全 文 :第36卷 第3期
2014年9月
延 边 大 学 农 学 学 报
Journal of Agricultural Science Yanbian University
Vol.36No.3
Sep.2014
收稿日期:2014-06-10 基金项目:吉林省教育厅(吉教科合字[2013]第8号)
作者简介:崔福顺(1966—),女(朝鲜族),吉林珲春人,副教授,硕士,研究方向为食品科学。
美味牛肝菌总三萜提取及大孔树脂纯化工艺研究
崔福顺, 崔泰花
(延边大学农学院食品科学系,吉林 延吉133002)
摘要:对长白山美味牛肝菌总三萜进行超声提取及纯化研究。以齐墩果酸为标准品,总三萜提取率为指标,
采用正交试验确定了美味牛肝菌总三萜提取的最佳条件,并利用X-5大孔树脂进行了纯化试验。结果表明:
美味牛肝菌总三萜最佳提取工艺条件为乙醇体积分数80%、超声功率400W、超声温度80℃、超声时间
30min,X-5大孔树脂最佳纯化条件为吸附时间3h、解吸时间3h、解吸液乙醇体积分数100%。
关键词:美味牛肝菌;总三萜;提取;纯化
Optimization of ultrasound-assisted extraction and
purification of the total triterpenoids from Boletus edulis
CUI Fushun, CUI Taihua
(Food Department,Agricultural College of Yanbian University,Yanji Jilin 133002,China)
Abstract:Ultrasound-assisted extraction and purification of total triterpenoids from Boletus
edulis were investigated.Effect of ethanol concentration,ultrasonic power,ultrasonic tem-
perature and ultrasonic extraction time on extraction yield of total triterpenoids was investi-
gated by the single-factor experiments,and the orthogonal test was used to optimize extrac-
tion parameters.X-5macroporous resins was selected to purify total triterpenoids.The re-
sults showed that the optimum extraction condition of ultrasonic assisted extraction was:
ethanol concentration 80%,ultrasonic power 400W,ultrasonic temperature 80℃,extrac-
tion 30min.The optimum purification condition was:adsorption time 3h,desorption time
3h,desorption liquid ethanol concentration 100%.
Key words:Boletus edulis;total triterpenoids;extraction;purification
中图分类号:Q 949.3 文献标识码:A 文章编号:1004-7999(2014)03-0252-06
美味牛肝菌(Boletus edulis)又名白牛肝菌、大脚菇,属伞菌目、牛肝菌科、牛肝菌属。菌盖扁半球形或
稍平展,呈黄褐色、土褐色或赤褐色。美味牛肝菌是世界性广泛分布的食用菌,我国各省均有分布。吉林省
美味牛肝菌的产量较为丰富,其味道鲜美、香味浓郁、含有多种人体所需的营养成分[1-2],并有广泛的生理活
性,所含的多糖等物质具有抗氧化[3]、抗突变[4]、抗肿瘤[5]等作用。目前,对食用菌生物活性成分的研究较
多,对美味牛肝菌主要集中在多糖、黄酮的提取及抗氧化活性[6-7]的研究,对三萜类物质的提取及功能活性的
研究还鲜有报道。三萜类化合物具有较高的生理活性,只有调节免疫系统、心血管系统、抗衰老、抗肿瘤的作
用,还有解毒保肝、消炎、止咳、阵痛等诸多功效,具有较高的开发价值[8]。因此,本试验利用现代超声波技
第3期 崔福顺,等:美味牛肝菌总三萜提取及大孔树脂纯化工艺研究
术,在单因素试验基础上,通过正交试验优化美味牛肝菌中总三萜的提取工艺,并利用大孔树脂X-5进行纯
化[9],为美味牛肝菌进一步综合开发利用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
美味牛肝菌(安图县农业技术推广总站);齐墩果酸(中国药品生物制品检定所);香草醛、高氯酸、冰醋
酸、无水乙醇等(国产分析纯);X-5大孔树脂(天津南开大学化工厂)。
1.2 仪器设备
101型电热恒温鼓风干燥箱(中国天津泰斯特仪器有限公司);Z400K大容量速冻离心机(德国哈默);
KQ-500D医用数控超声波清洗器(昆山市超生仪器有限公司);UV-7504型紫外可见分光光度计(上海欣茂
仪器有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 美味牛肝菌总三萜的提取
将美味牛肝菌干燥后粉碎至20~40目,准确称取,以料液比1∶20(g/mL)浸泡30min,超声提取后
5 000r/min离心15min,上清液定容得提取液,测吸光度。
1.3.2 标准曲线的绘制
准确称取经干燥处理的齐墩果酸标准品3.4mg,用无水乙醇溶解定容至25mL,配成质量浓度为
0.136mg/mL的标准品溶液。精确吸取标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL分别置于试管
中,沸水浴挥干乙醇后加5%香草醛-冰醋酸液0.2mL及高氯酸0.8mL,置60℃水浴15min后冷却,再加
冰醋酸定容至5.0mL,摇匀。以未加标准品的比色液做空白,波长547nm处测定吸光度。以齐墩果酸的
质量为横坐标,以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。可得到回归方程:y=0.004 x-0.049 4,R2=0.998 7。
1.3.3 总三萜含量的测定及提取率的计算
准确吸取0.2mL提取液,按上述标准曲线制备操作步骤测定吸光度;利用标准曲线计算提取液中总三
萜含量;利用如下公式计算总三萜提取率。
提取率/% = X×V×10
-6
m×V0 ×100
式中:X 为根据标准曲线计算出的总三萜含量/μg;m 为美味牛肝菌质量/g;V 为待测液定容总体积/
mL;V0为测定吸光度用样液的体积/mL。
1.3.4 单因素试验及正交优化试验设计
采用超声波辅助提取技术,以乙醇体积分数、超声提取功率、超声提取温度及超声提取时间进行影响美味
牛肝菌总三萜提取率的单因素试验。在单因素试验基础上,采用L9(34)进行正交优化试验。因素水平见表1。
表1 L9(34)正交试验因素水平表
Table 1 Factors level of L9(34)orthogonal experiments
水平
Level
因素Factor
A(乙醇体积分数/%)
Ethanol concentration
B(超声提取功率/W)
Ultrasonic wave power
C(超声提取温度/℃)
Ultrasonic wave temperature
D(超声提取时间/min)
Ultrasonic wave time
1 80 300 60 20
2 90 350 70 30
3 95 400 80 40
1.3.5 X-5大孔树脂纯化
利用X-5大孔树脂以吸附时间、解吸时间和解吸液乙醇体积分数分别进行美味牛肝菌提取液大孔树脂
纯化试验,以确定最佳吸附时间、解吸时间及解吸液乙醇体积分数。
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延 边 大 学 农 学 学 报 第36卷
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇体积分数对美味牛肝菌总三萜提取率的影响
在固定料液比1∶20(g/mL)、超声提取功率300W、超声提取温度60℃条件下,分别采用乙醇体积分
数60%、70%、80%、90%和95%对美味牛肝菌总三萜进行超声提取,时间30min(图1)。
图1 乙醇体积分数对提取率的影响 图2 超声提取功率对提取率的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction Fig.2 Effect of ultrasonic wave power on extraction
rate of total triterpenoids from Boletus edulis rate of total triterpenoids from Boletus edulis
由图1可知:在乙醇体积分数小于80%时,随着乙醇体积分数的增加,美味牛肝菌总三萜的提取率逐渐
增大,当达到90%时最大,随后又下降。可能是因为三萜类的总组分是弱极性物质,与90%乙醇的极性最为
接近,根据相似相容原理,在此浓度下溶解三萜类物质能力达到最高[10-11]。
2.1.2 超声提取功率对美味牛肝菌总三萜提取率的影响
在固定料液比1∶20、乙醇体积分数80%、超声提取温度60℃条件下,分别采用超声提取功率200、
250、300、350和400W 对美味牛肝菌总三萜进行提取,时间30min(图2)。
由图2可知:当超声提取功率增加时,美味牛肝菌总三萜的提取率呈上升趋势,350W 时达到最高,之后
又有所下降。可能是由于超声功率过高,超声波对美味牛肝菌组织结构产生破坏作用,使组织中的微小淀粉
颗粒析出并吸附与总三萜类物质上[12],导致美味牛肝菌总三萜类物质提取率下降。
2.1.3 超声提取温度对美味牛肝菌总三萜提取率的影响
在固定料液比1∶20、乙醇体积分数80%、超声提取功率300W 的条件下,分别采用超声提取温度40、
50、60、70和80℃提取美味牛肝菌总三萜,超声提取时间30min(图3)。
由图3可知:随着提取温度的上升,美味牛肝菌总三萜提取率也呈上升趋势,70℃时达到最高。原因可
能是较高的温度对三萜类化合物的溶出有利,而在80℃时有下降趋势是因为其它物质溶出量增加的缘
故[13]。本试验选择60、70和80℃超声提取温度作为正交试验的3个水平。
2.1.4 超声提取时间对美味牛肝菌总三萜提取率的影响
在固定料液比1∶20、超声提取温度60℃、乙醇体积分数80%及超声提取功率300W 的条件下,分别
以10、20、30、40和50min提取美味牛肝菌总三萜(图4)。
由图4可知:超声提取时间总体相差不大,随着超声提取时间的增加,美味牛肝菌总三萜提取率也增加,
30min时达到最高。原因可能是在30min提取后美味牛肝菌中的三萜类总成分溶解已接近饱和使其溶解
能力降低;也可能是在提取溶剂量不变的情况下,其它物质溶出,影响了三萜物质的溶出。
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第3期 崔福顺,等:美味牛肝菌总三萜提取及大孔树脂纯化工艺研究
图3 超声提取温度对提取率的影响 图4 超声提取时间对提取率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic wave temperature on extraction Fig.4 Effect of ultrasonic wave time on extraction
rate of total triterpenoids from Boletus edulis rate of total triterpenoids from Boletus edulis
2.2 正交优化试验设计及结果
在单因素试验基础上采用L9(34)正交试验进行提取条件的优化。美味牛肝菌总三萜提取正交试验设
计及结果见表2。
表2 L9(34)正交试验设计及结果
Table 2 Design and results of L9(34)orthogonal experiments
序号
No.
因素Factor
A B C D
总三萜提取率/%
Extraction of total triterpenoids
1 1 1 3 2 0.71
2 2 1 2 3 0.65
3 3 1 1 1 0.52
4 1 2 1 3 0.77
5 2 2 3 1 0.69
6 3 2 2 2 0.61
7 1 3 2 1 0.72
8 2 3 3 2 0.77
9 3 3 1 3 0.64
K1 2.20 1.88 1.92 1.93
K2 2.11 2.06 1.98 2.09
K3 1.76 2.13 2.17 2.05
k1 0.73 0.62 0.64 0.64
k2 0.70 0.69 0.66 0.70
k3 0.59 0.71 0.72 0.68
R 0.14 0.09 0.08 0.06
因素影响:A>B>C>D
由表2极差可见:各因素对美味牛肝菌总三萜含量的影响从大到小依次为A>B>C>D,即乙醇体积分
数>超声提取功率>超声提取温度>超声提取时间;美味牛肝菌总三萜最佳提取条件为A1B3C3D2,即乙醇
体积分数80%、超声提取功率400W、超声提取温度80℃、超声提取时间30min。在最佳条件下对美味牛
肝菌总三萜提取进行了验证,提取率达到0.78%。
2.3 X-5大孔树脂纯化
2.3.1 最佳吸附时间的确定
分别称取经预处理的树脂各1.0g,放置在8个三角瓶中,加入20mL美味牛肝菌三萜粗提液,放置
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20℃振荡,吸附时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0和5.0h,过滤,测滤液的吸光度。
图5 吸附时间对纯化效果的影响 图6 解吸时间对纯化效果的影响
Fig.5 Effect of adsorption time on purification Fig.6 Effect of resolution time on purification
由图5可知:随着吸附时间的延长,滤液的吸光度呈下降趋势,到3h时基本上达到平稳。说明大孔树
脂对总三萜的吸附趋于饱和,因此,确定静态最佳吸附时间为3h。
2.3.2 最佳解吸时间的确定
分别称取经预处理的树脂各1.0g,放置在8个三角瓶中,加入20mL美味牛肝菌三萜粗提液,放置
20℃振荡,吸附时间为3h,过滤。在吸附总三萜的树脂中加入解吸液70%乙醇,解吸时间分别为0.5、1.0、
1.5、2.0、2.5、3.0、4.0和5.0h,过滤,测滤液的吸光度。
由图6可知:随着解吸时间的延长,滤液中的总三萜吸光度也随着增加,达到3h后增加不大。因此,确
定最佳解吸时间为3h。
2.3.3 最佳解吸液乙醇体积分数的确定
分别称取经预处理的树脂各1.0g,放置在6个三角瓶中,加入20mL美味牛肝菌三萜粗提液,放置
20℃振荡,吸附时间为3h,过滤,在吸附总三萜的树脂中加入解吸液,解吸液乙醇体积分数分别为50%、
60%、70%、80%、90%和100%,解吸时间3h,过滤,测滤液的吸光度。
图7 解吸液乙醇体积分数对纯化效果的影响
Fig.7 The effect of concentration of ethanol in analytical solution on purification
由图7可知:随着解吸液乙醇体积分数的增加,解吸液中总三萜的浓度呈上升趋势。100%乙醇吸附效
果最佳,因此,确定最佳解吸液乙醇体积分数为100%。
在最佳吸附时间3h、解吸时间3h、解吸液乙醇体积分数100%的条件下,对X-5大孔树脂纯化前后提
取物中总三萜含量进行了测定,结果含量从14.63%提高到73.75%;但得出率从22.18%下降到1.4%。
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第3期 崔福顺,等:美味牛肝菌总三萜提取及大孔树脂纯化工艺研究
3 讨论与结论
以提取率为指标,采用单因素及正交试验对美味牛肝菌总三萜的提取工艺进行了研究,结果确定最佳提
取条件为A1B3C3D2,即乙醇体积分数80%、超声提取功率400W、超声提取温度80℃、超声提取时间
30min,提取率达0.78%。采用X-5大孔树脂,当吸附时间为3h、解吸时间3h及解吸液乙醇体积分数
100%时,美味牛肝菌总三萜的纯度由原来的14.63%提高为73.75%。
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