全 文 ：·基础研究 ·
青藤碱对白介素 l p 诱导的肾小管上皮细胞
骨架变化和明胶酶活性的影响
杨汝春 王永钧 林京莲 周大为 朱晓玲
【摘要】 目的 探讨青藤碱干预炎症介质诱导的肾小管上皮细胞表型转化的作用 。 方
法 用 I L 一 1日 (10 g n/ 耐 )刺激小鼠肾小管上皮细胞株 (M c T )和原代小鼠肾小管上皮细胞 , 并
用青藤碱 ( 10 、 10 、 50 林m ol / )L 进行干预 。 应用 四哇盐 ( M竹 )法测定青藤碱的细胞毒性 。 用免
疫细胞化学法 、 We set m 印迹和 RT 一 cP R 分别测定细胞 。 一平滑肌肌动蛋白 ( 。 一 s M A ) 、 波形蛋白
(vi m )蛋白和基因表达 ;明胶酶谱法测定明胶酶— 基质金属蛋白酶类活性 。 结果 IL 一 l p 能够使肾小管上皮细胞 。 一 s M A 、 vi m 蛋白质合成和基因表达显著上调 , 明胶酶活性亦同时增强 ; 各
个浓度 的青藤碱均可显著降低 a 一 SM A 、 iV m 蛋 白质和基因的表达以及明胶酶活性 。 结论 青
藤碱可抑制免疫炎症因子诱导的肾小管上皮细胞发生表型转化和降低明胶酶活性 ,可在一定
程度上阻止 肾小管上皮细胞迁移 , 防止肾小管萎缩 ,从而在防治肾小管间质纤维化中发挥其
作用 。
【关键词】 青藤碱 ; 白细胞介素 1 ; 明胶酶类 ; 波形蛋 白 ; 。 一平滑肌肌动蛋白 ; 肾
小管上皮细胞 ; 表型 ; 基质金属蛋 白酶类
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e n al ut b沮 a r e Pi ht e li al e e l s ; Ph e n o ytP e ; M a呱 m e t al o Por t e i n a s e
青藤碱是从防己科植物及青风藤中提取的主
要有效生物碱单体 , 现代药理研究显示其有明显
的抗炎和免疫调节作用 , 能抑制 I L 一 1 、 NT F 一。 等
免疫炎症因子表达川 。 实验表明青藤碱在降低循
作者单位 : 31 以只〕7 杭州市中医院肾病实验室
环免疫复合物 , 减少蛋白尿 , 改善肾功能等方面具
有确切疗效 z1[ 。 但 目前尚未检索到有关青藤碱防
治肾小管间质纤维化的报道 。 我们拟通过观察青
藤碱对炎症因子 IL 一 l p 诱导的肾小管上皮细胞表
型转化的影响 , 进一步了解其在保护肾脏功能中
的作用 和机制 。
中华肾脏病杂志 200 6年 8 月第 2卷第 8 期
材料与方法
1
, 主要试剂 : xL一 p (美国 C y t o l a b ) , 青藤碱纯
品 (西安天成医药 ) , DM E M / 1F 2 培养基 (美国
G ib e 。 )
,胎牛血清 (杭州四季青 ) , 明胶 (美国 S i g m a ) ,
抗 。 一 s M A 抗体和 v im 抗体 (美国 D B S ) , R N A 提
取试剂 irT z ol 、 逆转录和 P CR 扩增试剂盒 、 引物合
成 (上海生工 ) , E C L 试剂 ( 以色列 Am ier hs an ,
P h a
macr
i a Bi o t e e h )
。
2
. 原代肾小管上皮细胞培养 : 方法从英国皇
家 Guy ` s 医院引进 。 无菌取 B al B / C 小 鼠肾脏 ,去
肾包膜 , 取肾皮质 , 剁碎 , 用 0 . 1% n 型胶原酶
37 ℃消化 20 m in , 在 80 目筛网上研磨并冲洗 ,并
依次通过 巧。 、 20 目筛网 , 收集网下液体 。该液体
过 40 林m 孔径的尼龙筛网后 , 150 r / m in 低温离
心 5 m in , 去上清液 , 用含 2 %胎牛血清的 D M EM /
1F 2 培养液悬浮 。 在倒置显微镜下观察原代培养
的小鼠肾小管上皮细胞形态 , 并用免疫细胞化学
方法检测 。 一 SM A 、 vi m 和上皮细胞标志角蛋白的
表达并进行细胞鉴定 。第 1代细胞用于实验研究 。
3
.
M M T 比色法检测青藤碱的细胞毒性 : 用浓
度分别为 10 、 10 及 50 林m ol / L 的青藤碱孵育肾
小管上皮细胞 , 7 2 h 后用 p B S 洗 2 次 , 加人 M贯
( 5 9 / L )
, 继续培养 3 0一 4 0 m i n 。 小心吸弃 M竹 ,加
人二甲基亚矾 , 充分吹打均匀 。 酶标仪 570 n m 检
测 吸光度 (A ) 。
4
. 实验分组及干预方法 : 将肾小管上皮细胞
分为 5 组 : ( A )对照组 : 用普通培养液培养 ; ( B )
模型组 : 在培养液中加人 IL 一 l p ( 10 gn / 耐 ) ; ( )C 、
( D )
、
( E )分别为 1 0 、 10 0 、 50 林m o l / L 青藤碱干预
组 , 即在模型组的基础上加人青藤碱至终浓度为
10
、
10()
、
5 0 0 林m o F L 。 2 4 h 后收集细胞用作总 R N A
提取 ; 72 h 后收集细胞用作蛋白质提取 ; 收集细
胞上清液用作明胶酶活性测定 。
5
.
R T
一
P CR 测定 。 一 SM A 、 V im 基因表达 : rT i z o l
法提取细胞总 R N A 。 两步法进行 R T 一 P c R , GA PD H
作为内参照 。 引物序列见表 1 。 P c R 反应条件 : 95 ℃
5 m i n
,
9 5℃ 3 0 5 , 5 6℃ 3 0 5 , 7 2℃ 3 0 5 , 3 5 个循环 :
7 2℃ 10 面 n 。 扩增产物经 1 . 7 %琼脂糖凝胶 电泳
后 ,凝胶成像系统成像 , 用 iB o R ad qu an iyt o en 软
件 包对 条 带进 行 半 定 量 分析 , 。 一 SM A 和 iV m
m RN A 的相对含量分别用其与 G A PD H 特异性条
带的积分吸光度之比值表示 。
表 1 引物序列
引 物 序 列
。 一 s M A ( 5 2 0 b p ) 正链 5 ’ CGT A G AGC A代 CGA C A C 3 `
负链 5 ’ G A CCT CAT C C C A A TGA A A G 3 `
V im ( 507 b p ) 正链 5 , C CGC 了rI ,GC c A CTA CAT 3 ,
负链 5 ` G C A G C C A C G C叨 T C AAT C 3 ’
G A PD H ( 3 o 7 bP ) 正链 5 ’ G C AGT G e e AA GGT GA G A r r G 3 ’
负链 5 ’ G C AGA A GGG G CG G A C AT G A I , 3 ’
6
. 免疫细胞化学方法测定 。 一 SM A 、 vi m 蛋 白
表达 : 将原代肾小管上皮细胞以 s xl o兮inl 接种
于明胶处理的预置玻片上 , 待细胞长至 80 %融合
时 , 换无血清培养液同步 24 h , 再分别加人 I L 一 l p
和青藤碱刺激 72 h 。取出玻片 ,丙酮固定 , 2%牛血
清白蛋白封闭 , 0 . 3% irT t on 一 10 0 打孔 , H必: 灭活内
源性过氧化物酶 。 加人一抗 , 4 ℃反应过夜 。 加二
抗 , 37 ℃孵育 30 m in 。 滴加 A B C 复合物 , 37 ℃反应
30 m in
。
DA B 显色 ,苏木素染核 ,酒精脱水后封片 。
各步骤之间均以 P B S 液洗 5 m in x 3 次 。 采用 2%
牛血清白蛋白和不加一抗作为阴性对照 。 光镜下
观察细胞浆 内呈棕黄色染色者为阳性细胞 。 每张
玻片分别在高倍镜 (x4 o o) 下随机选取 10 个视
野 ,计算阳性细胞的平均百分率 。
7
.
W es et m 印迹测定 。 一 SM A 、 iV m 蛋白表达 :
用塑料刮刀 将细胞刮下 , IR R A 细胞裂解液裂解 ,
再用 2 血 针筒和针头来 回抽提 10 ~ 巧 次 , 置冰上
3 0 m i n
。 在 4 ℃ 14 o 0 O r / m i n 离心 15 m i n ,上清液
用 B CA 法测定蛋白浓度 。 取蛋白质总量为 30 林g
的蛋白 ,在 12 % 的聚丙烯酞胺 ( SD S 一PA GE )凝胶上
电泳 , 电压 15 v0 , 约 70 im n 。 在 4℃ 250 m A 电流
1
.
5 h 转移至尼龙膜 , 5%脱脂奶粉封闭 l h 。 加人
第一抗体 , 4 ℃过夜 , PB s T 缓冲液洗 3 次 , 每次 10
m in
, 再加人相应辣根过氧化物酶标记的第二抗
体 , 室温孵育 1 . 5 h 。 E c L 试剂显色并曝光成像 ,
B xo
一
R A D 凝胶成像系统 B i o R a d q u a n iyt 。 n e 软件
包分析结果 。 。
8
. 明胶酶谱法检测明胶酶活性 : 配置 7 . 5%
s D s
一
P A G E 胶 ( 内含 1 m g / mI 的明胶 ) 作为分离
胶 ,上覆 4 % 的浓缩胶 。 将细胞上清液 (含 20 陀
蛋白质 ) 以 :3 1 的 比例与 4 x加样缓冲液混匀 ,不
加热直接上样 , 以 巧 m A 电泳 。 电泳后用 2 . 5% 的
翻 ro n x 10() 漂洗 6 0 m i n , 3 7℃孵育过夜 。 考马斯亮
蓝染色 Z h ,脱色 20 m in , BI O 一 RA D 凝胶成像系统
观察结果 , B i。 R a d q u a n i妙 。 n 。 软件包分析结果 。
中华肾鲜病杂志ZQo 6 年 8 月第 2 2 卷第 8 期 Ch in JN e ph o rl , A u 邵 s t 20 6 , V o l 2 2 , N o ` 8
ù、à2一2110…2,10OHóV叻、日浑9
. 统计学方法 : 用 S SP S 1 1 . 5 软件对数据进
行分析处理 , 计量资料用 ; 士 、表示 ,方差齐者 , 多
组间采用 。 en 一 w ay AN OV A , 组间两两 比较用 SL D
法 。
2860…110
国adVl0叩已
结 果
一 、 原代肾小管上皮细胞鉴定
1
. 细胞形态观察 : 在倒置显微镜下观察 , 培
养的肾小管上皮细胞具有典型的上皮细胞鹅卵石
样形态特征 ,见图 1一 A 。
2
. 免疫细胞化学检测 : 培养的肾小管上皮细
胞表达角蛋白 , 而几乎没有 。 一 s M A 、 vi m 的蛋白表
达 。 见图 1一 B , 一 e , 一 D 。
M : 分子量标记 ; A : 对照组 ; B : 模型组 ; C 一 E : 分别为 10 、 10 0
及 5 0 林m ol / L 青藤碱干预组 ; 与对照组 比较 , *尸 < 0 . 05 ;与模型
组 比较 ,切 < 0 . 05 ;与青藤碱 10 协m ol / L 比较 , △尸 < 0 05 ; 与青藤
碱 10 卜mo l/ L 比较 , 去尸 < 0 . 05
图 2 各组肾小管上皮细胞 a 一 SM A 和 iV m m R N A 表达 (RT 一P c )R
A
:第 1代 (倒置显微镜 xl oo ;) B : 角蛋白染色 (免疫细胞化学
又4 0 0 ) ; e : a
一
s M A 染色 (免疫细胞化学 x 4 0 0 ) ; D : v i m 染色 (免疫细胞
化学 x 4 o o )
图 l 原代培养的小鼠肾小管上皮细胞鉴定
上皮细胞几乎不表达 。 一 S M A 和 iV m 蛋白 。 经 I L -
1日诱导 72 h 后 , 。 一 SM A 阳性细胞升至 ( 57 . 09 士
17
.
67 )% ; 视野中几乎所有的细胞均表达 vi m 。
10
、
10 0 及 50 林m d / L 青藤碱使 。 一 s M A 阳性细胞
分别下降至 ( 3 4 . 2 1士 1 0 . 2 4 ) % 、 ( 2 3 . 5 3士 19 . 9 7 )%及
( 10
.
4 6士 4
.
4 4 )%
。 青藤碱干预组细胞 V im 的阳性
表达也较模型组明显减弱 。
免疫印迹结果显示 , I L 一 l p 刺激 72 h 可显著
上调肾小管上皮细胞 。 一 s M A 和 iV m 的蛋白表达 ;
与模型组比较 , 各浓度青藤碱均可显著抑制上述
蛋白的表达 ,并呈剂量依赖性 。 见图 3 。
二 、 青藤碱的细胞毒性
M竹 比色法显示 , 不同浓度的青藤碱刺激的
肾小管上皮细胞的吸光度值与对照组细胞差异无
统计学意义 。
三 、青藤碱对肾小管上皮细胞 。 一 SM A 和 iV m
基因表达的影响
。 一 SM A 和 iV m m RN A 的表达在对照 组细胞
和模型组之间 以及模型组和各个浓度的青藤碱干
预组 细胞之间 ,差异具有统计学意义 ,并随青藤碱
浓度的增高 , 两种细胞骨架蛋白的基因表达亦逐
渐下降 。 见图 2 。
四 、 青藤碱对肾小管上皮细胞 。 一 SM A 和 iV m
蛋白表达的影响
免疫细胞化学结果显示 , 对照组原代肾小管
Ré0 6402目公吕l泞月A层
叫貂已ó户ó笼叩匕
A B E D C
A 一 E
、各符号意义同图 2
图 3 各 组 肾小 管上皮 细胞 。 一 SM A 和 iV m 蛋 白的表 达
( W
e 、 t e r n 印迹 )
五 、 青藤碱对肾小管上皮细胞明胶酶活性的
影响
原代小鼠肾小管上皮细胞经 10 n g / ml 的 I L一 l p
刺激后 , 上清液中明胶酶 M M P 一 2 和 M M P 一 9 的活
中华肾脏病杂志加 06 年 s月第 2 2卷第 s期 eh in JN叩坛ol , A u孕 s : 2 00 6 , v o l 2 2 , N o名
性与对照组差异有统计学意义 , 分别为对照组的
1
.
3 43 倍和 1 . 507 倍 。 不同浓度的青藤碱干预后 ,
M M P
一
2 和 M M P 一 9 的活性均显著下降 , 与模型组
差异均有统计学意义 。 见表 2 , 图 4 。
表 2 青藤碱对肾小管上皮细胞明胶酶活性的影响
(与对照组的比值 )
组别
对照
模型
青藤碱 or 林m ol / L
青藤碱 10 0 林m o l / L
青藤碱 5 0 0 协m o l / L
M M P
一
2
1
.
0
1
.
3 4 3士 0 . 0 3 7*
1
.
1 14 士 0
.
0 7 3
莽
0
.
9 4 8士 0
.
10 4
#
0
.
9 2 7 士 0
.
0 7 6
# △
M M P
一
9
1
.
0
1
.
5 0 7士 0 , 0 8 9 *
1
.
19 1士 0
.
0 7 2
#
0
.
9 4 4 士 0
.
16 7
#
0
.
8 3 7 士 0
.
1 0 9
禅
与对照组 比较 , * 尸 < 0 . 05 ; 与模型组比较 , “ p < o , 05 ; 与青藤碱
10 协m o l / L 比较 , △ P < 0 . 0 5
7 2 0() 0
9 2 0 ()D
M M P
一
9
MM P一2
A B C D E
A 一 E 意义同图 2
图 4 肾小管上皮细胞明胶酶活性的表达 (明胶酶谱法 )
讨 论
小管基底膜裂解和小管细胞穿过基底膜向间充质
迁移有关 。
青藤碱的抗炎作用可通过下调人外周血单个
核细胞环氧化酶 活性及其基 因表达和 IL 一甲 和
xL
一
8 的基因表达川 ,抑制 N F 一 K B P 6 5 核移位和 I K B 一。
降解以及降低 IC A M 一 1 的表达等起作用川 。 青藤碱
能够明显改善肾小球内细胞浸润 、 降低血肌配 、 尿
素氮含量 ,保护肾功能等 8[, ” 〕。 但 目前未有其防治
和抑制肾间质纤维化或肾小管上皮细胞转分化的
相关研究报道 。 我们的实验结果显示 , 在 10 、 10
及 5 0 卜m ol / L 浓度时 , 青藤碱对肾小管上皮细胞
毒性不明显 , 但均可显著下调 IL 一 1日诱导的肾小管
上皮细胞 a 一 SM A 、 iV m 的基因表达和降低 a 一 SM A 、
vi m 的蛋白表达 ,并呈剂量依赖性 。 细胞上清液明
胶酶活性也显著下降 。 提示青藤碱可抑制 I L 一 l p
诱导的肾小管上皮细胞表型转化 , 同时可防止小
管基底膜的降解和小管细胞的迁移 。
本研究从细胞分子学角度探讨了青藤碱对肾
小管上皮细胞表型转化的防治作用 , 客观地反映
了青藤碱对肾脏局部炎症反应的抑制 , 有利于预
防肾间质纤维化和保护肾功能 。
目前研究证实 ,肌成纤维细胞与肾间质纤维化
的发生关系最为密切 , 其数量增加部分归因于肾
小管上皮细胞的转分化川 。 炎症损伤是间质纤维化
发生发展的重要因素 。 I L一 l p 是各种肾脏疾病过程
中炎性浸润细胞分泌的重要炎症介质 , 可促使肾
小管上皮细胞向肌成纤维细胞转化 , 引起细胞内
结构蛋白表型发生蛋 白和基因水平上 的改变川 。
我们研究结果显示 , 在 I L 一 1日浓度为 10 gn / ml 时
24 h 可诱导小鼠肾小管上皮细胞株 M C T 。 一 SM A 、
vi m 基因表达 的显著增加 ; 72 h 可显著上调原代
小 鼠肾小管上皮细胞 a 一 S M A 、 iV m 的蛋白表达 。
于此同时肾小管上皮细胞上清液中明胶酶 M M P -
2 和 M M P 一 9 的活性亦显著增高 。 结果证实 , 在 I L -
堆 的刺激下 , 肾小管上皮细胞可转化为肌成纤维
细胞 。 在不同实验中发现 , 在早期 U U O 模型中伴
随着肾小管上皮细胞的表型转化和 向间充质的迁
移 , 明胶酶活性显著较假手术组增高 ;而到了间质
纤维化后期明胶酶活性又降低 [5 , 6 〕。 明胶酶活性的
时相性变化与小管上皮细胞转化后向间充质迁移
以及后期细胞外基质过度积聚有关民 6〕。 在此项体
外实验中亦证实 , 在肾小管上皮细胞发生表型转
化的同时 , 伴随着明胶酶活性的显著增高 , 可能与
参 考 文 献
王文君 , 王培训 , 李晓娟 . 青藤碱抗炎机理— 青藤碱对人外周血单个核细胞环氧化酶活性及其基因表达的影响 .中
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(收稿 日期 : 2 0 0 5 一 12 一 2 6 )
(本文编辑 :李耀荣 )