全 文 ：［收稿日期］ 20140311(002)
［基金项目］ 济宁医学院青年基金项目(JYQ2011KM027)
［通讯作者］ * 崔晓秋，硕士，讲师，从事天然产物化学及新药研发工作，Tel:13793406846，E － mail:cuixqiu@ 163． com
HPLC测定新疆紫草中紫草素的含量及提取方法的优化
崔晓秋1* ，刘云刚2
( 1. 济宁医学院药学院，山东 日照 276826; 2. 岚山生化有限公司，山东 日照 276800)
［摘要］ 目的:采用超声方法提取新疆紫草中紫草素，并以左旋紫草素为指标，建立 HPLC测定紫草素的含量。方法:利
用超声波协同甲醇提取 40 min;色谱条件为 Shim-pack CLC-ODS-18 色谱柱 (4. 6 mm × 250 mm，10 μm) ，检测波长 516 nm，流
动相甲醇-水(85∶ 15) ，流速 1. 0 mL·min －1，柱温室温。结果:左旋紫草素进样量在 0. 127 ～ 1. 143 μg具有良好的线性关系，回
归方程为 Y = 338 763X － 198 347(r = 0. 999 8) ，平均回收率 99. 3%，ＲSD 1. 18%，左旋紫草素超声法提取率是回流提取法的
1. 29 倍。结论:经方法学验证，该实验所采用的实验方法重复性好、稳定、准确、可靠，可用于中药紫草药材中紫草素的含量
测定。
［关键词］ 左旋紫草素;高效液相色谱;超声波辅助提取;紫草
［中图分类号］ Ｒ284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2014)16-0094-04
［doi］ 10． 13422 / j． cnki． syfjx． 2014160094
Ultrasonic-assisted Extraction and Content Determination
of Shikonin from Arnebiae Ｒadix by HPLC
CUI Xiao-qiu1* ，LIU Yun-gang2
(1. Jining Medical College，Ｒizhao 276826，China;2. Lanshan Biochemistry Co． Ltd，Ｒizhao 276800，China)
［Abstract］ Objective:To develop a method for ultrasonic-assisted extraction and high performance liquid
chromatography (HPLC) determination of shikonin in the roots of Arnebiae Ｒadix． Method:Shikonin was
extracted by ultrasonic-assisted-methyl alcohol method． The HPLC determination condition consisted of Shim-pack
CLC-ODS-18 (4. 6 mm × 250 mm，10 μm)and shikonin was detected at 516 nm wavelength by using methyl
alcohol-water (85∶15) as the mobile phase，column temperature at room temperature and flow rate 1. 0 mL·
min －1 ． Ｒesult:Shikonin had a good linearity relation in the range 0. 127-1. 143 μg (r = 0. 999 8 ) ，regressive
equation were Y = 338 763X － 198 347． The average recovery was 99. 3%，ＲSD 1. 18% (n = 6)． In contrast
with refluxing process，the extraction efficiency of ultrasonic extraction was 1. 29 times． Conclusion:The methods
of ultrasonic extraction and HPLC determination were proved to be accurate，reliable and repeatable． It can be used
to determine natural shikonin content of Arnebiae Ｒadix easily．
［Key words］ shikonin;HPLC;ultrasonic-assisted extract;Arnebiae Ｒadix
新疆紫草主产于我国新疆维吾尔族自治区，是
中医临床常用药材，其主要活性成分是脂溶性的萘
醌类天然色素 ——— 紫草素及其衍生物，此外还含
有多糖、生物碱、三萜酸、苯醌等多种化学成分［1］。
紫草的提取方法主要有渗漉法［2］、浸渍法［3］、回流
提取法［4］及微波提取法［5］等，不同的提取方法对紫
草素的提取率均有很大的影响。本研究中采用超声
波提取法对紫草素进行提取，并与回流提取法进行
比较，旨在最大限度地提高左旋紫草素的提取率。
左旋紫草素的含量测定方法主要有高效毛细管
电泳法［6］、高效液相色谱法［7］等，其中以高效液相
色谱法更为常见。流动相多数使用酸水系统如乙
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Vol． 20，No． 16
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腈-水-甲酸(700 ∶ 300 ∶ 0. 5)［8］、甲醇-水-磷酸(78 ∶
22∶ 0. 3)［9］等。在流动相中加入酸，主要是为了抑
制化合物的电离、提高柱效、改善峰形，但酸的加入
影响柱子使用寿命。本研究经过反复尝试，确定了
不加酸即可进行有效分离紫草素的最佳高效液相色
谱条件，为紫草中左旋紫草素的含量测定提供参考。
1 材料
紫草药材购于日照市中医院，经山东中医药大
学中药学院郭庆梅教授鉴定为新疆紫草 Arnebia
euchroma (Ｒoyle)Johnst．干燥根。
KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声
仪器有限公司 ) ，BSA224S 型电子分析天平(北京
赛多利斯) ，LC-6AD 高效液相色谱仪系列(包括
SIL-10AF 泵，SPD-20A 紫外 检 测 器，CTO-20AC
column oven and class-vp 色谱工作站，日本岛津)。
左旋紫草素对照品由中国食品药品检定研究院
提供(批号 110769-200405) ，甲醇为色谱纯(天津永
大化学试剂有限公司) ，其余试剂均为分析纯，水为
娃哈哈纯净水。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 Shim-pack CLC- ODS-18 色谱柱
(4. 6 mm × 250 mm，10 μm) ，流动相甲醇-水(85 ∶
15)。流速 1. 0 mL·min －1，检测波长 516 nm，柱温为
室温。
2. 2 方法学考察
2. 2. 1 对照品溶液制备 精密称取左旋紫草素对
照品 1. 900 mg，甲醇溶解，制成 1. 270 g·L －1的贮备
液。精密移取 1 mL 贮备液，加甲醇稀释并定容至
10 mL量瓶中，即得含有左旋紫草素 0. 127 g·L －1的
对照品溶液。
2. 2. 2 供试品溶液制备 准确称取相同批次的新
疆紫草药材粉末2. 003 5 g，置于 250 mL 锥形瓶中。
准确加入 100 mL 甲醇，100 MHz 超声提取 40 min，
严格确保超声前后重量一致，过滤。滤渣再以同法
提取 1 次，将两次甲醇提取液合并，采用旋转蒸发仪
将其浓缩至干，再以液相甲醇溶解并定容至 10 mL
量瓶中，即得供试品溶液，备用。
2. 2. 3 线性关系考察 分别精密吸取对照品
(0. 127 g·L －1)溶液 1，3，5，7，9 μL，经 0. 45 μm 微
孔滤膜过滤后，注入高效液相色谱仪，每个进样量平
行测定 3 次，记录测得的峰面积数据，取平均值。利
用 Excel 表格绘制标准曲线，得回归方程为 Y =
338 763X － 198 347，其中纵坐标(Y)为峰面积，横坐
标 (X)为 进 样 量，检 测 下 限 为 0. 012 7 μg
(r = 0. 999 8)。结果表明进样量在 0. 127 ～ 1. 143
μg峰面积与进样量呈良好线性关系。
2. 2. 4 精密度试验 分别精密吸取对照品溶液
(0. 127 g·L －1) ，每次 5 μL，按照确定的色谱条件连
续重复进样 6 次，测定左旋紫草素的峰面积，并计算
ＲSD 0. 09%，由此可知仪器的精密度良好。
2. 2. 5 稳定性试验 取同一批号紫草样品粉末，按
2. 2. 2 项下样品制备方法，制备供试品溶液，分别在
0，2，4，6，8，10，24 h 进行测定，记录峰面积，结果左
旋紫草素相 ＲSD 0. 87%，表明供试品溶液在 24 h内
稳定性良好。
2. 2. 5 加样回收试验 准确称取已知含量的同一
批次紫草样品粉末共 6 份，每份约 0. 5 g，分别精密
加入左旋紫草素对照品(0. 127 g·L －1)2 mL，按
2. 2. 2 项下方法制备供试品溶液，以设定的色谱条
件进行测定，左旋紫草素的平均回收率为 99. 3%，
ＲSD 1. 18%，说明该方法准确可靠。结果见表 1。
表 1 紫草甲醇提取物加样回收率
No．
称样量
/ g
样品中量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均
值 /%
ＲSD
/%
1 0． 503 5 0． 204 7 0． 253 3 99． 7
2 0． 502 5 0． 203 2 0． 254 3 100． 1
3 0． 504 0 0． 208 8 0． 247 6 97． 5
99. 3 1. 18
4 0． 503 6 0． 209 2 0． 249 1 98． 1
5 0． 503 5 0． 203 6 0． 254 2 100． 1
6 0． 503 2 0． 203 0 0． 254 7 100． 2
注:加入量均为 0. 254 mg。
2. 3 紫草提取方法的优化
2. 3. 1 最佳提取溶剂选择 称取同一批次干燥紫
草药材粉末 4 份，置锥形瓶中，分别用石油醚、甲醇、
乙醚、95%乙醇 4 种溶剂浸泡 24 h，浸泡过程中将瓶
口封住，以防溶剂挥发。4 份紫草粉末均以 100
MHz超声提取 2 次，每次 30 min，两次滤液合并，旋
转蒸发仪浓缩至干，再以甲醇溶解定容于 10 mL 量
瓶中，摇匀，采用 2. 1 项下色谱条件进行含量测定。
4 种溶剂提取所得左旋紫草素的提取率分别为
0. 670 3，0. 673 8，0. 537 6，0. 629 7 mg·g －1，因此本
实验选择甲醇进行超声提取。
2. 3. 2 最佳提取时间的选择 称取 4 份同批次干
燥至恒重的紫草，以粉碎机适当粉碎，并用甲醇超声
提取，时间分别为 10，30，40，50 min。在不同提取时
间下，左旋紫草素的提取率分别为 0. 369 4，
0. 652 9，0. 688 6，0. 554 2 mg·g －1。因此，最佳提取
·59·
崔晓秋，等:HPLC测定新疆紫草中紫草素的含量及提取方法的优化
时间定为 40 min。
2. 4 样品含量测定 取供试品溶液，经 0. 45 μm
微孔滤膜过滤后，连续 3 次，精密吸取 10 μL注入高
效液相色谱仪，根据标准曲线所得回归方程，利用峰
面积平均值，计算每克紫草中左旋紫草素含量为
0. 964 5 mg。对照品和供试品的高效液相色谱图见
图 1。
A. 对照品;B. 样品;1. 左旋紫草素
图 1 紫草 HPLC
2. 5 超声波提取法与回流提取法比较 为了验证
超声波提取法的确具有提取率高、时间短、速度快的
优点，我们选取了 10 批次新疆紫草样品，分别进行
超声提取与回流提取，比较左旋紫草素提取率。称
取紫草药材粉末，每份约 2 g 左右，超声提取法按
2. 3. 2 操作。回流提取时将样品粉末置于圆底烧瓶
中，各加入甲醇 100 mL，水浴温度 40 ℃，每份样品
均回流提取 40 min，旋转蒸发仪回收溶剂至干。所
得提取物均采用甲醇溶解，置 10 mL量瓶中，以甲醇
定容至刻度，作为供试品溶液。经微孔滤膜过滤后，
每次进样 10 μL，注入高效液相色谱仪，每份平行进
样 3 次，记录峰面积，取平均值计算提取率。两种提
取方法结果比较如表 2。
3 讨论
由于紫草中主要成分为萘醌类色素混合物，基
本母核相同，有相同吸收。我们通过外标法依据对
照品保留时间，确定提取物中左旋紫草素吸收峰。
考虑在 516 nm下左旋紫草素与附近各峰能实现基
线分离，且杂峰少，因此，将 516 nm选为本实验的最
佳检测波长。
超声提取过程中，由于超声波的物化作用，促使
超声温度不断升高，因此，为保证恒温提取，试验时
将超声波清洗器接上循环水，以确保温度变化幅度
表 2 两种不同提取方法左旋紫草素提取率比较
提取方法 批次
样品量
/ g
左旋紫草素
提取率 /%
提取率
平均值 /%
超声提取 1 2． 002 5 1． 929 0 1． 918 7
2 2． 002 6 1． 910 4
3 2． 002 9 1． 917 0
4 2． 003 4 1． 929 0
5 2． 003 2 1． 905 0
6 2． 003 5 1． 917 0
7 2． 002 7 1． 929 0
8 2． 003 5 1． 919 7
9 2． 002 8 1． 927 0
10 2． 002 5 1． 903 7
回流提取 1 2． 002 3 1． 482 0 1． 485 0
2 2． 002 5 1． 481 6
3 2． 002 3 1． 481 0
4 2． 002 3 1． 480 7
5 2． 002 4 1． 482 0
6 2． 002 8 1． 481 6
7 2． 002 6 1． 490 6
8 2． 003 0 1． 493 7
9 2． 002 8 1． 489 3
10 2． 002 3 1． 487 6
注:提取时间均为 40 min，提取温度均为 40 ℃。
不超过 2 ℃。
曾尝试采用手动进样方式，但操作误差较大，
因此，最终使用了自动进样器进样，避免了手动误
差;也参照文献尝试过各种不同的流动相及色谱
柱，结果发现，加酸水作为流动相时进样前后均需
要长时间冲洗，实验效率低。因此，经过不断改
进，确定了不加酸水即可进行有效分离的色谱
条件。
通过本项实验研究，利用超声波协同甲醇提取
法，对新疆紫草中的紫草素进行了提取。比较了超
声波提取法与回流提取法，结果表明，同样的时间，
同样的温度下，超声波提取法收率更高。确定了紫
草素的 HPLC测定方法，且严格经过方法学考察，该
方法准确、操作简便，适合于对紫草药材粉末中紫草
素的质量控制。
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［责任编辑 顾雪竹］
［收稿日期］ 20140430(018)
［通讯作者］ * 杨永红，硕士，副主任技师，从事生化免疫学研究，Tel:13511905061，E-mail:2301444608@ qq． com
丹栀逍遥散 6 种有效成分的 HPLC测定
杨永红*
［摘要］ 目的:建立丹栀逍遥散制剂中有效成分栀子苷、中京尼平苷、芍药内酯苷、甘草甜素、芍药苷以及牡丹酚 6 种成
分的测定分析方法。方法:采用 HPLC，Cosmosil 5C18色谱柱，(4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，流动相乙腈-0. 5%磷酸水(15∶ 85)梯
度洗脱，流速 1. 0 mL·min －1，波长 230 nm。结果:根据上述方法可在 90 min内成功地分离丹栀逍遥散中栀子苷、京尼平苷、芍
药内酯苷、甘草甜素、芍药苷以及牡丹酚 6 个指标成分，在丹栀逍遥散中各成分质量分数为栀子苷 1. 203 mg·g －1，京尼平苷
1. 960 mg·g －1，芍药内酯苷 6. 720 mg·g －1，甘草甜素 0. 157 mg·g －1，芍药苷 0. 012 mg·g －1，牡丹酚 0. 127 mg·g －1。结论:该方法
可用于丹栀逍遥散中栀子苷、京尼平苷、芍药内酯苷、甘草甜素、芍药苷以及牡丹酚的测定，操作简单、结果准确、回收率高、重
复性好，可用于丹栀逍遥散及其相关制剂的质量控制。
［关键词］ 丹栀逍遥散;栀子苷;京尼平苷;芍药内酯苷;甘草甜素;芍药苷;牡丹酚
［中图分类号］ Ｒ284． 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2014)16-0097-03
［doi］ 10． 13422 / j． cnki． syfjx． 2014160097
Simultaneous Determination of Six Constituents in Danzhi Xiaoyaosan by HPLC
YANG Yong-hong*
(Guizhou Province Osteological Hospital，Guiyang 5500 7，China)
［Abstract］ Objective:To establish a method for simultaneous determination of gardenin，geniposide，
albiflorin，paeoniflorin，liquiritigenin，paeonol in Danzhi Xiaoyaosan by HPLC． Method:The Cosmosil 5 C18
column (4. 6 mm ×250 mm，5 μm)was used with a mobile phase of acetonitrile (A)-0. 5% phosphoric acid
solution (B)gradient elution，the flow rate was 1 mL·min －1，and the detection wave-lengths were set at 230 nm．
Ｒesult:The linear ranges were 0. 009 46-0. 946 mg·L －1 for gardenin，0. 009 58-0. 958 mg·L －1 for geniposide，
0. 008 68-0. 868 mg·L －1 for albiflorin，0. 004 88-0. 488 mg·L －1 for paeoniflorin，25. 0-500 mg·L －1 for
liquiritigenin，25. 0-500 mg·L －1 for paeonol respectively． The average recoveries of three constituents were
96. 1%，104. 3%，100. 5%，94. 7%，97. 4%，95. 4% with the ＲSD of 1. 32%，2. 55%，0. 67%，1. 29%，
1. 36%，2. 38% ． The contents of six compounds，gardenin，geniposide，albiflorin，paeoniflorin，liquiritigenin，
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Aug．，2014
(贵州省骨科医院检验科，贵阳 550007)
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