全 文 ：食用菌学报 2010.17(2):26～ 31
收稿日期:2009-12-16原稿;2010-03-25 修改稿
基金项目:国家“十一五”科技支撑项目(编号:2008BADA01)、云南省应用基础研究项目(编号:2005C0003M)的部
分研究内容
作者简介:颜　军(1983-), 男 , 2009年毕业于云南大学云南省生物资源保护与利用重点实验室 ,硕士 , 主要从事食
用菌的分离 、培养和鉴定研究。
＊本文通讯作者　E-mail:Z haozhw@ynu.edu.cn
文章编号:1005-9873(2010)02-0026-06
两个牛肝菌分离株的鉴定与培养
颜　军1 , 2 , 李　涛1 , 马绍宾3 , 赵之伟1＊
(1云南大学省部共建生物资源保护与利用国家重点实验室培育基地 ,微生物多样性可持续利用教育部重点实验室 ,
云南昆明 650091;2昆明市疾病预防控制中心 ,云南昆明 650091;3云南大学生命科学学院 , 云南昆明 650091)
摘　要:采用组织分离法从市售牛肝菌子实体分离得到两株性状稳定的分离株 Lq4-2 和 Be2425 ,利用 ITS序
列分析并结合分离子实体的形态特征对两分离株进行鉴定 ,并对其基础生物学特性进行了研究。分离株 Lq4-
2鉴定为牛肝菌科(Bolet aceae)成员 ,分离株 Be2425 鉴定为广义美味牛肝菌(Boletus edulis s.l.);两分离株能
在 PDA 培养基和MRD 合成培养基上良好生长;菌丝生长的适宜温度为 25 ～ 28 ℃, 适宜 pH 为 5 ～ 6 , 最佳氮
源为酒石酸铵;Lq4-2 的最佳碳源为葡萄糖 , 而 Be2425 的最佳碳源为果糖和葡萄糖。
关键词:牛肝菌;组织分离株;转录间隔区;生物学特性
　　牛肝菌是一类著名的外生菌根真菌 ,不仅具
有重要的生态价值 ,还具有很高的食用价值和药
用价值。菌种分离培养是牛肝菌人工驯化栽培 、
菌根化育苗和菌丝体发酵的基础 。目前大多牛
肝菌难于分离和继代培养。因此 ,筛选牛肝菌优
良菌株 ,探讨其适宜的人工栽培生长条件具有重
要意义。
本文以云南牛肝菌主产区的市售新鲜子实
体为材料 ,通过组织分离方法获得性状稳定的纯
培养菌株 ,提取其菌丝体 DNA 进行 I TS 序列分
析 ,并初步研究了分离株的生物学特性 ,旨在为
其进一步的开发应用提供参考。
1　材料与方法
1.1 材料
1.1.1 子实体
　　用于分离菌株 Be2425的子实体 2007年 7月
购自云南省玉溪市峨山县集贸市场 ,担子果肉
质 ,菌盖直径 4.2 cm ,表面平滑 ,无光泽 、无黏液 ,
中凸 ,半球形 ,棕黄色;菌肉较滑脆 ,淡黄色;菌管
2.1 ～ 14 mm ,灰黄色 ,菌孔单孔型 ,孔口圆形 、近
圆形;菌柄长 8.1 cm ,直径1.8 cm ,中生 ,近柱形 ,
棕黄色 ,表面具网纹 ,基部略膨大呈臼形。
菌株 Lq4-2 的子实体 2006年 7月购自云南
省昆明市禄劝县集贸市场 ,菌盖直径 3.8 cm ,中
凸 ,呈半球形 ,淡桃红色间有不均匀分布的淡红
色斑点 ,表面光滑 ,盖缘具略不规则的膜状延伸;
菌管单层 ,长 0.8 ～ 2.3 mm ,近柄处管口呈不规
则的多角形;菌肉较滑脆 ,伤后不变色;菌管和菌
盖肉易分离;菌柄长 5.2 cm ,直径 1.8 cm ,中生 ,
近柱形 ,淡黄色 ,菌柄表面具网纹型纹饰 ,表面网
络明显。
1.1.2 培养基
　　PDA 用于母种分离和继代培养 , PDB 用于
培养温度和 pH 筛选试验 。MRD 、PDA 等 8 种
培养基(见表 1)用于培养基筛选试验 。以上供试
培养基于 121 ℃、1 ×105 Pa 下灭菌 20 min ,
备用 。
1.2 组织分离和培养
　　参照白淑兰等[ 1] 描述的方法进行组织分离
培养 、纯化 , PDA 平板 25 ℃菌丝培养 ,扩繁培养
2周用作后续的实验菌种 。
1.3 菌丝体 DNA提取
　　取两分离株直径约 1 cm 的扩大培养物分别
接种于装有 PDA平板(9 cm),25 ℃培养30 d ,收
集菌丝体 ,参照曾东方等[ 2] 的描述方法进行菌丝
第 2 期 颜　军 ,等:两个牛肝菌分离株的鉴定与培养
体处理和总 DNA 提取 。
1.4 ITS基因扩增及测序
　　利用真菌 ITS通用引物对 ITS4/ ITS5[ 3] ,参
照 LEONARDI 等[ 4] 方法进行 ITS1-5.8S-ITS2
扩增 , 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR产物经 DNA 胶回收试剂盒(OMEGA-E.
Z.N.A., 美国)回收纯化。纯化的目的 DNA
片段测序工作由北京三博远志生物有限公司
完成。
1.5 系统进化树的构建与分析
　　测得序列用 BLAS T 程序在 GenBank 中进
行相似性比较 , 选取相似性较大的序列 , 用
Laserg ene 软件包的 MegA lign程序进行排序 。
以彩色豆马勃(P isol ithus t inctorius)为外类群 ,
应用 Mega4.1软件包构建了 Neighbour-Joining
系统发育树 ,采用重抽样法(Bootst rapping)对
分枝节 点 的置 信度 进 行评 价 , 抽 样重 复
1 000次 。
1.6 生物学特性研究
1.6.1 培养基筛选试验
　　分别取直径约 1 cm 的活化菌种接种 8种供
试培养基平板(9 cm),25 ℃培养 30 d , 3个重复 。
记录不同培养基上的长势 、菌落特征等 ,并每隔
2 d用十字交叉法测量菌落直径 。
1.6.2 最适温度筛选试验
　　取直径约 5 mm 的活化菌种接种于装有
100 mL PDB 的 250 mL 三角瓶中 ,分别在 15 、
20 、25 、28 、30 、35 、40 ℃静置培养 30 d ,过滤收集
菌丝 ,80 ℃烘干至恒重 ,测量菌丝体干重 。每处
理 3个重复。
1.6.3 最适 pH 筛选试验
　　灭菌后 PDB用 1 mol/ L HCl或 NaOH 调整
pH 分别为 3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、10(Sarto rius Pb-10
型酸度计测定),25 ℃培养 30 d ,接种以及菌丝体
干重的测定同 1.6.2 。每处理 3个重复。
1.6.4 碳源 、氮源单因子试验
　　参考 1.6.1培养基筛选试验结果 ,选择两菌
株均生长良好的合成培养基(其中琼脂不添加)
作为基础培养基 ,分别用相同 C/N 分子含量的葡
萄糖 、果糖 、乳糖 、甘露醇 、山梨醇 、蔗糖 、麦芽糖 、
淀粉 , KNO 3 、N aNO 3 、NH4 Cl 、(NH 4)2HPO 4 、酒
石酸铵 、酵母浸膏 、牛肉浸膏 、蛋白胨代替其中的
碳/氮源 ,制作不同碳/氮源试验培养基;接种 ,培
养以及菌丝干重测定方法同 1.6.2。每处理 3个
重复 。
2　结果与分析
2.1 ITS序列扩增 、系统进化树的构建与分析
　　以分离株 Lq4-2 和 Be2425的菌丝体基因组
DNA 为模板 ,经PCR扩增 ,均得到一条清晰的特
异性条带(大小分别约 600和 700 bp)(图 1),序
列 GenBank 登 录 号 分 别 为 GQ984159
和 GQ984158。
图 1　分离株 Lq4-2 和 Be2425 的 ITS区段
PCR产物的电泳图
Fig.1　Electrophoretic separation of PCR-amplified
ITS fragments from strains Lq4-2 and Be2425
　　ITS 序列系统发育树分析结果表明 ,分离株
Be2425与夏牛肝菌 、铜色牛肝菌 、网柄牛肝菌和
美味牛肝菌具有极近的亲缘关系 ,形成支持率为
100%的广义美味牛肝菌复合群(B .edul is s.l.)
(图 2)。BLAST比对结果显示 ,该菌株 I TS 序列
与 GenBank 中 的 美味 牛肝 菌菌 株 Chu11
(DQ397949)具有 100%的相似性 ,与菌株 YM4
(EF646277)及 YM6(EF646278)具有 99%的相
似性 ,结合子实体的形态学特征 ,该分离株鉴定
为广义美味牛肝菌(B .edul is s.l.)。分离株
Lq4-2与绒盖牛肝菌属 、牛肝菌属和 Bothia 等属
聚成一个支持率很高(BP=95)的系群 ,结合子实
体形 态学 特 征 , 初 步 将其 归 于牛 肝 菌 科
(Boletaceae)(图 2)。
2.2 生物学特性
2.2.1 培养基对菌丝生长的影响
　　分离株 Lq4-2和Be2425在 8种供试培养基上
的生长情况如表 1所示 。分离株 Lq4-2以 PDA
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食　用　菌　学　报 第 17 卷
　　　分枝上的数字是 1 000次自展的数据支持率
Num bers above the b ranches are bootst rap values(%)of 1 000 replicates
图 2　基于分离株 Lq4-2 和 Be2425 的 ITS序列构建的 NJ系统发育树
Fig.2　Phylogenetic tree based on ITS sequences from Lq4-2 , Be2425 and other boletes
培养基上的生长最快 ,长势最强 ,其次为查氏培
养基 、改良 Kottke 培养基和 MRD 培养基;在
PDA 培养基上 ,菌丝微黄 ,气生菌丝发达 ,产褐
色素 , 培养后期产生大量液滴状分泌物;在
MRD 培养基上 ,菌丝棕黄色 ,边缘菌丝略深 ,气
生菌丝不发达 , 中凸起 ,未产生液滴状分泌物 。
分离株 Be2425 在 PDA 培养基上生长最快 ,长
势好 ,其次为MRD 、查氏培养基 、16#培养基;再
次为MS 、改良 Kottke 培养基和 PACH 培养基;
在 PDA培养基上 ,菌丝纯白 ,气生菌丝发达 ,产
褐色素 ,并产生液滴状分泌物;在 MRD 培养基
上 ,菌丝洁白 ,后期呈米黄色 ,中凸起 ,气生菌丝
发达 ,产黑色素 ,产生棕黄色液滴状分泌物;在
16
#培养基上 , 菌丝微黄 , 气生菌丝少 ,菌落平
整 ,边缘整齐 ,产黑色素 ,产生微黄透明液滴状分
泌物。
2.2.2 温度 、pH 对菌丝生长的影响
　　Lq4-2和 Be2425分离株菌丝在20 ～ 30 ℃均
能够生长 ,最适生长温度为 25 ～ 28 ℃(图 3-A);
两分离株在 pH 为 4 ～ 9时均能够生长 ,在弱酸性
环境(pH 为 5 ～ 6)下生长较好(图 3-B)。
2.2.3 不同氮源 、碳源对菌丝生长的影响
　　分离株 Lq4-2最适宜碳源为葡萄糖 ,其次为
淀粉 、甘露醇 、果糖 、麦芽糖及蔗糖 ,山梨醇和乳
糖较差;对于菌株 Be2425果糖 、葡萄糖为较好碳
源 ,其次为甘露醇 、麦芽糖及山梨醇 ,淀粉 、乳糖
和蔗糖较差(图 3-C)。
分离株 Lq4-2适宜氮源为酒石酸铵 、磷酸氢
28
第 2 期 颜　军 ,等:两个牛肝菌分离株的鉴定与培养
二铵 、牛肉浸膏;菌株 Be2425适宜氮源为酒石酸
铵 、牛肉浸膏 、酵母浸膏 、氯化铵 、蛋白胨和磷酸
氢二铵;两分离株均以酒石酸铵为氮源时的菌丝
生物量最高(图 3-D)。
表 1　Lq4-2 和 Be2425 在 8 种不同培养基上的生长情况
Table 1　Growth of isolates Lq4-2 and Be2425 on eight dif ferent culture media
培养基
Medium
Lq4-2 Be2425
生长速度
Growth Rate(mm/d)
生长势
Growth vigor
生长速度
Growth Rate(mm/ d)
生长势
Growth vigor
MRD[ 5] 0.19±0.04 b ++ 0.69±0.04 b +++
PDA 0.90±0.21 a +++ 0.82±0.13 a +++
改良 Kottke[ 6]
Improved Kottke
0.22±0.05 b + 0.47±0.05 c ++
查氏 Czapek s [7] 0.23±0.04 b + 0.67±0.04 b +
MS[ 7] / / 0.59±0.08 b ++
PACH [ 5] / / 0.36±0.03 c +
16#＊ / / 0.64±0.03 b +++
MMN[ 5] / / / /
＊16#培养基:葡萄糖 10 g,果糖 5 g ,麦芽糖 5 g ,酵母粉 5 g ,黄豆粉 2 g ,酒石酸铵 0.25 g , KH2 PO4 1 g ,MgSO4 0.25 g , CaCl 2 0.1 g, ZnSO4·
7H2O 0.25 g,琼脂 20 g,水 1 000 mL, pH 6.5;“/” :菌丝不生长;“ +++” :菌丝致密, “ ++” :菌丝长势一般 ,“ +” :菌丝疏松
＊16#medium was composed of glucose 10 g, fructose 5 g , maltose 5 g , yeast powder 5 g, soybean meal 2 g , ammonium tartrate 0.25 g,
KH2 PO4 1 g ,MgSO4 0.25 g , CaCl2 0.1 g , ZnSO4·7H2O 0.25 g , agar 20 g , H2O 1 000 mL , pH 6.5;“/” :no growth;“ +++” :dense
mycelium , “++” :aver age mycelium , “ +”:sparse mycelium;MRD medium consisted of (per 1 000 mL):glucose 20 g, t ar taric acid amine
0.5 g, KH2 PO4 1 g , MgSO4·7H2O 0.5 g, FeCl3(1%)1 mL , trace element solution 1 mL(per 1 000 mL , FeSO4·7H2O 0.6 g, CuSO4·5H2O
0.063 g , MnSO4·4H2O 0.5 g, ZnSO4·7H2O 0.277 g , Na2MoO4·2H2O 0.027 g, H3BO3 0.845 g), vitamin B1(1μg/mL)1 mL , agar 16 g
图 3　两分离株在不同培养温度(A)、pH(B)、碳源(C)、氮源(D)下的菌丝生物量
Fig.3　Effect of temperature(A), pH(B), carbon source(C)and nitrogen source(D)on fungal biomass production
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食　用　菌　学　报 第 17 卷
3　讨论
　　由于牛肝菌分离菌株难以人工栽培出子实
体 ,限制了经典方法 ———柯赫法则在纯培养菌种
鉴定中的应用 。MELLO 等曾用 I TS 序列为基
础的分子系统进化分析方法对欧洲市售牛肝菌
进行鉴定[ 8] ,MOOR等也曾用此方法检测欧洲市
场上食品(Expensive food)中是否含有美味牛肝
菌和褐环粘盖牛肝菌[ 9] 。本研究成功地通过测
定两分离株 ITS1-5.8S-ITS2区段的序列并构建
系统发育树 ,结合分离子实体形态特征来分析研
究其分类地位 ,为牛肝菌分离物的分类鉴定提供
了一条有效途径。
分离株 Lq4-2从市售单个子实体共分离 10
支斜面 ,其中 5支菌落萌发生长 ,转接 12 代后性
状趋于稳定;菌株 Be2425分离 10支斜面 ,其中 8
支萌发生长 ,转接 5 代后性状趋于稳定;两菌株
能在 PDA 培养基上继代培养近 20 代 , 性状稳
定 ,为探讨牛肝菌菌丝体在纯培养条件下其营养
和生长条件等提供了较为理想的实验材料 。两
分离株在 20 ～ 30 ℃均能生长 ,其适宜生长温度
为 25 ～ 28 ℃,这与自然环境中牛肝菌形成子实
体的温度(20 ～ 26 ℃)[ 10] 相接近 。YAMANAKA
等也在实验温度 25 ～ 28 ℃下成功培养出牛肝菌
子实体[ 10] 。
两分离株均在 PDA 培养基上生长最快最
好 ,但碳源单因素研究发现两分离株的最佳碳源
不同 。美味牛肝菌 Be2425分离株的最佳碳源为
果糖和葡萄糖 ,这一结果与邓百万和陈文强[ 11] 的
研究结果一致 ,但与梁军等[ 12] 的研究结果不同 ,
表明美味牛肝菌不同菌株对营养的利用偏好存
在一定的差异 ,这种差异使得利用种内个体差异
进行优良菌株的筛选成为可能。
对多数菌根真菌来说 ,氨态氮比硝态氮容易
吸收利用 ,对有机态氮也能很好地吸收利用[ 13] 。
本研究结果也证实了这一结论 ,两分离株最佳氮
源都为酒石酸铵 , 且对有机氮源都能较好地
利用 。
pH 对真菌生长的影响极为显著 , pH 过低会
限制真菌的呼吸作用和对营养物质的利用 ,还会
导致真菌菌丝过度吸收 NH 4 + ,降低对其它离子
如 K + 、Mg2+等的吸收利用 , 从而影响菌丝生
长[ 14 , 15] ;同时 ,pH 过高则会降低外生菌根真菌的
水解酶活性 ,影响其对基质营养的利用[ 16] 。本研
究表明两个菌株均能在 4 ～ 9的 pH 范围内生长 ,
适宜 pH 为 5 ～ 6。此结果与梁军等人[ 12] 的研究
结果相似 。
关于牛肝菌的分离培养国内外已有很多研
究报道 ,但总体上看大部分牛肝菌都能分离成功
而不能继代培养 ,本研究也得出相似的结果 。在
前期的研究中 ,笔者从 50多个子实体分离得到
180多个分离株 ,但绝大多数分离株不能继代培
养 ,还有少数分离株虽能继代培养 ,但生长缓慢
(未发表数据),表明牛肝菌母种分离 、继代培养
的适宜营养条件和生长因子等尚需深入研究。
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[本文编辑] 　于荣利
Isolation and Culture of Two Bolete St rains
YAN Jun
1 , 2 , LI Tao1 , MA Shaobin3 , ZHAO Zhiwei1＊
(1Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-resources , and Key Laboratory for Microbial Resources of the
Ministry of Education , Yunnan University , Kunming , Yunnan 650091;2Kunming Center for Disease Control and
Protection , Kunming , Yunnan 650091 , 3School of Life Sciences , Yunnan University , Kunming , Yunnan 650091 , China)
Abstract:Two bole te str ains , Lq4-2 and Be2425 , were isolated using standard tissue culture methodology
from fruit bodies purch ased at two local markets , and assigned to the Boletaceae and Boletus edulis sensu
lato , r espectively based on internal tr anscribed spacer (ITS1-5.8S-ITS2) sequence analysis.Both strains
exhibited highest mycelial growth r ates and growth vigor on potato dextrose agar , although sever al other
media also suppor ted fungal growth.Both str ains gr ew optimally between 25 ～ 28 ℃, be tween pH 5～ 6 , and
with ammonium tar tr ate as the N source.Among sever al ca rbon sources tested , glucose supported the highest
Lq4-2 growth ra tes , and either fr uctose or glucose in the case of Be2425.
Key words:Bole te isolates;internal tr anscribed spacer(ITS)sequences;biologic al char acter istics
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