全 文 ：植物学通报 2 9 9 2 , 9 ( 1 ) : 3 7一谨1
C il i
n e s e B u l l e t i n o f B o t a n y
新疆紫草的组织培养及其染色体分析
李国珍 秦明波 康宁玲 谢德玉
(北京师范大学生物系 , 北京 1 0 0 0 85 )
叶和春 李国风
( 中国科学院植物研究所 , 北京 1。。 。4 4 )
摘要 新疆紫草 ( A , 加沉 a 洲 c h , 。 仍 a) 的胚轴 、 子叶 、 根都产生愈伤组织 。 不同来源的外植体
产生苗的能力不同 , 胚轴来源的愈伤组织分化苗最多 , 而且苗生长旺盛 。 根的愈伤组织只产生不
定根。 新疆紫草的核型是 K ( Zn ) = 14 = Z m + s m + sZ m ( S A T ) + Z s t 。 随着继代培养代数增
多 , 染色体变异的种类和频率以及染色体数目显著增加。 如果继代培养时间较长 , 染色体数目变
异的范围更广 , 而且出现染色体结构变异。
关键词 新疆紫草 , 组织培养 ; 染色体畸变
T IS SU E C U L T U RE AN D C HR OMO SOM E AN AL Y S IS
O F A R N E B I A E U C H R OM A
L i G u o 一 z h e n Q i n M i n g一 b o K a n g N i n g
一
l i n g x i e D e
一 u i
( D e 夕a , 乙m e : ` o f B云。乙0 9梦, B e 云j云. 9 N o , 二 a 乙 U , 玄” e , s玄亡夕, B e 云j 云: 9 1 0 0 8 7 5 )
Y e H e
一 e h u n L i G u o 一 f e n g
( I 称 s `云名舫名e o f B o t a . 夕 A c a 己e 仇 感a 召玄. 玄c a , B e 玄J云介 9 1 0 0 0 4 4 )
A b s t r a e t C a l l u s o r i g i n a t e d f r o m p l u m u l a r a x i s
, e o t y l e d o n a n d r o o t o f
A r n e b i a e u e h r o m a
.
T h e f r e q u e n e y o f s h o o t d i f f e r e n t i a t i o n w a s d i f f e r e n t
d e p e n d i n g o n t h e S o u r e e s o f e x P l a n t s
。
M
o s t s h o o t s w e r e p r o d u e e d f r o m
e a l l u s o f p l u m t l a r a x i s a n d g r e w b e s t
.
T h e r o o t e a l l u s o n l y d i f f e r e n t i a t e d
r o o t s
.
T h e k a r y o t y p e o f A r n e b i a e “ c h r o m a w a s K ( Z n ) 二 1 4 = Zm + s s m + Z s m
( S A T ) + Z s t
.
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n e r e a s i n g g e n e r a t i o n o f s u b e u l t u r e
, t h e a b i l i t y o f
d i f f e r e n t i a t i o n w a s r e d住 e e d ; e i t h e r t h e k i n d a n d f r e q u e n e y o f e h r o m o s o m a l
v a r i a t i o n o r t h e e h r o m o s o m e n u m b e r w e r e i n e r e a o e d d i s t i n e t ly
.
A f t e r
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, t h o r a n g e o f v a r i a t i o n o f e h r o m s o m e n u
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P r o d u e e d
.
K e y w o r d s
.八 r n e b i a e u e h r o m a , T i s s u e e u l t u r e ; e h r o m o s o m a l v a r i a t i o n
一 3 7 一
紫草中的紫草宁用途广泛 , 作为药用 , 可用于抗菌消炎 ; 作为天然色素 , 可 用于 化 妆
品 , 食品饮料等轻工业方面 1[ 0〕。 但野生紫草资源贫乏 , 引种栽培亦较困难 , 故需要探 索获
得大量紫草及其紫草宁的有效新途径 。
目前 , 国内外通过紫草细酶大量堵养产生紫草宁已取得突破性进展鸟产。口。 . 但对其再 生
植株分化条件及其基本核型 , 集色体变异分析尚未见报道 。 ” ’ “ ·
在各地所产的紫草中 , 以我国的新疆紫草质量最好。 故我们以新疆紫草为对象试图探讨
其组织培养条件 , 以便进一步进行大量繁殖 , 丰富紫草资源 , 并为建立紫草的遗传转化系统 ,
实现大规模反应器商品化生产准备条件 。 此外 , 分析新疆紫草无性系的核型和染色体数目变
异 , 对于研究探讨细胞培养中的遗传变异规律 , 更好地利用紫草宁于细胞工程奠定基础 。
材 料 与 方 法
新疆紫草 A nr eb i 。 。如h or 二 。的种子采集于新疆天 山。 获无菌苗 。 取其 胚轴 、 子叶 、 根
作为外植体 , 接于含有 K T , 2 , 4 一 D的L S培养基和含K T 、 I A A的 L S 培养基中 , 于 25 ℃黑暗条
件下培养 。 然后 , 将愈伤组织转至附加不同比例的K ? 和 I A A 的M s分化培养基 , 并且将愈伤
组织继代培养 , 约 25 一 30 天左右转代一次 。
按常规细胞遗传学方法 , 将愈伤组织进行染色体制片及染色体分析。 基本按 L o va n 的染
色体分类标淮 , 5 et bb i如的核型分类标准 , 将新疆紫草进行核型分析 l[ ,3 〕。
结 果 与 讨 论
(一 ) 新疆紫草愈伤组织的器官分化
将新疆紫草无菌苗的胚轴 、 子叶 、 根不同器官作为外植体进行培养 , 约 10 天后 , 均可诱
导形成愈伤组织 , 其诱导率为 1 0 % 。 愈伤组织 (见图 1 ) 基本上都呈 红 色 , 含有 紫草宁。
表明各器官 、 组织 、 细胞具有全套基本的遗传组成 , 表现出细胞全能性。
待愈伤组织长至约 1 一 2 c m大小转移到分化培养基 。 约 15 天后 , 产生丛生状绿芽 , 每 丛
约 10 个芽左右。 进一步长成再生苗 (图 2 ) 。
1
. 不同外植体的作用 不同器官来源的外植体及外植体的不同发育时期在植株再生中具
有重要作用〔 6〕。 在新疆紫草实验中 , 所有外植体都来源于幼苗 , 都有器官发生 。 但是不同来
源的结果不同 。 以胚轴来源的愈伤组织分化芽 , 形
成苗最多 , 而且苗生长旺盛 , 其芽诱导率为 20 纬。
子叶愈伤组织的芽诱导率次之 , 为 6 . 3 % 。而根来
源的愈伤组织只能形成不定根 , 不分化芽和再生 1
苗 (表 1 ) , 而且容易老化 。
2
.不同培养基的作用 从表 、 1 , 可以看到 ,
合适的激动素和生长素的比例对新疆紫草愈伤组
织的分化及生长是重要的。 以附加 K T o . 4m g / 图 1 新疆紫草的愈伤组织 (深红色 )
L 和 IA 八 l m g / L最好 。 IA A 能促进紫草 的芽 、
一 3 8 一
表 1不同外植体 , 培并共对新 . 紫草器官分化的影响
不同愈伤组织分·
- 一 一 { 化苗百分率 (% ) {甲恻 , 二低 , , 甲 、 70 ,培 养 基 }一里号二二= 一巴二 1生长 l— 一}胚轴 )子叶 】根 {势 !胚轴 {子叶 …根M s + K T Zm o z L + } 。 。 } _ } _ } . } _ l _ {, 人 A 。 _ ~ , T 一 } ` V } U I U { 十 } U { U { U二二二三里竺i兰 -一…一…一…一}一…一 {一…一M S + K T 4口又 / L + { , 。 1 。 。 { 八 } . 1 _ } _ } ’ _T 几 A 八 n _ _ , -t } 上 v 4 0 一 J { U I 宁 { U ) U 一 U兰型 竺三望些i兰一 {— {— …— …一…— {— {一M S + K T O 。 4 nI 宜 / L + } n } 八 } 。 } . } _ } . , _ }
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图 2 新疆紫草的再生苗
注 : 十 + 生长旺盛 , 一般苗高约 8 一 9 c m 。
+ 生长弱 , 一般苗高约 0 . 1一 Z c m 。
根分化和生长 。 激动素对芽的分化作 用 不是很大 , 但其比例过高 ( 2 一 4 m g /毛 ) , 使新疆
紫草再生苗生长差 , 叶片变硬 , 变厚 , 不伸展 , 不久即死亡 , 而且抑制根的分化 。 激动素与
生长素的比例相等 , 都为 0 . 4m g / L时 , 抑制芽的分化 , 但能长根 。
S k o g和 M il le r提出激动素和生长素比例对植物器 官分化有重大影响 。 其他学者进一步
提出植物激素的绝对浓度 、 性质等也有作用 1[ 〕 。 这些基本与我们的实验结果一致 。 但是新疆
紫草再生苗的分化对激素不太敏感 , 可能是由于新疆紫草的内源激素等生理特点 , 培养条件
不同而有不同表现。
3
.长期继代培养的影响 长期继代培养对新疆紫草的器官分化影响很大 。 经过 27 代以上
继代培养的愈伤组织没有分化出芽和再生苗 。 这种细胞多发生染色体畸变 , 具有较高比例的
混倍体及染色体断片 , 缺失 , 染色体环等 。 表明组织培养中植物再生能力与发生染色体变异
的细胞之间存在负相关 l[ 幻 。 长期继代培养引起细胞遗传损伤 , 使培养物丧失全能性 , 导致愈
伤组织的形态发生能力降低 。
4
.愈伤组织细胞的异质性 新疆紫草在来源及培养条件相同的情况下形成的愈伤组织一
般为红色 , 部分棕色 , 少数白色 。 白色愈伤组织多数能逐渐变红 , 表明紫草宁可能在细胞的生
长发育过程中逐渐形成 。 不同愈伤组织的紫草宁含量不同 。 有的愈伤组织 , 即使在同一块上 ,
细胞组成亦不相同 , 出现红 、 白色细胞嵌合体 , 紫草宁含量也不同 , 我们还观察到 , 靠近培
养基的愈伤组织基部继代产生的愈伤组织具有较一致的红色 ; 而从愈伤组织上部外围 (深红
色 ) 产生的 , 则分离出红 、 白色细胞团块。 这种表型上的异质性也反映在染色体的变异上〔见
结果 (二 ) 〕 , 体现了植物遗传异质性 。 因而 , 为选择紫草宁含量高且稳定遗传的优良株系提
供了可能性 。
(二 ) 染色体分析
1
. 新疆紫草的核型 据文献报道 , 假紫草属 ( A r n eb i a ) 一些种的染色体数 目 , x = 4 ,
1 1
, Z n = 8 , 1 4 , 2 2 , 2 4
, 但没有我国新疆紫草 f A r n e b i a e u e h r o m a ) 的染色体资料 [ 6〕。
在我们实验 中 , 对经过 3 代继代培养的新疆紫草愈伤组织的大量细胞 ( 3 7 0个 ) 进行了 染 色
体分析。 2 39 个细胞 ( 6 4 . 5 9% ) 具有 14 条染色体 , 在有的愈伤组织中达 92 % , 而且这些染色
一 3 9一
体的形态基本稳定 , 在细胞间基本一致 。 · 因此新疆紫草为二倍体种 , Z n = Z x = 14 x 二 7 。
核型为 K ( Z n ) = 14 = Z m + s s m + Z s m ( S A T ) + Z s t (图 8 、 4 , 表 2 ) , 第 6 对染
` l
色体为中部着丝粒染色体 。 第 1 、 2 、 3 、 4 、 7 对为亚中部着丝粒染色体 , 其中第 3对染色
体带随体 。 第 5 对染色体为亚端部着丝粒染色体 。 染色体长度变异范围为 7 . 2 6林m一 12 . 4 7协m 。
最长染色体为最短染色体的 1 . 74 倍 , 臂比值大于 2 的染色体在整个染色体组中所 占比 例为
0
.
71
, 在核型分类中属于 “ 3 A ” 型 。 核型不对称系数 ( A S . K % )为 6 7。 5 8% , 接近于 50 % 。
因此 , 新疆紫草偏于对称的核型 。
新疆紫草的染色体随体 很 小 , 不 易 辨
别 , 也易丢失 , 是制片观察中应 注 意 的 问
题 。
2
. 染色体数目变异 对新疆紫草继代培
养的愈伤组织进行染色体数 目分析 , 结果列
于表 3 。 继代培养代数低的 (如 3 代 ) 的愈
伤组织 , 多数细胞 ( 64 . 59 % )为 Z n = 1 4 , Z n
图 3 新疆紫草核型 ( 比例尺为 10 林m )
口门曰日门曰口口日门门曰日口门日一日曰门
门川日以
= 8 一 14 的细胞的占85 % 。 因此 , 染色体数
目变化不是很大 , 倍数性不高 。 但是当继代
培养次数增多时 , 染色体数目有增多趋势 。
多数细胞所具有的染色体数目范围也不同 。
如到 2 7一 2 8代时 , Z n 二 s 一 2 4的细胞从8 5 %
降 至 3 . 17 % , 而 Z n = 15 一 28 的 细 胞 从
1 4
。
9 9%增至到 4 4 . 4 3% 。 继代 35 代的愈伤组
织 , Z n = 11 5 一 28 的 细 胞 数 目 更 多 , 为
7 3
.
3 9%
, 同时染色体数的变异幅度增加 。 如
35 代红色愈伤组织几乎具有表中所列的各种
染色体数目 , 有的细胞的染色体甚至达 80 条
以上 。 在染色体变异中除混倍体外 , 还有少
数细胞出现染色体结构变异 , 如 染 色 体 缺
失 , 染色体环和断片 , 有的染色体显著变长 ,
可能有重复 、 易位发生 。
在继代培养 35 代的愈伤组织中 , 对比分
析了稳定遗传的白色和红色愈伤 组 织 的染
色体 (表 3 ) 。 经过长期继代培养 , 两种愈
伤组织的染色体数 目都有增加 , 都变成了混
倍体 , 但是又有差异 。 红色愈伤组织细胞的
染色体数目多在二倍体到四 ;倍体 之 间 , 即
75 %细胞为 Z n = 14 一 28 , 而在白色愈伤组
织中 , 多数细胞在四倍体到六倍体之间变异 ,
图 4 新疆紫草核型模式图
表2 新 . 紫草染色体的相对长度、 份比和类型
序 号 { 相对长度 } 臂比 一 类型
1 9
。
8 6 l
。
7 3
1 5
。
88 2
。
1 5
1 3
。
9 6 2
。
7 2
1 3
。
82 2
。
5 5
13
。
10 3
。
3 0
1 1
。
80 l
。
1 8
1 1
。
4 0 2
。
87
· : 指随体染色体 、 随体长度计算在内
约 7 9 。 5 5%细 胞 为 Z n = 2 8 一 4 2 。 对比红 色 愈
伤组织 , 白色愈伤组织的染色体数目更多 , 倍 数性高些 。 这种差异可能与紫草宁的形 成 有
一 4 0一
表 3 继代培并中具有不同染色体数目的细胞百分率 ( % )
一1.一7一
1 2
. 。
29
2 1
一了7
2
。
2 8
油胞 \ 染色体 8 一1 3 14 一 2 2一 2 7 2 8 2 9一3 4 { 3 6一4 1 4 2 > 43 统计细百分率 \ 数 目 ( Zx ) { 2 1 ( 4x ) 3 5 一 ( 6 x ) 胞数目
(世一 、妙 , 15一 2 0 } ( s x ) !音养代数 一乏 …`3 x ,
一2 0。 0 0 6 4。 5 9 5 . 。妇; . 。。…、 7’. 43 Q。 5 4 公 , · } 七 1 。 6 1 1 3 703 代 一6 。 4 5 3 一 17 _ { 2 0 。 6 3 3 。 1 7 二-贾 1 0 。 2 3 10 。 8 7 1。 14 一 一 6 3
2 7 一 2 8 代 1 . 6 i r , ’甘g j 6 · 3 ` 、 3 9 。 5 2 一 0 。 9 1 7 。 9 4 7。 2 6 一“ 8 · 5 7 12 4拓代红色愈伤组织 ` 1 ` 了了一
l^
工· 2 , ` 1 1。 3 6 3。 4 1 .2 。 4 2、 2 8。 4 1 1 4 。 8 4 8 8
35代白色愈伤组织 “ · 2 8 { “
· 2 7 3 6
。
3 6
{
` · 55
关 。 紫草宁生物合成能力涉及因素复杂 , 既受培养条件影响 , 也可能受核基因或细胞质因子
调控 1[ 。〕, 这些问题还待进一步研究 。
在植物组织培养过程中 , 培养物存在着相对遗传稳定性和 J“ 泛变异性。 两个方面都有文
献报道 [ 5、 7 、 8 、 9 、 1 1、 1 2 〕。 P h i l l主p 〔 1 1 1提出 , 组织培养中显然是突变发生的过程 , 具有几乎 所
有自然突变形式 。 组织培养使培养物发生细胞学变化 , 导致染色体畸变 , 包括数目变异 , 结
构变异 。 究其原因 , 可能为诱导发生 , 培养条件改变了培养细胞的时间及空间上的调控 , 产
生核内有丝分裂 、 核融合等 , 或者可能是可转移因子的活化 。 从分子水平考虑 , 无性系变异
原因可能在于组织培养中使D N A 甲基化的改变 , 活化转移因子 ; 异染色 质的晚复 制导致染
色体断裂 , 从而引起染色体畸变〔1 〕。 在新疆紫草的染色体变异大的愈伤组织中 , 往往 存 在
一些染色体断片 , 可能与此有关 。
上述实验结果表明 , 新疆紫草在组织培养中遗传不稳定 , 其继代培养近两年的愈伤组织 ,
染色体组成变化很大 , 而且 , 这种变异的种类和频率随着时间延长而显著增加 。 因此 , 在新疆
紫草的细胞工程研究中 , 一方面要利用其无性系容易变异的一面 , 作为选择优良株系的基础 ,
可以继续提高紫草宁的含量 ; 另一方面 , 要进一步加强基础研究 , 探讨无性系变异机制以及
保持优良无性系遗传稳定的途径 。
参 考 文 献
〔 1 〕 巴尔茨 , W . 等主编 , 1 9 83 , 植物组织培养及其在生物技术上的应用中译本 , 科学出版社 , 第 2 3 一2 37 页 。
〔 2 」叶和春等 , 1 99 1 , 植物学集刊 , 第 6 集 , 第 157 一 1 67 页 , 科学出版社 。
〔 3 〕 李国珍主编 , 19 85 , 染色体及其研究方法 , 科学出版社 , 第 1 08 一 1 2 页 , 第 1 70 一 176 页 。
〔 4 〕 李悠学 、 陈瑞阳 , 1 9 8 5 , 武汉植物学研究 , 3 ( 4 ) : 第2 9 7一 3 02 页 。
〔 6 〕 胡含 、 王恒立 , 19 9 。 , 植物细胞工程与育种 , 北京工业大学出版社 , 第 2 09 一 21 3页 。 `
〔 0 〕 F e d o r vo , A 。 A 。 ( e d 。 ) , i , 6。, C血r o m o s o m e N u 边 b er s o f F lo w e r i n g P la n t s 。 L e n i n g r a d , p p 。 1另i一2 6 3 .
【7 3 F “ j it a , y . a n d T a b a t a . M . 1 9 8 7 , I n G r e e n , C . E . e t a l。 ( e d s . ) t p l a n t T is s t e a n d eC l l C “ l t u r e .
A l
a n R
。
L i
s s I n e
. ,
PP
。
1 6。一 18 5 .
〔 a 〕 L a r k i n , P 。 J 。 a n d S e o w e r o f t W 。 R . , 1 0 5 1 , T h e o r 。 A p p l。 G e n e t 。 , 6 0 : 1 0 7 -
〔 。 〕 L i G u o z e n e t a l . , 1 95 5 , I n eG 立 e t i e M a n i p u la t i o n i n C r o p s ” , 3 4 0一 3 4 1。 I n t e r n a t i o n a l R i e e R e s e a r e h
1皿 s t i t u et C a s s e ll T了e o o l v
〔20〕 T a b a t a M . , 1 0 5 5 , I n M . Za i t li n e t a l . ( e d s . ) : B i o t e e五n o l o g y i n P l a n t S e i e n e e . A e a d P r e s s I n e . p p .
2 0 7一 2 1 8 。
[ 2 1〕 P h i l li p s , R . L . e t a l . , 1 0 5 0 , I n C e l l u la r a n d M o le e u l a r B io l o盯 . P r o g r e s , i n P l a n t H . J . J . N i jk a m p
(
e
d
.
)
: K l a w e r A e a d
.
P“ b li s五e r , p P . 2 3 2一 2 4 2 .
〔12〕 Y e o m a 。 , M . M . , 1 9 5 6 , P l a n t C e l l C u l t u r e T e e h n o lo g y . B la e k w e l l s e i e n ti f i e P u b l i e a t i o n s , p p . Z o一 25 .
一 4 1一