全 文 ：2007年第06期
Vol.28,No.06,2007
食品工业科技
海水小球藻生产叶黄素的研究
韩春然,马永强,孙冰玉
(哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江哈尔滨150076)
摘 要:为了扩大叶黄素资源,降低其生产成本,研究了圆形海水
小球藻异养培养的最佳生长条件和发酵生产叶黄素的条
件,并探讨了高细胞浓度培养小球藻生产叶黄素的可行
性。结果表明,异养培养海水小球藻发酵生产叶黄素的最
佳条件为:含葡萄糖10g/L、尿素0.5g/L的BG-11培养基,
培养温度28℃,培养基起始pH7.0,接种量10%(v/v),培养
8d。利用40g/L的葡萄糖进行海水小球藻的高细胞浓度
培养,可以使叶黄素的产量达到0.926mg/g。
关键词:海水小球藻,叶黄素,异养培养
Abstract:Inordertoexpandthesourceofluteinandlowerthe
producing cost,the optimum growth and lutein
producing conditionsofChlorelaprotothecoidesin
heterotrophic cultivation were studied,and the
possibility ofproducing lutein by concentrated
Chlorelaprotothecoidescels was discussed.The
resultshowedthattheoptimum luteinproducing
conditionswereasfolows:BG-11medium with
10g/Lglucoseand0.5g/Lurea,inoculationamount
10%(v/v),originalpH7.0,28°C,8days.0.926mg/g
luteinwasobtainedbytheconcentratedChlorela
protothecoides cels with 40g/L glucose in the
medium.
Key words:Chlorela protothecoides; lutein; heterotrophic
cultivation
中图分类号:TS202.3 文献标识码:A
文 章 编 号 :1002-0306(2007)06-0187-03
收稿日期:2006-10-16
作者简介:韩春然(1970-),女,讲师,研究方向:食品微生物。
叶黄素(lutein)属于类胡萝卜素之一,广泛存在于
蔬菜、花卉、水果等高等植物与某些藻类生物中[1]。叶
黄素具有重要的生理功能,如它具有抗氧化功能[2],对
老年性眼球视网膜黄斑退化引起的视力下降和失明
有预防的效果[3];对心血管疾病、白内障以及癌症的
治愈也都有明显的功效[2]。美国FDA于1995年将叶
黄素列入了食物添加剂名单。人和动物自身不能合
成叶黄素,只能从食品和饲料中获得,在我国,叶黄
素的生产主要以从天然植物中提取为主。小球藻为
绿藻门小球藻属(Chlorela)普生性单细胞绿藻,属单
细胞真核生物。它对生长条件要求简单,环境耐受性
强,繁殖速率高,人工培养较易[4]。同高等植物相比,
利用藻类生产叶黄素更有优势,因为藻类可以在生
物反应器中连续培养,不受气候、季节和区域的限
制。鉴于传统的开放式光照自养培养存在的许多问
题,本文研究海水小球藻异养培养的特性及生产叶
黄素的方法,旨在为小球藻的开发提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料与设备
海水小球藻(Chlorelaprotothecoides)购自宁波
大学藻类研究所;BG-11培养基[5]。
恒温振荡培养箱 (HZQ-F160A),722型分光光
度,真空冷冻干燥机。
1.2实验方法
1.2.1培养时间和接种量的确定 将活化好的小球
藻二级种子培养液分别以 5%、10%、15%、20%、40%
的接种量接入 BG-11低糖液体培养基 (装液量:
100mL/250mL),28℃下恒温摇床振荡培养。每隔24h
取样一次,连续取样9次,以3,5一二硝基水杨酸比
色法测定藻液中葡萄糖的含量,以血球计数法测定
藻液的细胞数量,并在540nm下测定藻液的吸光光
度值(OD)。
1.2.2海水小球藻异养培养的正交实验 根据本实验
室以前单因素的实验结果,选取对小球藻生长影响
较为显著的四个因素:培养温度、BG-11培养基中葡
萄糖含量、BG-11培养基中尿素含量和培养基起始
pH,按照表1进行正交实验。
1.2.2.1海水小球藻最佳异养培养条件的确定 测定
各培养液在 540nm下的OD值,确定小球藻异氧培
养的最佳条件。
水平
因 素
A温度
(℃)
B葡萄糖
(g/L)
C尿素
(g/L)
D起始pH
1 26 10 0.2 6.0
2 28 20 0.5 6.5
3 30 40 1.0 7.0
表1海水小球藻异养培养最佳条件的因素水平表
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DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2007.06.054
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1.2.2.2异养培养中小球藻生长参数的研究 测定各
培养条件下的细胞干重,计算最大比生长速率(!)和
糖对细胞的转化率(E)。
最大比生长速率:!=(lnC1-lnC2)
(t2-t1)
C1,C2:对数生长期的细胞浓度(106个/mL);t1,
t2:对应的培养时间(d)。
糖对细胞转化率:E=Wmax
G0
Wmax:最大细胞干重(g/L),G0:初始葡萄糖浓度(g/L)。
1.2.2.3小球藻藻粉的制备 收集正交实验中各摇瓶
中的培养液,6000r/min离心4min,弃去上清液,将藻
泥在真空冷冻干燥器中干燥,以研钵磨碎成藻粉,过
60目筛,放入密封容器中,-18℃保存。
1.2.2.4海水小球藻异养培养生产叶黄素最佳条件
的确定 准确称取0.1g藻粉,加入一定体积的有机溶
剂[6],用细胞破碎器破碎,探头转速 10000r/min、破碎
次数2次、破碎时间5min/次、室温,将处理后的溶液
于 6000r/min离心 4min,收集上清液,定容,在
445nm下测定溶液的吸收值。整个提取过程在弱光
下进行,不超过30min,以避免色素的损失。计算叶黄
素的含量[7],以叶黄素产量为指标,确定生产叶黄素的
最佳条件。并计算糖对叶黄素的转化量(T)。
叶黄素含量:L= A×y
A1cm
1%
×100
A:445nm波长下样品吸收值;A1cm
1%
:比吸收系数;
y:样品总体积(mL)。
糖对叶黄素转化量:T=L×Wmax
G0
L:细胞叶黄素含量/mg/g;Wmax:最大细胞干重/g/
L;G0:初始葡萄糖浓度/g/L。
2结果与讨论
2.1异养培养条件的确定
2.1.1培养时间和接种量的确定 在培养的5～8d,培
养基中的葡萄糖基本消耗完毕,而此时的藻细胞仍
处于对数生长期(图1),所实验的5组小球藻基本都
在第6～8d时藻细胞数达到最大。因此,本实验确定
培养时间为8d。
图2是培养8d,小球藻的生长情况与接种量的
关系。当小球藻的接种量小于10%时,随着接种量的
增加,小球藻细胞浓度也增加,但超过 10%后,细胞
浓度随着接种量的增加反而有下降的趋势,这是由
于高细胞浓度的接种量,影响了溶解氧的可利用率。
因此,小球藻异养培养的接种量应该为10%。
一般来说,藻培养液的OD值与细胞浓度之间是
具有较好的正相关关系的,可以通过测定藻液的OD
值来推算细胞数量,但在小球藻的分批异养培养过
程中,培养液浊度与细胞浓度之间的关系受培养条
件和培养过程的影响很大,如果单一地通过吸光值
来推算细胞的浓度,容易产生较大的误差[8],因此,在
进行分批异养培养小球藻时,我们以细胞浓度和藻
液浊度来共同监测藻液的生物量。结果表明,本实验
的细胞浓度曲线和藻液吸光度值曲线的变化趋势还
是十分相似的,因此,后面的实验我们以藻浊液的
OD值来计算小球藻的细胞数量。
2.1.2最佳异养培养条件的确定 图3为海水小球藻
异养培养正交实验的结果,可以看出,6#摇瓶中(培
养条件为,葡萄糖:40g/L,尿素:0.2g/L,培养基初始
pH:6.5,培养温度:28℃),海水小球藻的藻浊液明显
高于其它组。当葡萄糖浓度为10g/L时(1#、4#、7#),小
球藻生长的迟滞期为1d左右,对数生长期为2~3d;
葡萄糖浓度为 20g/L时(2#、5#、8#),小球藻生长的迟
滞期为2d左右,对数生长期为3d左右;而葡萄糖浓
度为40g/L时(3#、6#、9#),小球藻生长周期有所延长,
其迟滞期为 3d,对数生长期为 4d,这是由于高浓度
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底物造成的。
直观分析表明,各因素对异养培养条件下小球
藻的生长的影响顺序是:温度>培养基的初始pH>葡
萄糖浓度>尿素浓度。最佳条件组合应为:A2B3C1D2,
即接种量为10%,培养基中葡萄糖浓度为40g/L,尿
素浓度为0.2g/L,培养基初始pH为6.5,28℃下恒温
摇床培养。这也正是6#摇瓶的培养条件。
2.1.3异养培养中小球藻生长参数的研究 表 2是海
水小球藻在正交实验各条件下的生长参数,葡萄糖
浓度为10g/L(1#、4#、7#)时,能够获得相对较高的比
生长速率和糖对细胞的转化率;葡萄糖浓度为 40g/L
(3#、6#、9#)时,能够获得相对高的生物量。由此可以
看出,以葡萄糖为碳源时,采用 10g/L能得到最大的
比生长速率和最大的糖对细胞转化率,而采用 40g/L
能得到最大的生物量。
2.2小球藻异养培养发酵生产叶黄素的条件研究
在正交实验的条件下,异养培养海水小球藻,叶
黄素含量和糖对叶黄素的转化率见图4。在9个摇瓶
中,4#摇瓶(培养条件为葡萄糖:10g/L,尿素:0.5g/L,
培养基初始 pH:7.0,培养温度:28℃)的叶黄素的产
量和糖对叶黄素的转化率都是最高的,分别达到了
1.45mg/g和 0203。 但我们也发现,叶黄素的含量与
糖对叶黄素的转化率并不完全一致,叶黄素含量最
高的前3个摇瓶为4#>9#>3#,而糖对叶黄素的转化
率排在前三位的是4#>7#>5#。
直观分析表明,各因素对小球藻异养培养条件
下发酵生产叶黄素的影响顺序是:培养基的初始
pH>尿素>葡萄糖浓度>温度。最佳组合应为:
A2B1C2D3,即葡萄糖浓度为10g/L,尿素浓度为0.5g/L,
培养基初始 pH为 7.0,28℃下培养,这也正是 4号
摇瓶的培养条件。
3结论
以上研究表明,海水小球藻最佳异养培养的条
件是 BG-11培养基中葡萄糖浓度 40g/L,尿素浓度
0.2g/L,培养基初始pH6.5,28℃下恒温摇床培养;而
其产生叶黄素的最佳条件是BG-11培养基中葡萄糖
浓度 10g/L,尿素浓度 0.5g/L,培养基初始 pH7.0,
28℃下培养,该条件下海水小球藻异养培养得到的
叶黄素可以达到 1.45mg/g。通过以上的分析,我们
发现,小球藻产叶黄素的最佳条件与小球藻最佳异
养培养条件并不完全一致。那么,通过培养高细胞
浓度的小球藻生产叶黄素是否可行呢?通过比较海
水小球藻的细胞干重和叶黄素产量,我们发现,葡
萄糖浓度为40g/L、细胞干重值最大的9#摇瓶(表2)
产生的叶黄素达到了 0.926mg/g(图 4),仅低于最
优水平 (1.45mg/g),因此,可以将其视为较优水平。
这说明,高细胞浓度培养小球藻生产叶黄素是可
行的。
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生长参数
葡萄糖含量(g/L)
10 20 40
1# 4# 7# 2# 5# 8# 3# 6# 9#
细胞干重(g/L) 1.00 1.40 1.80 0.70 1.90 1.00 1.10 1.80 2.80
最大比生长速率(μ/d) 0.40 0.39 0.29 0.17 0.16 0.14 0.24 0.44 0.29
糖对细胞转化率 0.10 0.14 0.18 0.04 0.10 0.05 0.03 0.05 0.07
表2碳源含量对海水小球藻的生长参数的影响
食品添加剂
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