全 文 ：新 疆 农 业 科 学 2 0 1 6 , 5 3 ( 1 ) : 1 7 6 - 1 8 4
X i n j i a n g A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s
doi ： 10. 6 0 4 8 / j . is sn . 1001 - 4330. 2016. 01. 024
新疆额尔齐斯河沿岸野生牛肝菌菌种的分离与鉴定
周 强 马 德 英 \ 林 辰 壹 3 , 羌 松 1
( 1 . 新 碰 农 业 大 学 农 学 院 / 农 林 有 害 生 物 监 测 与 安 全 防 控 重 点 实 验 室 ，乌 鲁 木 齐 8 3 0 0 5 2 ; 2 . 新 躇 生 产 建 设 兵 团
第 十 二 师 三 坪 农 场 ，乌 鲁 木 齐 8 3 0 0 3 2 ; 3 . 新 疆 农 业 大 学 林 学 与 园 艺 学 院 ，乌 鲁 木 齐 8 3 0 0 5 2 )
摘 要 ：【目的】采集新疆额尔齐斯河沿岸野生牛肝菌进行分离和鉴定，为该野生大型食用菌的保护和利用提
供科学依据。【方法】观察野生牛肝菌的生长环境、表现形态以及生长分布情况，进行形态学鉴定。分离培养
采用菌根菌培养基，通过 rDNA I T S 区段的P C R 扩增菌体子实体和培养的菌丝进行分子生物学鉴定。【结果】
通过形态学鉴定成熟牛肝菌的菌盖直径在6 ~ 13 c m , 初期球形菌盖紧包菌柄顶端后期成扁半球形，菌肉白
色，微带粉色，菌柄顶部也为白色，菌管由白色逐渐变为褐色带暗土黄色，管孔小。菌柄长4 ~ 12 cm , 粗 2 ~6
cm ,近圆柱形，淡褐色或淡黄褐色，表面具黑色疣状突起，内部实心，基部稍膨大。孢子印圆形呈褐色。该野
生牛肝菌菌盖、菌柄及两者交接处均能分离出菌丝。利用 rD N A 上的 I T S 区段对野生牛肝菌及其分离菌株进
行分子生物学辅助鉴定，子实体及其分离菌株的IT S 片段长度基本一致，在 1 000 b p 左右二者的相似性达到
96% 。采用D N A S ta r软件中的MegAlign - C lu s ta lW 模型计算出牛肝菌的进化分歧矩阵，并构建系统进化树。
【结论】从形态学观察，野生牛肝菌与隶属于伞菌目（A garicases) 、牛 肝 菌 科 （B oletaceae) 、抚柄牛肝菌属
( iecc inum ) 的皱皮庞柄牛肝菌Leccinura dun iticuZum最为近似，从分子生物学鉴定该野生牛肝菌与Genebank
中 AF484445. 1 序列即皱皮疣柄牛肝菌Lecchum 是同一来源，一致性高达98.4% 。
关键词：牛肝菌；分离;鉴定;新疆；额尔齐斯河沿岸
中 图 分 类 号 : S646 文 献 标 识 码 ：A 文 章 编 号 ：〗 001 - 4 3 3 0 ( 2 0 1 6 ) 0 1 - 0 1 7 6 - 0 9
〇 引 言
【研究意义】牛 肝 菌 味 美 营 养 、风味独特历来
深受人们的推崇，古 人 称 之 为 “山 珍 ，是宴席上
的极品；近 代 人 誉 之 为 “素 中 之 荤 ”、“植 物 肉 ”、
“清净的食品”。牛 肝 菌 具 有 的 药 用 价 值 与 它 所
含 有 的 腺 嘌 呤 （accenine ) 、胆 碱 （choli - ne ) 和腐
氨（putrese ine) 等 多 种 生 物 碱 有 关 。动物实验和
临床结果表明,该菌子实体的提取物所含的肽类、
碱 性 蛋 白 等 物 质 对 小 白 鼠 瘤 S - 1 8 0 的抑制率为
1 0 0 % ,对 艾 氏 腹 水 瘤 的 抑 制 率 为 9 0 % 。美味牛
肝菌的多糖能促进机体中枢免疫器官胸腺和脾的
增 长 ，促 进 淋 巴 细 胞 增 生 ，提 高 机 体 的 免 疫 功 能 ，
N 时 ，对 机 体 红 细 胞 S O D 活 性 具 有 促 进 作 用 ，因
而 具 有 抗 衰 老 的 功 效 ，是 一 种 珍 贵 的 药 物 资
源[1 位于阿尔泰山西南边缘的国境线上的额
尔齐斯河沿岸, 盛产营养价值丰富的野生牛肝菌。
野 生 牛 肝 菌 营 养 价 值 丰 富 ;含 1 8 种人体必须的氨
基 酸 ;是 一 类 高 蛋 白 、低 脂 肪 食 物 ；每 100 g 干品
中 含 VB 2 6 .9 m g (是 乌 骨 鸡 的 3 5 倍 ），尼克酸
19.5 m g(是 乌 骨 鸡 的 3 倍 ）、钙 382. 5 m g、锌 12. 4
m g、铁 21. 3 m g、镁 2 2 1. 6 m g，其中蛋白质的质量
分 数 占 干 重 的 31. 8 % , 粗 纤 维 质 量 分 数 占 干 重
10. 56% , 碳 水 化 合 物 质 量 分 数 占 干 重 47. 13% ,
营养价值高[3]。 【前 人 研 究 进 展 】国内外对于额
尔齐斯河两岸、天 山 、阿勒泰山等地的牛肝菌研究
报道较少。贺 亚 玲 等 [3< 2〇1〇年调查了新疆北
屯 野 生 橙 黄 疣柄牛肝菌的生境，适宜的的生境条
收稿 日 期 :2015 - 0 9 - 1 0
基 金 项 目 ：新疆维吾尔自治区十二五重大专项（2 0 1 1 3 01 0 4 - 2 - 2 ) ; 新疆农业大学大学生创新项目（2 0 1 2 )
作 者 简 介 : 周 强 （1989 - ) ，男 ，湖 北 人 ，助 理 农 艺 师 ，研究方向为分子生物学 ，（E - m a il ) 1 7 8 0 9 3 9 9 2 @ q q . com
通 讯 作 者 : 免 松 （丨％ 7 - ) ，男 ，河 南 人 ，副 教 授 ，研 究 方 向 为植物病理学 ，（E - m a i l ) q se26@ 163. com
周 强 等 ：新 疆 额 尔 齐 斯 河 沿 岸 野 生 牛 肝 菌 菌 种 的 分 离 与 鉴 定 177期
件 是 海 拔 在 450 ~ 600 m ，以 银 白 杨 为 主 的 林 地 ；
进行了菌种分离实验并且成功地分离出了橙黄疣
柄牛肝菌菌种[3< 。刘红玲等〜研究了新疆橙黄
疣柄牛肝菌菌丝对 C u 、Z n 和 P b 的耐受性。赵振
宇等[7]记载了阿尔泰林地橙黄疣柄牛肝菌等7种
牛肝菌，研究菌种未见记载。【本 研 究 切 入 点 】近
年 来 ，由于过度采集及不合理采集,野生资源正逐
年减少，为使这一宝贵资源得到可持续利用，对其
采取保护措施和人工驯化繁育势在必行。但关于
该野生大型食用菌的种类及相关生物学特性等研
究未见报道。通 过 rDNA I T S 区 段 的 P C R 扩增菌
体 子 实 体 和 培 养 的 菌 丝 进 行 分 子 生 物 学 鉴 定 ，初
步 鉴 定 了 该 野 生 菌 种 。 【拟 解 决 的 关 键 问 题 】采
集 额 尔 齐 斯 河 沿 岸 野 生 牛 肝 菌 进 行 分 离 鉴 定 ，为
该野生大型食用菌的保护和利用提供科学依据。
1 材 料 与 方 法
1. 1 材 料
1 . 1 . 1 牛肝菌
供试材料牛肝菌于2 0 1 3 年 1 0 月 1 日采自新
疆 哈 巴 河 县 境 内 1 8 5 团 额 尔 齐 斯 河 沿 岸 ，地理坐
标 为 E 8 5 °3 2 ，N 4 7 °5 8 ，主要采集幼嫩无虫害的
子 实 体 连 同 基 座 土 保 存 好 ,放 人 保 鲜 箱 带 回 实 验
室。采集与到达实验室约间隔24 h 。
1. 1 _ 2 培 养 基
菌根菌培养基[8- 9](可 溶 性 淀 粉 2 g 、麦芽糖
2 g 、葡 萄 糖 2 g 、硝 酸 钙 0 .5 g 、硫 酸 镁 0 .5 g 、磷酸
二氢钾 0 .2 5 g 、琼脂 15 g 、0 . 1 % 蛋 白 胨 、1 000 mL
蒸馏水）。
1 .1 .3 仪 器
冰盒保鲜箱、Centrifuge 5425 R 型低温高速离
心 机 、METTER TOLEDO AL204 - 1 C 型 天 平 、金怡
DK - 8 D 型 数 显 恒 温 水 浴 锅 、上 海 博 讯 GZX -
9 0 7 6 数显鼓风干燥箱、上海博讯超净工作台。
1 . 2 方 法
1 .2 .1 组织分离
1.2. 1.1 熏蒸
甲醛熏蒸法：甲 醛 是 一 种 无 色且具有强烈刺
激性的气体，可与蛋 白 中 的 氨 基 结 合 使 其 变 性 或
使 蛋 白 质 分 子 烷 基 化 ，对 细 菌 、真 菌 、病毒等均有
效 ，可广谱杀菌，且 效 率 较 高 。关 闭 门 窗 ，用甲醛
溶 液 和 高锰酸钾按2 : 1 的 比 例 进 行 薰 蒸 消 毒 ，即
甲醛（4 0 % ) 1 0 mlVm3 , 高锰酸钾 5 g/ m3。KMn0 4
具 有 强 氧 化 性 ，与 甲 醛 发 生 反 应 ，产 生 大 量 热 量 ，
使甲醛以气体形式挥发，扩散于空气和物体表面，
消 毒 3 h 。打 开 门 窗 通 风 1 h 后 ，可 以 进 行 实 验
( 在熏蒸期间严禁人内）。
1 .2 .1 .2 超净工作台灭菌
把脱脂棉浸泡在7 5 % 乙 醇 内 完 全 浸 湿 ，用酒
精棉对超净工作台内全面擦拭2 〜3 次 ，然后将紫
外 灯 照 射 不 少 于 30 m in。
1.2. 1 .3 组织分离
取 当 日 或 采 集 后 4 d 以 内 的 新 鲜 幼 嫩 、健康
无虫害的牛肝菌子实体（采集时间越短子实体活
性 就 越 高 ），用 自 来 水 冲 洗 表 面 泥 土 ，再用刀片将
菌 柄 尾 部凹陷处泥土削掉，最后用无菌滤纸吸残
留 水 滴 阴 凉 处 放 置 10 m in , 拿进超净 工 作 台 放 置
到 灭 菌 培 养 皿 。 用 经 高 温 灭 菌 的 脱 脂 棉 放 人
75% 乙 醇 ，擦洗手指。将 子 实 体 用 7 5 % 乙醇表面
消 毒 30 s , 再 用 无 菌 水 冲 洗 ，无 菌 滤 纸 吸 干 ，置于
新的无菌培养皿中，再用酒精棉擦洗手指,然后从
菌 柄 菌 盖交界处掰开菌体，再用已在酒精灯火焰
上灭菌处理的解剖刀，在掰开的子实体内部切取
5 〜8 m m 大 小 的 菌 盖 、菌柄以及两者交接处不同
部 位 的 菌 块 ，用 无 菌 镊 子 或 解 剖针迅速将其放入
斜 面 培 养 基 上 ，菌 柄 、菌 盖 、交 界 处 各 分 离 2 5 支
斜 面 培 养 基 试 管 ，封 好 ，置 于 暗 培 养 室 内 培 养 ，培
养 温 度 为 26丈 。待 菌 种 萌 发 后 挑 取 目 的 菌 丝 进
行 转 接 培 养 ，经 3 次纯化后即可获得纯菌种。
1 . 2 . 2 子实体与菌丝鉴定
于 2 0 1 3 年 1 0 月 〗 日采自新疆生产建设兵团
第 十 师 1 8 5 团额尔齐斯河沿岸。通过采集幼嫩的
无虫害子实体以及培养出的菌丝进行鉴定。
1.2.2. 1 分子鉴定
子 实 体 不 同 部 位 的 D N A 是 相 同 的 。子实体
组织与其组织分离的菌丝体是1 个无性克隆系的
的 2 种 不 同 表 达 形 态 ，应 该 具 有 完 全 相 同 的 DNA
组 成 。利 用 rD N A 上 的 I T S 区段对野生牛肝菌及
其分离菌株进行分子鉴定便可确定分离菌株是否
为其纯培养菌种。
1 .2 .2 . 2 试剂
无 水 乙 醇 、P - 巯 基 乙 醇 、1.5 m L 离 心 管 、庄
盟生物 2 x Tag per MasterMix、庄盟生物 ddH20 、
华 大 基 因 上 游 引 物 ITS1 和 下 游 引 物 ITS4 、上海生
178 新疆农业科学 5 2 卷
工 SK8259E zu p 柱 式 基 因 组 D N A 抽 提 试 剂 盒 （真
菌 )。
1 .2 .2 . 3 子实 体 及 菌 丝 D N A 的提取
( . 1 ) 取 5 0 ~ 1 0 0 m g 新 鲜 大 型 真 菌 （如蘑菇)
或 20 m g 干 燥 的 子 实 体 或 菌 丝 用 液 氮 研 磨 成 粉
末 ，加 人 1 . 5 m L 离 心 管 中 。加 入 2 0 0 jjuL Buffer
D i g e s t i o n 和 2 ( x L 卩- 疏 基 乙 醇 ，再 加 人 2 0 |_iL
P r o t e i n a s e K 溶 液 ，震荡混匀。5 6 ° C 水 浴 1 h 至细
胞完全裂解。
( 2 ) 加 人 100 jjlL Buffer P F , 充分颠倒混匀，-
20。(：冰箱放置5 m in。
( 3 ) 室 温 10 000 r/ m in 离 心 5 m in ，将上清转
移 到 新 的 1.5 m L 离心管中。
( 4 ) 加 入 200 (jlL Buffer B D , 充分颠倒混匀。
( 5 ) 加 入 2 0 0 | x L 的 无 水 乙 醇 ，充分颠倒混
匀 。
( 6 ) 将 吸 附 柱 放 入 收 集 管 中 ，用移液器将溶
液和半透明纤维状悬浮物全部加人吸附柱中，静
置 2 m in , 再 10，000 r/ m in 室 温 离 心 1 m in ,倒掉收
集管中的废液。
( 7 ) 将 吸 附 柱 放 回 收 集 管 ，加 入 500 |xL PW
Solution，10 000 r/ m in 离 心 30 s 倒掉收集管中的
废 液 。
( 8 ) 将吸附柱放回收集管，加 人 5〇〇 (xL Wash
Solution , 10 000 r/ m in 离 心 30 s 倒掉收集管中的
废液。
( 9 ) 将 吸 附 柱 重 新 放 回 收 集 管 中 ，于 12 000
r/ m in 室 温 离 心 2 m in , 离 去 残 留 的 W ashSoludon。
( 1 0 ) 取 出 吸 附 柱 ,放 人 一 个 新 的 1.5 m L 离
心 管 中 ，加人 50 jjlL TE Buffer 静置 3 m in , 12 000
r / m i n 室 温 离 心 2 m in ，收 集 D N A 溶 液 。提取的
D N A 可立即进行下一步实验或- 2 0 ° C 保存。
1. 2. 2 .4 riDNA ITS 区段的 PCR 扩增
将 华 大 基 因 购 买 的 通 用 引 物 ITS 1 加人
ddH 20 49_ 01 p X JT S 4 加入 ddH20 51. 25 pL 稀
释 成 原 液 ，再 同 时 稀 释 5 倍 进 行 rDNA IT S 区段的
P C R 扩 增 0
P C R 体系首先加人基因组（DNA )2 +L , 然后
加人 2 x per MasterMix 12_ 5 (jlL , 再加入 ITS1、
ITS 4 各 2 (jlL ，最 后 加 人 ddH 20 6. 5 + L 轻摇使其
均 匀 混 合 ，放 入 P C R 扩 增 仪 进 行 rDNA I T S 区段
的 P C R 扩 增 。
扩 增 程 序 ：盖 温 98T ; 9 4 尤 预 变 性 5 m in ;
94X 变性 1 m in，56 (C 退火 1 min ,7 2 T 延伸 1
m in，3 5 个 循 环 ；72 T 补 平 5 m in , 终 止 温 度 为
代 0
1 .2 .2 .5 DNA 测序
将 P C R 产物送往华大基因做普通测序，用以
保 证 准 确 率 。将 子 实 体 与 分 离 菌 株 的 rDNA ITS
区 段 D N A 序 列 的 测 序 结 果 在 N C B I中 B IA S T 比
对 ，根 据 结 果 ，判断分离菌株是否为同一菌种。表
表 1 在 g e n b a n k 中的参比基因序列
T ab le 1 R e fe re n c e seq u e n ce s a n d th e re sp e c tiv e G e ixB ank acce ss io n n u m b e rs
代码
C ode
描述
D escrip tion
比对个数
N u m b ers fo r com parison
牛肝菌
从 新 疆 生 产 建 设 兵 团 第 十 师 1 8 5 团额尔齐斯河沿岸釆集
到的野生牛肝菌子实体提取的DINA i t s 区段基因序列 1
| AF484445. 11 Ijeccinum duriusculum 1
1AF454579. 11 LccaViwm ，奥地利 1
1AF454580. 11 Ijeccinum vulpinum , 1
IJN021054. 11 Leccinum vuipinum 1
1 GL:234155. 11 Ijeccinum rotundifoLiae 1
1AF454583. 11 Leccin.jxm ，：^ 1
IJF899565. 11 Ijeccinum. manzanitae 1
1 AF454582. 11 Leccinum rotuiidifoliae 1
1AF454574. 11 Ijeccinum versipelle, 1
1AF454575. 1 1 ^ccinum roseotinctum, 3 ^ A 1
I AF454563. 11 Leccinum koiopus, 1
1AF454568. 11 Leccinum pulchnim, ^ 兰 1
1AF454566. 11 L ecc inum roseofractum t ^ 1
周 强 等 ：新 疆 额 尔 齐 斯 河 沿 岸 野 生 牛 肝 菌 菌 种 的 分 离 与 鉴 定 1791 期
1. 2. 2. 6 在 G en B an k 中的参比序列
图 1 野生牛肝菌共生银白杨
F ig . 1 T h e m u tu a l is t ic sy m b io s is
o f w ild b o lc te a n d a b c lc
2 结 果 与 分 析
2 . 1 新 疆 生 产 建 设 兵 团 第 十 师 1 8 5 团野生牛肝
菌的生境调查
新疆生产建设兵团第十师1 8 5 团位于阿尔泰
山西南边缘的国境线上，额尔齐斯河流入北冰洋
出境口处。地 理 位 置 位 于 E 8 5 °3 1 4 0 ~ 8 5 °5 6
00， 47。57，~ 4 8 。26，。南 北 长 52.6 1 ^ ，东西宽
16.2 k m ，海 拔 420〜500 m 。地 势 北 高 南 低 ，坡降
为 1 /5 0 0 ,海 拔 4 〖 0 ~ 560 m 。1 8 5 团地处欧亚大
陆 中 心 ，属 大 陆 性 温 带 寒 冷 地 区 ，冬季严寒而漫
长 ，风多雪大;夏季短而炎热。太阳辐射平均全年
134 . 4 k j/ cm2 ，年 平 均 温 度 4 T , 绝 对 最 低 温 度 -
5〇.1<€(1969 年 1 月 27 日 ），降 雪 一 般 为 60~80
cm ，最 厚 为 180 cm ; 绝 对 最 高 温 度 39. 4 弋 （1974
年 7 月 1 1 日），平 均 年 降 水 量 178.2 m m , 最多
306. 7 mm ( 1966 年 ），最少 96. 2 m m ( 1982 年 ），平
均 年 蒸 发 量 1 744. 4 m m , 是 降 水 量 的 9 . 8 倍 ，曰
照 平 均 2 696 h , 年 平 均 无 霜 期 117 d , 盛 东 西 风 ，
年平均风速3 . 9 m/ s , 最 大 风 速 4. 5 m/ s [U)]。野生
植 物 乔 木 类 :银 灰 杨 、胡 杨 、银 白 杨 、小 叶 杨 、欧洲
黑 杨 、苦 杨 、额河杂交、新 疆 杨 、波 兰 杨 、科 伦 杨 、钻
天 杨 、箭 杆 杨 、茸 毛 杨 、白 柳 、毛 柳 、油 柳 、北京杂交
柳 、蘑菇柳、龙爪柳、哈密倒柳、簸 箕 柳 、油 皮 桦 、白
榆 、大 叶榆、垂 榆 、黄 榆 、裂叶榆等。灌 木 类 :沙 枣 、
红 柳 、梭 梭 柴 、铃 铛 刺 、白 腊 、复 叶 槭 、樟 子 松 、白
刺 、黑 刺 、沙 棘 、沙拐枣等。
通过田间调查，牛肝菌子实体的发生地多在
额尔齐斯河沿岸以及戈壁 绿 洲 中 的 银 白 杨 林 中 ，
子实体中等至较大。牛肝菌以当地银白杨为主要
共 生 树 种 ，树 龄 在 15 ~ 4 〇年，树 高 15 ~ 3 0 m ，树
直 径 为 25 ~ 45 cm 。发 生 层 土 壤 p H 值 偏 酸 性 ，土
壤 含 水 量 为 2 0 % 左 右 ，地 温 为 19丈 左 右 。银白
杨的树根多在土表5 c m 以下，靠近主干会暴露在
土 表 形 成 1 ~ 1〇 m 不 等 的 树 根 ，越是干旱根系越
发达。牛肝菌子实体易发生在树坑、马 蹄坑、草坑
等潮湿有斜面的地势。 多 在 雨 后 气 温 偏 低 ，光照
适 宜 ( 散 射 光 ），水 分 充 足 时 大 量 发 生 。当地居民
采摘的子实体直径在1 ~20 c m 不 等 。图 1 〜4
图 2 野生牛肝菌生长状态
F ig . 2 T h e g ro w th s ta tu s o f w ild b o le te
2. 2 菌体形态特征
成熟牛肝菌的菌盖直径一般在6 ~ 13 c m , 所
见最大者直径达20 c m 以上。初期球形菌盖紧包
菌柄顶端后期成扁半球形,表面根据生长环境的
变化而不同。有些光滑平整，有些凹凸不平，后期
因干旱表，菌 盖 表 面 多 呈 龟 裂 状 （图 2 , 3 , 4 ) 。菌
肉白色，微 带 粉 色 ，菌 柄 顶 部 也 为 白 色 ，菌管由白
色 逐 渐 变 为 褐 色 带 暗 土 黄 色 ，管 孔 小 。菌 柄 长 4
〜I2 cm , 粗 2 ~ 6 c m ，近 圆 柱 形 ，淡褐色或淡黄褐
色 ，表面具黑色疣状突起，内部实心，基部稍如大。
孢子印圆形呈褐色。从 形 态 学 观 察 ，该野生牛肝
菌 与 隶 属 于 伞 菌 目 （A garicases) 、牛 肝 菌 科 （Bo-
le taceae) 、庞 柄 牛 肝 菌 属 （iecaV ium ) 的皱皮抚柄
牛肝菌 最为近似。图 2 ~4
180 新疆农业科学 5 2 卷
图 3 沙漠绿洲采集的野生
牛肝菌菌体形态
Fig. 3 T h e m o rp h o lo g y o f w ild b o lc te
co llec ted f ro m d e s e r t oasis
图 4 额尔齐斯河沿岸生长的
野生牛肝菌菌体形态
Fig. 4 T h e m o rp h o lo g y o f w ild b o le te
co llec ted f ro m co a s tw ise o f E c rq is i R iv e r
2 .3 分离培养
通 过 3 d 的组织培养，观 察 发 现 菌 柄 、菌盖以
及两者交界处均能形成菌丝。在分离培养中观察
发现 ，由菌柄分离的菌丝形成最快,其次是菌盖-
菌柄交接处，菌盖形 成 菌 丝 的 速 度 最 慢 。污染率
由大到小依次为菌盖 > 菌 柄 - 菌 盖 交 接 处 > 菌
柄。另 外 ，菌柄组织最为密实并且粗壮，菌柄中间
洁白的组织能够保持较长时间的活性以及无杂菌
污 染 ，最 易 于 分 离 成 功 ，该 结 果 与 贺 亚 玲 等 [4]的
研 究 结 果 有 异 ，可 能 与 所 研 究 的 菌 种 不 同 有 关 。
观察表明，菌 盖 -菌 柄 两 者 交 接 处 是 最 先 腐 败 的 ，
采 摘 2 d 以 后 从 菌 柄 -菌 盖 交接处开始就会变黑
色并逐渐坏死，因 此 , 子实体分离时间间隔越短越
好 。菌 盖 是 最 容 易 被 感 染 的 地 方 ，实验培养结果
表 明 成 功 率 不 足 3 0 % 。菌丝 从 子 实 体 表 面 生 长
出来，初期色洁白并且非常短无法用接种针挑起，
实验中发现菌丝可以通过子实体本身营养形成，
菌丝形成后再切开菌块可以看到子实体菌块内部
仍然具有活力。菌 丝 体 仅 在 菌 体 组 织 表 面 形 成 ，
随着培养时间的延长，菌丝仅向上伸长，形成气生
菌 丝 ，直 至 菌 体 组 织 营 养 枯 竭 。室内通过不同的
碳 、氮 营 养 培 养 基 以 及 不 同 p H 值培养基和不同
温度进行培养，均 未 能 成 功 。该菌种的人工培养
有待进一步研究。
2 . 4 菌种的分子生物学鉴定
以 子 实 体 （命 名 为 N ) 、分 离 菌 株 即 菌 丝 体
( 命 名 为 S ) 基 因 组 D N A 为 模 板 ，经 ITS - P C R 反
应 扩 增 ，1% 琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示子实
体 及 其 分 离 菌 株 彼 此 的 IT S 片 段 长 度 基 本 一 致 ，
在 1 000 b p 左 右 。图 5
图 5 牛 肝 菌 子 实 体 P C R 产 物 （N )
与 菌 丝 P C R 产 物 （S ) 的检测
F ig . 5 T h e d e te c tio n o f P C R f ra g m e n ts
f o r s p o ro c a r p ( N ) a n d h y p h a iso la tio n s ( S )
P C R 测序比对结果
S 代 表 菌 丝 D N A 全 长 999 bp
N 代 表 牛 肝 菌 子 实 体 D N A 全 长 998 bP
D N A M A N 比对结果
周 强 等 ：新 疆 额 尔 齐 斯 河 沿 岸 野 生 牛 肝 菌 菌 种 的 分 离 与 鉴 定 1811 期
mmm
gct3
TACATCGAGACCfiTCGAAMGTAGCATCCGAACtagatcga3accfltc.
100
5G<；
ecu
900
998959
图 6 菌 丝 （S ) 与子实体在（N ) D N A M A N 同源性比对
F ig . 6 T h e h o m o lo g y c o m p a r is o n b e tw ee n P C R f r a g m e n ts f o r
s p o ro c a r p ( N ) a n d h y p h a iso la tio n s ( S )
以菌丝（s ) 与子实体（N ) 的 D N A 为模板克隆
的 I T S 区 序 列 同 时 在 N C B I上 B L A S T 比 对 ，在
DNAMAN上的比对结果两条序列同源性为96% 〇
这一结果表明野生牛肝菌的组织分离菌株为纯培
养菌种[11’12]。图 6
对 同 一 属 不 同 种 的 牛 肝 菌 进 行 检 测 ，采用
DNAStar 软件中的 MegAlign - CliistalW 模型计算
出 牛 肝 菌 的 进 化 分 歧 矩 阵 ，并 构 建 系 统 进 化 树 。
结 果 发 现 ，牛 肝 菌 与 A F484445. 1 即 Lec«>i_
(/uriiwcuZum(皱 皮 抚 柄 牛 肝 菌 ）是 同 一 来 源 ，并且
一 致 性 在 所 有 序 列 中 最 高 ，达 到 98. 4 % ，供试菌
与皱皮抚柄牛肝菌相似性非常高。图 7 ，图 8
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揭 觸 S JB3?1C64
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b o le te s w as b u il t u s in g D N A S ta r C lu s ta l W m e th o d
182 新疆农业科学 5 2 卷
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图 8 被检测野生牛肝菌与参比序列的一致性
Fig. 8 Id e n ti ty o f th e 813 b p f ra g m e n ts b e tw ee n
3 讨 论
目 前 IT S 序列在菌种界定上的应用，主要是
在传统形态学鉴别的基础上为种的分类鉴定提供
进一步的分子依据。LANDEW EERT等 [13)在对土
层中分布的外生菌根菌群落进行分子鉴定的研究
中 提 出 ，通 过 I T S 区 域 序 列 比 对 ，序 列 相 似 性
9 9 % ，可以鉴别为相同种。研究分离的新疆哈巴
河县野生牛肝菌菌种，与皱皮疣柄牛肝菌的子实
体 形 态 特 征 相 似 ，且 B L A ST 检索结果显示二者
rT S 序列的最高相似率为98. 4 % 。
大量研究表明，牛肝菌的种类、生长与地形地
貌 、植 被 、气 候 条 件 、土壤结构等因素有着十分紧
密的关系，尤其是植被与气候起到相当重要的作
用 。研究表明，额尔齐斯河沿岸野生牛肝菌与银
白杨形成紧密的共生体系，同 时 ，土壤湿度和植被
覆盖度对菌体的生长发育影响很大〇雨后气温偏
低 、适 宜 的 散 射 光 照 、湿 度 较 大时发生多，子实体
生 长 快 .个 体 较 大 ，菌 肉 较 松 软 ，菌盖表面少有龟
裂 。而在沙漠绿洲等较干旱的环境下，子实体生
长 缓 慢 ，个 体 小 ,菌 肉 紧 密 硬 实 ，菌盖表面常龟裂。
室内分离培养结果表明，菌 柄 、菌盖以及两者
交界处均能形成菌丝。 由菌柄分离的菌丝形成最
快 ，污染率由大到小依次为菌盖 > 菌 柄 - 菌 盖 交
接 处 > 菌柄。该菌种虽然能够成功地在室内进行
分 离 ，但截止目前尚未能够成功培养。
由于野生牛肝菌的食用价值以及经济价值都
很 高 ，尤其是幼嫩菌 体 的 经 济 价 值 更 高 ，因 此 ，当
地居民在菌盖尚未展开、孢子未成熟之前就过度
采 摘 ，导致孢子无法成熟和传播，严重影响了当地
th e w ild b o le te seq u e n ce s a n d re fe re n c e sequ ences
野 生 牛 肝 菌 的 繁 衍 ；同 时 ，由于采摘人数过多，严
重的踩踏和挖掘等行为也极大地影响了野生牛肝
菌的生长环境, 致使该野生牛肝菌日渐稀少，采摘
困 难 ，因此该野生牛肝菌的保护及人工驯化等工
作亟待开展。
4 结 论
从 形 态 学 观 察 ，新 疆 生 产 建 设 兵 团 第 十 师
1 8 5 团野生牛肝菌与隶属于伞菌目（A garicases) 、
牛 肝 菌 科 （B oletaceae) 、庞 柄 牛 肝 菌 属 （Lecci-
m m ) 的 皱 皮 抚 柄 牛 肝 菌 Lecci/mm cbriiwcuZum最
为近似。通 过 IT S 区段对野生牛肝菌及其分离菌
株 进 行 分 子 生 物 学 鉴 定 ，该 野 生 牛 肝 菌 与 Gene-
ba»k 中 AF484445. 1 序列即皱皮疣柄牛肝菌&〇；-
1 匪 c?urjt« c“Z“m 是 同 一 来 源 ，一 致 性 高 达
98. 4 % 。从形态学和分子生物学辅助对其进行鉴
定 ，表 明 该 菌 系 皱 皮 统 柄 牛 肝 菌 ieccimwn cJurtos-
culum Q
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184 新疆农业科学 5 2 卷
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Z H O U Q i a n g 12 , M A D e - y i n g 1 , L I N C h e n - y i 3 ,Q I A N G S o n g 1
( 1 . College o f Agronomy / Key Laboratory o f the Agriculture and Forestry Pest Monitoring and Safety Con
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C hina； 2 . Sanping Farm , The \2 th Division o f X injiang Production and Construction Corps, Urumqiy 8 3 0 0 3 2 ,
China ； 3 . College o f Forestry and Horticulture y X injiang Agricultural University, Urumqi 8 3 0 0 5 2 , China)
A b s tr a c t : 【O b je c t iv e ] A w i l d b o l e t e c o l l e c t e d f r o m t h e r i v e r b a n k o f E r q i s w a s i s o l a t e d a n d i d e n t i f i e d i n
t h i s p a p e r in o r d e r to P r o v i d e s c i e n t i f i c b a s i s f o r t h e p r o t e c t i o n a n d u t i l i z a t i o n o f t h e w i l d e d i b l e f u n g u s .
【M e th o d s 】 O n e i s b y o b s e r v i n g t h e g r o w t h e n v i r o n m e n t ， f o r m o f w i l d p o r c i n i m o r p h o l o g i c a l i d e n t i f i c a t i o n o f
g r o w t h a n d d i s t r i b u t i o n . T h e s e c o n d i s u s i n g m y c o r r h i z a l f u n g i c u l t i v a t i o n m e d i u m . T h e m o l e c u l a r b i o l o g i c a l i -
d e n d f i c a t i o n w a s b a s e d o n t h e P C R a m p l i f i c a t i o n o f r D N A I T S f r a g m e n t s . 【R e s u l t s 】 B y i d e n t i f y i n g t h e m a t u r e
p o r c i n i p i l e u s m o r p h o l o g y i n 6 - 1 3 c m i n d i a m e t e r , a n d t h e e a r l y l a t e s p h e r i c a l t o p t i g h t p a c k a g e l i d i n t o f l a t
h e m i s p h e r i c a l , w h i t e m e a t , m i c r o s t r i p p i n k , s t i p e t o p to w h i t e , b a c t e r i u m t u b e m a d e o f w h i t e g r a d u a l l y b e
c o m e b r o w n w i t h d a r k y e l t o w , t u b e h o l e w a s s m a l l . S t i p e 4 - 1 2 c m l o n g , t h i c k 2 - 6 c m , n e a r l y c y l i n d r i c a l ,
l i g h t b r o w n o r y e l l o w i s h b r o w n , I n t e r n a l s o l i d , b a s e s l i g h t l y e x p a n d e d . S p o r e p r i n t r o u n d b r o w n . H y p h a o f t h e
b o l e t e w a s i s o l a t e d s u c c e s s f u l l y f r o m t h e p a r t s o f c a p , s t i p e a n d t h e j o i n t p a r t o f c a p a n d s t i p e . T h e i s o l a t i o n
s u c c e s s r a t e w a s h i g h e r i n t h e p a r t o f s t i p e t h a n t h a t o f t h e o t h e r p a r t s , a n d t h e g r o w t h r a t e o f h y p h a w a s t h e
f a s t e s t a s w e l l . T h e P C R a m p l i f i c a t i o n o f r D N A IT S f r a g m e n t s s u g g e s t e d t h a t b o t h t h e l e n g t h o f IT S f r a g m e n t s
a m p l i f i e d f r o m s p o r o c a q D a n d h y p h a i s o l a t i o n s w e r e a r o u n d 1 , 0 0 0 b p w i th 9 6 % i d e n t i t y . N e i g h b o r - J o i n i n g
p h y l o g e n e t i c t r e e o f r D N A T H E I R f r a g m e n t o f d i f f e r e n t b o l e t e s w a s b u i l t u s i n g D N A S t a r C l u s t a l W m e t h o d .
【C o n c lu s io n 】 F r o m t h e m o r p h o l o g i c a l o b s e r v a t i o n ，t h i s w i l d p o r c i n i b e l o n g s t o a g a r i c a l e s ( A g a r i c a s e s ) o r d e r
o f b o l e t a c e a e ( B o l e t a c e a e ) , w h i c h a p p r o x i m a t e s to w r i n k l e d s k i n w a r t h a n d l e b o l e t u s o f w a r t h a n d l e b o l e t u s .
F r o m t h e m o l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o n o f t h e w i l d B o l e t u s w i t h g e n e b a n k s e q u e n c e o f A F 4 8 4 4 4 5 . 1 n a m e l y w r i n k l y
s k i n l e c c i n u m d u r i u s c u l u m i s t h e s a m e s o u r c e , w h o s e h o m o lo g y i s u p to 9 8 . 4 % .
K e y w o r d s ： b o l e t e ；i s o l a t i o n ；i d e n t i f i c a t i o n ；X i n j i a n g ； t h e r i v e r b a n k o f E r q i s
F und p ro jec t S u p p o r te d by S p ec ia l F und for M ajor P ro je c ts of 11 th e 12tli F iv e Y e a r - p l a n M of X in jia n g U ygu r A u tonom ous R eg ion (2 0 1 1 3 0 1 0 4 -
2 - 2 ) an d Innovation P ro jects o f U n iversity S tud en ts o f X in jiang A g ricu ltu ra l U niversity ( 2 0 1 2 )