ent, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017 , China)
Abstract:To prepare reference substance for quality contro l of Inu la Britann ica L. , 1-O-
acetylbritannilactone was extracted and separated from chloroform extraction of Inu la Britan-
n ica L. Chem ical structure of the 1-O-acetylbritannilactone productwas elucidated by ultrav io-
let spectrometry (UV), in frared spectroscopy (IR), nuclearmagnetic resonance (NMR) and
m ass spectrometry (MS), and the results were in agreementw ith the reference. The purity of
the 1-O-acety lbritannilactone product w as 99.5%, which satisfies the need of reference sub-
stances of traditionalChinesem edicines. Am ethod ofhigh performance liquid chrom atography-
evaporative light scattering detection (HPLC-ELSD) is described for the determ ination of 1-O-
acetylbritannilactone in Inu la Britann ica L. The chrom atographic conditions include Hypersil
ODS-2 column, am ixture ofmethanol-water (52∶48, v /v) w ith the flow rate of 1.0 mL /m in
used asmobile phase. The temperature of drift tube of the ELSD was 90℃. F low rate of carri-
er gas w as 2.5 L /m in. L inear range of 1-O-acety lbritannilactone w as 1.37 - 8.21 μg (r =
0. 999 8). T he average recovery of 1-O-acetylbritannilactone w as 100.2% w ith the relative
standard dev iation (RSD) of 1.3%(n =6). Them ethod is simple, accurate, time sav ing and
reproduc ib le.
K ey words:high performance liquid chromatography;evaporative light scattering detection;
1-O-acety lbritannilactone;reference substance;Inu la Britann ica L.
　　欧亚旋覆花 (Inu la Britannica L. )是传统中
药 ,多年来一直用于治疗消化不良 、支气管炎 ,并具
有抗炎作用 [ 1] 。现代药理学研究证明 ,旋覆花的氯
仿提取物具有免疫[ 2] 、肝保护 [ 3]和细胞毒作用[ 4] , 1-
氧-乙酰大花旋覆花内酯具有抗炎作用 [ 5] ,正丁醇提
取物有抗氧化作用 [ 6] , 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯的
衍生物 1, 6-二氧-二乙酰大花旋覆花内酯的细胞毒
性比 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯强 [ 7] 。但在 2005年
版《中国药典》[ 1]的旋覆花质量标准中只有鉴别项 ,
无含量测定项 。我们从欧亚旋覆花中分离得到了
色 谱 第 23卷
1-氧-乙酰大花旋覆花内酯 (结构式见图 1),经紫外
光谱(UV)、红外光谱 (IR)、核磁共振 (NMR)和质
谱 (MS)分析 ,其相关数据与文献 [ 7]所报道的数据
一致 ,纯度为 99.5%,符合中药化学对照品含量测定
用要求 [ 8] ,因此可用作欧亚旋覆花质量控制的化学
对照品 。
图 1　1-氧-乙酰大花旋覆花内酯的化学结构
F ig. 1　Chem ical struc ture of 1-O-acetylbr itann ilactone
　　本文报道了从欧亚旋覆花中制备 1-氧-乙酰大
花旋覆花内酯对照品的方法 ,并测定了欧亚旋覆花
中 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯的含量 ,该法准确 ,简
单 ,省时 ,重复性好 ,适用于欧亚旋覆花的质量控制 。
1　实验部分
1. 1　仪器与试药
　　高效液相色谱 (HPLC)系统:包括脱气机 、K-
1500溶剂组合器 、K-1001泵 、UV-K2501检测器
(Knauer, Germ any);Alltech 2000ES蒸发光检测
器 (ELSD)(USA);BF-2002色谱工作站(北京瑞利
分析仪器有限责任公司)。 Laborota 4000旋转薄膜
蒸发仪 (Germany, Heidolphy);BS210S电子天平
(北京赛多利斯天平有限公司)。
　　欧亚旋覆花样品采自于山西省运城地区 ,部分
样品购自药材市场。药材经河北医科大学生药教研
室聂凤禔教授鉴定为欧亚旋覆花 。甲醇 ,乙腈 (色
谱纯 ,购自 Scharlau Chem ie S. A. Spain),其他试
剂均为分析纯 。 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯对照品
为自制 (批号 20030203)。
1. 2　欧亚旋覆花中 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯对照
品的制备与纯度检查
1. 2. 1　1-氧-乙酰大花旋覆花内酯的分离和提取　
取采自山西省运城地区的欧亚旋覆花 2 kg,用 10倍
量的乙醇回流提取 3次 ,每次 1 h,过滤 ,合并滤液 ,
回收乙醇得黑色粘稠膏状物约 200 g。将膏状物悬
浮于 400 mL水中 ,依次用石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯 、
正丁醇萃取 。取氯仿萃取液减压浓缩回收溶剂 ,上
硅胶柱 ,经反复分离 ,得 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯
粗品 ,用乙醇重结晶得白色针状结晶 ,即为 1-氧-乙
酰大花旋覆花内酯对照品 。
1. 2. 2　供试品溶液与对照品溶液的制备　精密称
取对照品适量 ,分别加入甲醇溶解 ,配制成每 1 mL
中含 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯 0.006 mg与 0.6
mg的溶液 ,作为对照品溶液和供试品溶液 ,用于不
加校正因子的主成分自身对照实验。
1. 2. 3　色谱条件　Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm
×4.6mm i.d., 5 μm);柱温:室温;流动相:乙腈-
水(体积比为 31∶69);流速:1 mL /m in;检测波长:
208 nm。
1. 2. 4　不加校正因子的主成分自身对照法　在
“1. 2. 3”节色谱条件下 ,精密量取 1-氧-乙酰大花旋
覆花内酯对照溶液 10 μL,注入色谱仪 ,记录色谱
图 ,调节检测灵敏度使主峰峰高约为满量程的 20%;
再取供试品溶液和对照品溶液各 10μL分别注入色
谱仪 ,记录色谱图至主成分峰保留时间的 2倍。
1. 2. 5　二极管阵列检测器 (DAD)纯度检查法　该
实验所用仪器为 Agilent 1100色谱仪 , DAD检测器
和 Ag ilent化学工作站 。在 “1. 2. 3”节色谱条件下 ,
用 DAD检测器记录色谱图 ,检查主成分峰的纯度 。
1. 3　欧亚旋覆花中 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯含量
的测定
1. 3. 1　样品溶液的制备　取干燥旋覆花 1.0 g,置
于索氏提取器中 ,加氯仿 45mL,加热回流提取至溶
液无色 ,将提取液蒸发至干 ,残渣加甲醇 10 mL溶
解 ,用 0.45 μm微孔滤膜滤过 ,备用。
1. 3. 2　对照品溶液的制备　取 105 ℃干燥至恒重
的 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯对照品 ,精密称取约
10.6 mg,置于 25mL量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至
刻度 ,过 0.45μm微孔滤膜 ,备用 。
1. 3. 3　色谱条件　Hypers il ODS-2色谱柱 (250
mm ×4.6 mm .i d. , 5 μm);柱温:室温;流动相:甲
醇-水(体积比为 52∶48);流速:1.0 mL /m in;载气:
空气 , 2.5 L /m in;ELSD的漂移管温度:90 ℃。
2　结果与讨论
2. 1　对照品的纯度检查
　　用不加校正因子的主成分自身对照法测定 1-
氧-乙酰大花旋覆花内酯对照品的纯度 ,色谱图见图
2。结果表明 ,在供试品溶液的色谱图中 ,除溶剂峰
外 ,各杂质峰面积总和小于对照品溶液主峰的面积
(0.5%)。二极管阵列检测器的测定结果表明:主
成分峰的纯度因子为 999.954;五点光谱图完全重
合 ,表明主成分峰为单一物质峰。
2. 2　对照品的结构确证 [ 7]
　　熔点与定性鉴别　对照品的熔点 (《中国药典》
2005年版附录Ⅵ C)为 124 ～ 126 ℃。对照品与羟
肟酸铁试液反应 ,反应液呈红棕色 ,表明对照品的结
构为倍半萜内酯。
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　第 6期 王云志等:1-氧-乙酰大花旋覆花内酯对照品的制备及其在欧亚旋覆花中的含量测定
图 2　1-氧-乙酰大花旋覆花内酯的纯度测定色谱图
F ig. 2　Chromatogram s of pu rity test of
1-O-acetylbritann ilac tone
a. reference solution;b. sam ple solu tion.
　　紫外光谱　对照品的甲醇溶液在 208 nm处有
最大吸收。
图 3　 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯的质谱裂解图式
F ig. 3　Sp lit pattern ofm ass spectra of 1-O-acetylbritann ilactone
　　红外光谱 σmaxKBr 　 3 499 cm -1 (OH ), 3 098
cm
- 1(C C ), 2 973, 2 940, 2 900, 2 861 cm -1 (饱
和 C—H伸缩振动 ), 1 742 cm -1 (C O ), 1 663
cm
-1 ( C C ), 1 466, 1 374 cm - 1 (CH3 ), 1 268
cm
-1(C—O), 1 163, 1 038, 959, 643 cm -1。
　　核磁共振 1H NMR　3.76(m , 1a), 3.76(m ,
1b), 1.05(m, 2a), 1.26(m , 2b), 1.15(m , 3a),
0.87(m, 3b), 2.58(m , 4), 4.01(d, 6), 3.36(m ,
7), 4.93(m , 8), 2.72(m , 9a), 2.26(m, 9b), 6.01
(d, 13a), 5.71(d, 13b), 1.61(s, 14), 0.94 (d,
15), 1.88(s,M eCOO)。
　　核磁共振 13C NMR　65.51, 27.82, 32.53, 34.2
(t)4, 131.4(t)5, 68.7(t)6, 47.27, 78.48, 34.29,
137.410, 138.911, 172.412, 124.713, 20.514,
19.415, 170.3MeCOO , 20.8M eCOO。
　　质谱　分子离子峰 (m /z 308[ M ] +),主要碎
片离子峰为m /z 290, 248, 233, 230, 215, 207, 202,
189, 179, 161 ,符合裂解规律 (见图 3)。
　　以上 UV , IR, NMR,MS光谱数据与文献报道值
一致 ,确证对照品为 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯。
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色 谱 第 23卷
2. 3　含量测定方法评价
　　在 “1. 3. 3”节色谱条件下 , “ 1. 3”节所配制样品
溶液和对照品溶液 (下同 )的色谱图见图 4。 1-氧-
乙酰大花旋覆花内酯的保留时间约为 9.4 m in,峰
对称因子为 1.02,理论塔板数为 12 350,主峰与相邻
色谱峰的分离度远远大于 2。
图 4　欧亚旋覆花样品(a)和 1-氧-乙酰大花旋
覆花内酯对照品(b)的色谱图
F ig. 4　Chromatogram s of the I. B ritannica L.
sample (a) and 1-O-acetylbritann ilactone (b)
　　线性范围　分别吸取对照品溶液 (0.456 g /L)
3, 6, 9, 12, 15, 18μL注入液相色谱仪 ,测定峰面积 ,
以峰面积的对数对质量浓度的对数作图 ,得线性回
归方程 log A =4.724 8 +2. 700 6 log C (r =
0. 999 8)(n =6), 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯在进样
量为 1.37 ～ 8.21 μg时与峰面积呈良好线性关系 。
　　稳定性　取欧亚旋覆花样品溶液 ,每隔 1 h吸
取 10μL注入色谱仪 ,共测定 8 h,峰面积的相对标
准偏差 (RSD)为 0.7%,样品溶液至少稳定 8 h。
　　精密度　吸取同一样品溶液 10μL,重复进样 5
次 ,其 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯含量的 RSD为
1.1%,表明方法精密度良好。
　　重复性　精密称取欧亚旋覆花干燥样品 5份 ,
每份 1.0 g,按 “1. 3. 1”方法制备样品溶液。分别吸
取 10 μL,测定 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯的含量 ,
其 RSD为 0.5%(n =5),表明方法的重复性良好 。
　　回收率　精密称取 6份已知含量的欧亚旋覆花
干燥样品各 0.5 g,分别加入对照品溶液 5mL,制备
样品溶液。吸取该样品溶液 10 μL,注入液相色谱
仪 ,记录峰面积 ,以外标两点法计算回收率 ,得平均
回收率为 100.2%, RSD为 1.3%。
　　最低检测限　取 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯对
照品溶液 ,加甲醇逐步稀释 ,进样 10 μL,以峰高为
噪声的 2倍 (S N/ =2)计 , 1-氧-乙酰大花旋覆花内
酯的最低检测限为 0.54 μg。
2. 4　实际样品测定
　　取不同产地的欧亚旋覆花干燥样品 ,制备样品
溶液 。吸取该样品溶液各 10μL、“1. 3. 2”节对照品
溶液 8 μL和 12 μL分别注入色谱仪 ,记录峰面积 ,
以外标两点法计算含量 ,结果见表 1。
表 1　不同产地的欧亚旋覆花中 1-氧-乙酰大花
旋覆花内酯的含量
Tab le 1　The con tent of 1-O-acetylbritannilactone in
I. B ritann ica. L . samples of d ifferent sources
Samp le Content /(mg /g) RSD /%
F lower(Shanxi) 3. 44 1. 03
Stem(Shanxi) 2. 47 1. 26
Overground part(Shanxi) 2. 62 1. 37
F lower(Hebe i) 1. 38 1. 14
F lower(Henan) 1. 27 1. 23
2. 5　讨论
　　(1)欧亚旋覆花中 1-氧-乙酰大花旋覆花内酯
的含量较高 ,具有一定的生物活性 ,从其氯仿提取物
中容易制备 ,纯度较高。 (2)欧亚旋覆花中 1-氧-乙
酰大花旋覆花内酯的最大吸收波长为 208 nm ,使用
紫外末端波长检测时 ,最低检测限为 18 ng。虽然
用紫外检测器末端波长测定 1-氧-乙酰大花旋覆花
内酯的检测灵敏度比 ELSD高 ,但由于中药所含成
分复杂 ,许多成分都能出峰 ,常常需要使用梯度洗
脱 ,耗时 ,结果重复性差 。使用蒸发光检测器 ,由于
漂移管温度较高 ,某些成分可能挥发掉 ,色谱峰数减
少 ,可以使用等度洗脱测定欧亚旋覆花中 1-氧-乙酰
大花旋覆花内酯的含量 ,克服了紫外检测器的缺点。
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