全 文 ：生 物 工 程 Vol . 33 , No . 09 , 2012
2012年第9期
黑牛肝菌（Boletus aereus）学名枣铜色牛肝菌，
属层菌纲，伞菌目，牛肝菌科，牛肝菌属[1]。黑牛肝菌
生长于海拔900～2200m之间的松栎混交林或砍伐不
久的林缘地带，生长期为每年五月下旬至十月中旬，
在我国四川、云南、贵州等地分布广泛，在欧洲、非洲
等地也有分布，是一种世界性珍稀食用菌[2]。其味道
鲜美、营养价值较高、含有丰富的矿质元素及多种人
体必需氨基酸[3-6]。该菌具有清热解烦、养血和中、追
风散寒、舒筋和血等功效 [7]，可治疗妇女白带症及不
孕症[8]。据报道，黑牛肝菌水提物具有抗癌抗病毒作
用[9-12]。然而，黑牛肝菌子实体的栽培受到气候、季
节、原材料等限制，并且子实体栽培投资大、技术要
求高、生产周期长、生产效率低，导致人工栽培非常
困难[13]。目前黑牛肝菌人工栽培的子实体产量已经
不能满足国内外市场的需求，而采用液体发酵技术
生产菌丝体及代谢产物代替子实体在食品和医药方
面的应用已成为一个新的发展方向[14-16]。液体培养发
酵比固体栽培生产子实体简便、快速、易操作[17-18]。食
用菌液体培养发酵具有生产周期短、菌龄一致、菌种
成本低等优点，目前关于黑牛肝菌菌丝体液体培养
的研究尚未见报道。本实验采用响应曲面法（RMS）[19]
对黑牛肝菌液体发酵培养基和培养条件做了初步探
究，并优化了黑牛肝菌液体发酵条件。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
黑牛肝菌 购于四川省绵阳市食用菌研究所。
YXQ-LS-SⅡ全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅
上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DHG-9140电热
恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；
SW-CJ-2F双人双面净化工作台 苏州净化设备有
限公司；HD-930组合式恒温振荡器 太仓市实验设
备厂。
郭永月1，陶明煊1，*，周 斌1，程光宇2，金邦荃1
（1．南京师范大学金陵女子学院，江苏南京 210097；
2．南京师范大学生命科学学院，江苏南京 210046）
摘 要：讨论了黑牛肝菌液体的发酵培养基最佳组成及培养条件。 采用响应曲面法分析了葡萄糖、蛋白胨、装液量三
个关键影响因素对菌丝体生物量的影响。 结果表明： 黑牛肝菌发酵的最佳培养基为葡萄糖37.5g/L、 蛋白胨8.5g/L、
KH2PO4 2g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、VB1 0.01g/L、CaCO3 2g/L；培养条件为装液量96mL，培养温度28℃，转速160r/min，初始
pH5.5。 此时可达到最大菌丝体生物量25.4801g/L。
关键词：黑牛肝菌，响应曲面法，液体发酵，菌丝体生物量
Optimization of the growth conditions in submerged fermentation of
Boletus aereus
GUO Yong-yue1，TAO Ming-xuan1，*，ZHOU Bin1，CHENG Guang-yu2，JIN Bang-quan1
（1.Ginling College，Nanjing Normal University，Nanjing 210097，China；
2.School of Life Science，Nanjing Normal University，Nanjing 210046，China）
Abstract：The optimal culture medium and fermentation conditions of Boletus aereu in submerged fermentation
were studied. Response surface methodology was used to analyze the effects of the three critical factors on
mycelia biomass. The three critical factors were glucose，peptone and broth fermentation content. The results
showed that the optimal compositions were as follows ：glucose 37.5g/L ，peptone 8.5g/L ，KH2PO4 2g/L ，
MgSO4·7H2O 1g/L，VB1 0.01g/L，CaCO3 2g/L. The fermentation conditions were broth content 96mL，temperature
28℃，rotating speed 160r/min and the initial pH5.5. Under the optimal conditions，the maximal mycelia biomass
was 25.4801g/L.
Key words：Boletus aereus；response surface methodology；submerged fermentation；mycelia biomass
中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2012）09-0183-04
收稿日期：2011－08－18 * 通讯联系人
作者简介：郭永月（1988-），女，硕士研究生，研究方向：生物活性物质
与保健功能因子。
基金项目：江苏省高校自然科学基础研究项目（10KJD550003）；江苏省普
通高校研究生科研创新计划项目（CXLX11_0895）；教学创新
团队建设（181220001517）；优秀课程建设（1812000006209）。
黑牛肝菌液体发酵条件的优化
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183
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.09.098
Science and Technology of Food Industry 生 物 工 程
2012年第9期
1.2 实验方法
1.2.1 培养基 菌种活化培养基：PDA固体培养基；
种子液培养基：葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、KH2PO4 2g/L、
MgSO4·7H2O 1g/L、pH自然（4.8）[20]；发酵培养基：葡萄
糖30g/L、酵母膏7g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、
VB1 0.01g/L、CaCO3 2g/L，pH自然（4.8）。
1.2.2 培养方法
1.2.2.1 菌株的活化 将在4℃保存的黑牛肝菌菌株
转接至新鲜PDA培养基上，在28℃培养3d，待用。
1.2.2.2 种子液制备 用接种针挑取活化后的菌丝
体适量接种至装有10mL种子液培养基的试管中，培
养温度28℃，摇床转速140r/min，培养4d即得发酵用
种子液。
1.2.2.3 液体发酵培养 250mL锥形瓶中装入60mL
发酵培养基，在121℃下高压灭菌20min后，按装液量
的3%接种种子液，培养温度28℃，摇床转速140r/min，
培养8d。每个处理过程重复7次。
1.2.2.4 菌丝体生物量测定方法 取待测发酵液过
滤，用水冲洗至洗液不再带有发酵液颜色为止。在
65℃恒温干燥箱中烘干至恒重，在干燥器中冷却到
常温，称重。实验数据采用DPS软件处理[21]。
1.2.3 液态发酵培养基组成的单因素实验
1.2.3.1 最适碳源的筛选 本实验选取蔗糖、麦芽
糖、乳糖为供试碳源。分别将供试碳源以30g/L替代
1.2.1中发酵培养基中的葡萄糖，按1.2.2.3法进行发
酵，测定菌丝体生物量，确定最适碳源。
1.2.3.2 最适氮源的筛选 本实验选择蛋白胨、牛肉
膏、硫酸铵和硝酸钾作为发酵供试氮源，分别以7g/L
的上述试剂替代发酵培养基中的酵母膏，发酵后测
定菌丝体生物量，确定最适氮源。
1.2.4 液体培养条件的单因素实验
1.2.4.1 最适培养温度的筛选 按1.2.2.3分别在24、
26、28、30、32℃进行发酵培养，发酵结束后取菌丝体
生物量平均值为指标，确定最适培养温度。
1.2.4.2 最适初始pH的筛选 实验分别设定发酵培
养基的初始pH为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5及自然pH4.8，
按1.2.2.3发酵结束后测定菌丝体生物量，确定发酵最
适初始pH。
1.2.4.3 最适转速的筛选 分别设定摇床转速为
100、120、140、160r/min，按1.2.2.3发酵8d后，称量菌
丝体生物量来确定最适转速。
1.2.4.4 最适装液量的筛选 在250mL锥形瓶中发
酵，分别设定装液量为45、60、75、90mL，按1.2.2.3发
酵结束后称量菌丝体生物量，确定最适装液量。
1.2.5 响应曲面法优化液态发酵条件 在单因素实
验的基础上，应用Design Expert 7.0.0软件，根据Box-
Behnken中心组合实验设计原理，以菌丝体生物量Y（g/L）
为响应值，设计三因素三水平响应面分析实验，对黑
牛肝菌液体发酵条件进行优化，因子编码及水平见
表1。
2 结果与讨论
2.1 液态发酵培养基组成的单因素实验结果
2.1.1 最适碳源的确定 由表2可以看出，当葡萄糖
作为碳源时，可获得最大菌丝体生物量为24.0531g/L。
且菌丝球体大小均匀，密度大，发酵液呈均匀的淡黄
色。葡萄糖做碳源时，相比于麦芽糖、蔗糖、乳糖，菌
丝体生物量达到1%极显著水平。所以，选择葡萄糖
为黑牛肝菌的最适碳源。
2.1.2 最适氮源的确定 由表3可以看出，对不同氮
源，黑牛肝菌的利用情况差异显著。对蛋白胨和酵母
膏利用情况较好，菌丝体生物量分别可达25.3817g/L
和24.0531g/L；蛋白胨与其他四种氮源相比，菌丝体
生物量达到了极显著差异。而无机氮源不大适合黑
牛肝菌菌丝体的生长。采用硝酸钾做氮源的培养基
中，菌丝球体大小参差不齐，发酵液颜色呈深黄色。
因此，选择蛋白胨为黑牛肝菌的最适氮源。
2.2 液体培养条件的单因素实验结果
2.2.1 最适培养温度的确定 由表4可知，在28℃
时，菌丝体生物量达到最大值24.0531g/L，而之后随
着温度的增加，菌丝体生物量降低，可能是温度影响
黑牛肝菌内酶活力的原因。但在5%和1%显著水平
水平
因素
A 葡萄糖（g/L） B 蛋白胨（g/L） C 装液量（mL）
-1 20 5 50
0 30 7 75
1 40 9 100
表1 响应面分析因子及水平
Table 1 Factors and levels of the response surface
碳源 菌丝体生物量（g/L） 5%显著水平 1%极显著水平
葡萄糖 24.0531 a A
蔗糖 22.7792 b B
麦芽糖 22.1835 b B
乳糖 20.5024 b B
注：不同字母表示差异显著，相同字母表示差异不显著；表3～
表7同。
表2 不同碳源对黑牛肝菌液体发酵菌丝体生物量的影响
Table 2 Effect of different carbon sources on mycelia biomass
of Boletus aereu in submerged fermentation
氮源 菌丝体生物量（g/L） 5%显著水平 1%极显著水平
蛋白胨 25.3817 a A
酵母膏 24.0531 b B
牛肉膏 22.0597 c C
硝酸钾 21.5468 cd CD
硫酸铵 22.3342 d D
表3 不同氮源对黑牛肝菌液体发酵菌丝体生物量的影响
Table 3 Effect of different nitrogen sources on mycelia biomass
of Boletus aereus in submerged fermentation
温度（℃） 菌丝生物量（g/L） 5%显著水平 1%极显著水平
24 23.0798 ab A
26 23.6388 ab A
28 24.0531 a A
30 23.8456 ab A
32 23.4416 b A
表4 不同温度对黑牛肝菌液体发酵菌丝体生物量的影响
Table 4 Effect of different temperatures on mycelia biomass of
Boletus aereu in submerged fermentation
184
生 物 工 程 Vol . 33 , No . 09 , 2012
2012年第9期
上，不同温度对黑牛肝菌生长的影响几乎无差异。因
此，确定黑牛肝菌最适的培养温度为28℃。
2.2.2 最适初始pH的确定 由表5可知，不同初始
pH对菌丝体生长无显著影响。当pH=5.5时，生物量达
到最大值25.3594g/L。菌丝体在偏酸性环境中长势稍
好，而在偏碱性环境中菌丝体生物量略有减少。选择
5.5为黑牛肝菌的最适初始pH。
2.2.3 最适转速的确定 由表6可以看出，在160r/min
时，菌丝体生物量达到最大值25.3592g/L。按菌丝体
生物量排序为：160r/min＞140r/min＞120r/min＞100r/min，
随着转速的增加，菌丝体生物量也增多。这与培养基
中溶解氧程度有关，转速越高，溶解氧越多，比较适
合菌丝体生长。但从表6中可以看出，在5%显著水平
上，转速为100r/min时，菌丝体生物量与其他三个转
速有显著差异，这是由于转速不高，溶解氧稍低的缘
故。但在1%显著水平上，转速的高低对菌丝体生物
量的影响无极显著差异。且转速不同的培养基中菌
丝球生长都较均匀，发酵液颜色几乎无差异，均为淡
黄色。综合考虑，选择160r/min为最适转速。
2.2.4 最适装液量的确定 由表7可明显看出，在
5%显著水平上，不同装液量对菌丝体生物量影响显
著；在1%极显著水平上，装液量为75mL与45mL和
90mL差异极为显著。在装液量为45mL时，菌丝体生
物量仅有22.4584g/L，菌丝球少且不饱满，大小差异
很大，这是由于培养基营养物质缺乏引起的。而当装
液量为90mL时，菌丝体生物量略有减少，这与氧气
的溶解量有关。综上，确定75mL为最适装液量。
2.3 响应曲面法优化液态发酵条件结果
综合单因素实验的结果，发现碳源、氮源、装液
量这三个因素对黑牛肝菌菌丝体发酵影响差异显
著。以葡萄糖（A）、蛋白胨（B）、装液量（C）这三个关
键影响因素为自变量，以菌丝体生物量（Y）为因变量
设立17个实验组及所得结果见表8。
2.3.1 回归方程的建立 设计按照Design Expert软
件中的Box-Behnken Design模型对实验获得的菌丝
体生物量进行回归，建立二次回归模型。回归方程为：
Y=25.97-0.16A+0.7B+0.52C+0.31AB+0.21AC-
0.015BC-1.31A2-0.69B2-0.40C2 式（1）
对回归方程式（1）进行检验，相关系数R2=0.9814，
P＜0.0001，表明回归模型显著，拟合程度好，有实际
应用意义。其中蛋白胨B（P<0.0001）为极度显著影响
因素，装液量C（P<0.01）为高度显著影响因素，葡萄
糖A（P=0.079）影响较为显著。
2.3.2 响应面分析与优化 采用响应面分析关键点
值，其编码坐标为（0.743，0.725，0.828），对应的实际
值为（37.43，8.45，95.69），此时可以得到最大菌丝体
生物量为25.7726g/L。图1～图3为通过Design-Expert
得到的响应面分析图，每个响应面分别代表着2个独
立变量之间的交互作用，此时第三个变量保持在最
佳水平。由图1~图3可以看出：葡萄糖、蛋白胨、装液
pH 菌丝体生物量（g/L） 5%显著水平 1%极显著水平
3.5 22.5896 b A
4.5 24.0686 ab A
4.8（自然） 24.0531 ab A
5.5 25.3594 a A
6.5 24.0336 ab A
7.5 23.2645 ab A
表5 不同初始pH对黑牛肝菌液体发酵菌丝体生物量的影响
Table 5 Effect of different initial pH on mycelia biomass of
Boletus aereu in submerged fermentation
转速（r/min）菌丝生物量（g/L） 5%显著水平 1%极显著水平
160 25.3592 a A
140 24.1887 ab A
120 24.0531 a A
100 23.3312 b A
表6 不同转速对黑牛肝菌液体发酵菌丝体生物量的影响
Table 6 Effect of different rotating speed on mycelia biomass of
Boletus aereu in submerged fermentation
装液量（mL）菌丝生物量（g/L） 5%显著水平 1%极显著水平
45 22.4584 d C
60 24.0531 b AB
75 25.3523 a A
90 24.0112 c B
表7 不同装液量对黑牛肝菌液体发酵菌丝体生物量的影响
Table 7 Effect of different broth content on mycelia biomass of
Boletus aereu in submerged fermentation
实验号 A B C Y菌丝体生物量（g/L）
1 0 -1 -1 23.38
2 -1 0 -1 24.38
3 -1 0 1 24.62
4 -1 -1 0 23.58
5 1 1 0 24.98
6 0 1 -1 24.97
7 -1 1 0 24.52
8 0 0 0 25.93
9 0 0 0 25.97
10 0 -1 1 24.82
11 1 0 1 24.55
12 0 1 1 26.35
13 0 0 0 26.05
14 1 -1 0 22.78
15 0 0 0 26.01
16 1 0 -1 23.49
17 0 0 0 25.89
表8 Box-Behnken设计方案及响应值
Table 8 Box-Behnken design and corresponding value
26.2
25.325
24.45
23.575
22.7
9.00 8.00 7.00 6.00
5.00
菌
丝
体
生
物
量
（
g/
L）
25.0030.00
35.00
40.00
B：蛋白胨（g/L） A：葡萄糖（g/L）20.00
图1 葡萄糖与蛋白胨交互作用影响菌丝体生物量
Fig.1 Interactive effect of glucose and peptone on
mycelia biomass
185
Science and Technology of Food Industry 生 物 工 程
2012年第9期
26.2
25.475
24.75
24.025
23.3
100.0087.5075.0062.50
50.00
菌
丝
体
生
物
量
（
g/
L）
25.0030.00
35.00
40.00
C：装液量（mL） A：葡萄糖（g/L）20.00
图2 葡萄糖与装液量交互作用影响菌丝体生物量
Fig.2 Interactive effect of glucose and broth content on
mycelia biomass
26.4
25.625
24.85
24.075
23.3
100.00
87.5075.0062.50
50.00
菌
丝
体
生
物
量
（
g/
L）
6.00 7.00
8.00
9.00
C：装液量（mL） B：蛋白胨（g/L）5.00
图3 蛋白胨与装液量交互作用影响菌丝体生物量
Fig.3 Interactive effect of peptone and broth content on
mycelia biomass
量与菌丝体生物量存在相关性。蛋白胨对菌丝体生
物量影响十分显著，曲线非常陡峭。装液量影响次之，
最后是葡萄糖，响应面分析显著性与方程分析结果
一致。
2.3.3 优化与验证 为操作方便，将上述最佳条件优
化为葡萄糖37.5g/L，蛋白胨8.5g/L，装液量为96mL，
按此条件重复实验7次，所得菌丝体生物量平均值为
25.4801g/L，误差为1.13%，实验结果与模拟方程有较
高的一致性。因此该方程充分验证了所建模型的正
确性，说明响应面法适用于黑牛肝菌液体发酵产菌丝
体的回归分析和参数优化。
3 结论
本实验在单因素实验的基础上，利用实验设计软
件Design Expert，采用Box-Behnken Design建立了葡萄
糖、蛋白胨与装液量和菌丝体生物量之间的二次多
项数学模型（式（1）），对式（1）回归方程进行检验，相
关系数R2=0.9814，P＜0.0001，表明回归模型显著，拟
合程度好，有实际应用意义。
利用模型的响应面对影响黑牛肝菌菌丝体生物
量的关键因子及其相互作用进行探讨，优化出黑牛肝
菌液体发酵培养的最佳条件。最佳培养基组成为：葡
萄糖37.5g/L、蛋白胨8.5g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO4·7H2O
1g/L、VB1 0.01g/L、CaCO3 2g/L；最佳培养条件为：装液
量96mL，培养温度28℃，转速160r/min，初始pH为5.5。
菌丝体生物量的预测值为25.7726g/L，验证值为
25.4801g/L，误差为1.13%。因此此模型是合理可靠的，
可用于实际预测。
参考文献
[1] 李泰辉，宋斌. 中国食用牛肝菌的种类及其分布[J]. 食用菌
学报，2002，9（2）：22-30.
[2] Owen L，McConnell，Ernst E. Both Boletus dupainii in North
America[J]. Field Mycology，2002，3（3）：103-104.
[3] 邓百万，陈文强. 美味牛肝菌营养菌丝体与野生子实体品质
分析[J]. 中国食用菌，2004，23（5）：44-46.
[4] 周庆珍，苏维词. 贵州野生多汁乳菇营养成分分析[J]. 营养
学报，2003，25（2）：130-132.
[5] 阮海星，张卫国，付家华，等. 香菇多糖及营养成分分析[J].
微量元素与健康研究，2005，22（3）：35-36.
[6] Dentingera B T M，Ammirati J F，Both E E，et al. Molecular
phylogenetics of porcini mushrooms（Boletus section Boletus） [J].
Molecular Phylogenetics and Evolution，2010，57（3）：1276-1292.
[7] 殷建忠，周玲仙 . 云南野生菌维生素B1、B2含量分析 [J]. 营
养学报，2003，25（2）：163-166.
[8] 吴学谦，李海波，吴庆其，等. 黄靛牛肝菌子实体营养成分
分析评价[J]. 食用菌学报，2005，12（2）：19-23.
[9] 李志洲. 美味牛肝菌多糖的抗氧化性[J]. 食品与发酵工业，
2007，33（4）：49-51.
[10] 王一心，杨桂芝，狄勇，等. 黑牛肝菌对高脂血症大鼠血脂
及抗氧化能力的影响[J]. 中华预防医学杂志，2004，38（5）：6-8.
[11] 王茂盛，连宾 . 美味牛肝菌研究[J]. 贵州林业科技，2003，
31（3）：34-37.
[12] 李平，李娟，汤婕. 美味牛肝菌及其深层发酵液中风味物
质的研究[J]. 食品与发酵工业，2007，33（10）：1-5.
[13] 赵永勋. 食药用菌液体发酵的现状和展望[J]. 农业与技术，
2004，24（3）：111-113.
[14] Graz·yna J， Emilia B. Effects of pre-treatment， freezing and
frozen storage on the texture of Boletus edulis（Bull：Fr.） mushrooms
[J]. International Journal of Refrigeration，2010，33（4）：877-885.
[15] Heleno S A，Barros L，Sousa M J，et al. Targeted metabolites
analysis in wild Boletus species [ J ] . LWT-Food Science and
Technology，2011，44（6）：1343-1348.
[16] Cengiz S，Bektas T，Mustafa Y. Evaluation of the antioxidant
activity of four edible mushrooms from the Central Anatolia，
Eskisehir-Turkey：Lactarius deterrimus，Suillus collitinus，Boletus
edulis，Xerocomus chrysenteron[J]. Bioresource Technology，2008，
99（14）：6651-6655.
[17] 陆建明，张锡凤. 食用菌液体菌种制备的研究进展 [J]. 中
国食用菌，2003，22（6）：15-17.
[18] 王淑芳，卜庆梅，刘进杰，等. 液体浅层静置培养食用菌菌
种技术[J]. 湖北农业科学，2006，45（2）：203-204.
[19] 王允祥，陆兆新，吕凤霞，等. 牛肝菌摇瓶发酵条件优化研
究[J]. 食品与发酵工业，2004，30（7）：67-71.
[20] 刘芳，李平，刘博. 乳牛肝菌液态发酵生长条件的优化[J].
生物学杂志，2010，27（1）：5-8.
[21] 唐启义，冯明光. 实用统计分析及其DPS数据处理系统[M].
北京：科学出版社，2002：25-109.
186