全 文 ：青藤碱对 UUO 小鼠肾组织间质纤维化
与炎症因子表达的干预作用
①　浙江中医药大学　(杭州　312000)②　浙江中医药大学附属二院(杭州市中医院)肾病实验室　(杭州　310007)
杨汝春①②　王永钧②　林京莲①　王　军②　朱晓玲②
　　〔摘　要〕　目的:通过抗风湿药青藤碱对 UUO 小鼠肾组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smoo th muscle actin ,α-SMA)、炎症
介质细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule 1 , ICAM -1)、单核细胞趋化因子(monocy te chemoattractant protein 1 ,
MCP-1)表达的影响 , 探讨其防治肾间质纤维化作用及其机制。方法:实验采用小鼠单侧输尿管结扎(UUO)模型 ,用不同剂
量青藤碱进行干预 ,用血管紧张素受体抑制剂蒙诺作为对照。肾脏病理用 HE 和 Masson 染色;肾组织α-SMA 表达采用免
疫组化;ICAM-1 蛋白质表达采用 Western-blotting 方法检测;MCP-1 基因表达采用逆转录-聚合酶链式反应(RT -
PCR)方法。结果:UUO 模型组小鼠肾间质纤维化程度以及肾组织α-SMA的表达较假手术组显著增高 ,肾小管间质中炎细
胞浸润亦较假手术组显著增强;青藤碱各治疗组肾间质纤维化程度 、α-SMA 和 ICAM-1 蛋白 、MCP-1 基因表达均显著低
于模型组;蒙诺治疗亦可显著降低肾间质纤维化程度和肾组织α-SMA 的表达 ,但对于炎细胞浸润和炎症因子抑制作用显著
较青藤碱弱。而且未见其具有抑制 ICAM-1 表达的作用。结论:抗风湿药青藤碱可显著抑制肾间质纤维化和肌成纤维细胞
的积聚 ,可能与其显著抑制肾组织炎症因子的表达及炎细胞浸润有关。
〔关键词〕　青藤碱　平滑肌肌动蛋白　细胞间黏附分子-1　白细胞趋化因子-1
Effects of Sinomenine on Renal Interstitial Fibrosis and the
Expression of ICAM-1 and MCP-1 in UUO Mice Kedney
YANG Ruchun , WANG Yongjun , LIN Jinglian , et al
Laboratory of Nephropathy in Hangzhou Tradit ional Medicine Hospital , Hangzhou (310007)
　　ABSTRACT　Objective:To investigate the effects o f Sinomenine(SIN)on renal interstitial fibrosis and the expression of in-
flammatory facto r in mice kedney with the Unilateral Ureteral Obstruction(UUO).Methods:Mice were randomly assigned to shame
operation g roup(shame proup), UUO group , Sinomenine and ACEI treatment group after UUO.The protein expression ofα-
SMA and ICAM-1 were assessed by immunohistochemistry or Western-blotting;MCP-1 mRNA w ere detected by using reverse
transcription-polymerase chain reaction analyses(RT-PCR).And pathological changes f the lig ated kidneys were observed a t the
same time.Results:In comparison with the shame g roup , the protein levels ofα-SMA , ICAM-1 and the m RNA expression MCP
-1 in UUO mice and treatment groups increased significantly , meanw hile Sinomenine and ACEI significantly reduced the expres-
sion ofα-SMA and the section percentag e of interstitial fibrosis in ligated kidneys.The effects of Sinomenine on the expression of I-
CAM-1 and MCP-1 were more significant than ACEI.Conclusion:The therapeutic effects of SIN renal interstitial fibrosis may
partially related to downregulate the expression of ICAM-1and MCP-1.
KEY　WORDS　Sinomenine　α-smooth muscle actin　Intercellular adhesion molecule 1　Monocy te chemoattractant protein 1
　　肾小管间质纤维化(renal interstitial f ibrosis , RIF)
是小管间质病变最主要的表现和肾小球病变转归的
主要因素[ 1] , RIF 的发病机制已成为研究热点 。肾小
管间质炎症病变促进肾间质纤维化的进程 ,细胞间黏
附因子(ICAM -1)和单核细胞趋化因子(MCP-1)是
诱导炎性细胞向肾间质组织浸润和聚集的主要炎症
分子 ,可加剧组织的损伤和延缓组织的修复[ 2] 。有研
究显示 ,青藤碱在降低循环免疫复合物 ,减少蛋白尿 ,
改善肾功能具有确切疗效[ 3] ,但对肾脏间质纤维化和
炎症因子的影响未有深入研究。本实验以小鼠单侧
输尿管梗阻(unilateral ureteral obst ruction , UUO)模型
作为研究对象 ,研究青藤碱对肾间质纤维化和炎症因
子 ICAM -1和 MCP -1表达的影响。
材料与方法
1　实验动物　清洁级昆明种小鼠(浙江省中医药
·195·中国中西医结合肾病杂志 2007年 4月第 8卷第 4期　CJITWN ,April 2007 , Vol.8, No.4　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
研究院提供)70只 ,雄性 ,6 ～ 8周龄 ,体重(18±2)g 。
2　药物与试剂　青藤碱纯品 ,西安天成医药生
物公司;蒙诺片 ,中美施贵宝制药有限公司;小鼠抗人
ICAM -1单克隆抗体 、抗小鼠 IgG抗体 、ECL(Amer-
ishan , Pharmacia Biotech , OK)、醋酸纤维素膜(Ger-
many ,Schleicher&Schuell)、Trizol逆转录和扩增试剂
盒及引物合成 ,上海生物工程公司 。
3　方法
3.1　实验分组和 UUO 造模方法　小鼠随机分
成6组 ,分别为:假手术组 、模型组 、青藤碱低剂量治
疗组 、青藤碱中剂量治疗组 、青藤碱高剂量治疗组 、蒙
诺治疗组。参照文献报道方法[ 1] ,小鼠以乙醚麻醉
后 ,行左侧输尿管结扎术。假手术组仅游离左侧输尿
管 ,不结扎 。
3.2　给药方法　青藤碱低 、中 、高治疗组分别予
以青藤碱 18 mg·kg-1·d-1 、36 mg·kg-1·d-1 、72 mg·
kg-1·d-1(相当于成人用药剂量的 5倍 、10倍 、20倍)
灌胃。蒙诺治疗组以 2 mg·kg-1·d-1(相当于成人用
药剂量的 10倍)灌胃。假手术组和模型组以等量生
理盐水灌胃。
3.3　标本收集　在 UUO术后 21 d将各组小鼠处
死 ,取术侧肾组织一半置于 10%福尔马林固定液中 ,用
作病理切片和免疫组化实验;另一半置于液氮中冷冻保
存 ,以备提取总 RNA和蛋白质 ,用于逆转录-聚合酶链
式反应(RT-PCR)和 western-blotting 检测。
3.4　肾组织 HE染色病理形态学观察　将 10%
福尔马林固定的肾组织常规石蜡包埋切片 ,经 HE染
色后 ,光镜下观察肾小管间质的病理改变;采用北京
航空航天医学图像采集及分析系统每张切片随机采
集5个不重叠视野 ,分别测量每个视野中肾间质细胞
总面积和 ,取平均值 。肾间质细胞相对面积=肾小管
间质细胞总面积/整个视野面积。
3.5　肾组织 Masson染色病理观察　将 10%福
尔马林固定的肾组织常规石蜡包埋切片 ,经 Masson
染色后 ,光镜下观察肾小管间质的病理改变;采用北
京航天大学医学图像采集及分析系统 ,光镜(×400)
下采集 Masson染色肾脏病理图像 ,蓝色为纤维化阳
性染色区。每张切片随机采集 5个不重叠视野 ,分别
测量每个视野中肾小管间质纤维化阳性染色的相对
面积 ,取平均值 。肾小管间质纤维化相对面积=肾小
管间质纤维化阳性(蓝色)面积/整个视野面积 。
3.6　免疫组织化学检测肾组织α-SMA 蛋白表
达　免疫组化采用 SABC 法 , 2%牛血清白蛋白和不
加一抗作为阴性对照。采用北京航天大学医学图像
采集及分析系统 ,每张切片光镜(×400)下随机采集
5个不重叠视野 ,棕黄色为阳性染色区 。测量棕黄色
阳性染色面积 ,取平均值。阳性相对面积=阳性面积/
整个视野面积 。
3.7　Western-blotting 测定 ICAM-1蛋白表达　
匀浆器充分研磨 、匀浆肾组织或细胞 ,RIRA细胞裂解
液裂解 ,再用 2 ml针筒和针头来回抽提 10 ～ 15次 ,在
冰上放置 30 min ,4 ℃、14 000 r/min 离心 15 min ,弃
沉淀 ,BCA法测定蛋白浓度 。取蛋白质总量为 30 μg
的蛋白 ,在 12%的聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶上
电泳 ,电压 150 V 、约 70 min ,在 4 ℃、250 mA 电流
1.5 h转移至尼龙膜 , 5%脱脂奶粉封闭 1 h ,加入第一
抗体 , 4 ℃过夜 ,去一抗 , PBST 缓冲液洗 3 次 ,每次
10 min ,再加入相应辣根过氧化物酶标记的第二抗体 ,
室温孵育 1.5 h ,ECL试剂显色并曝光成像 ,扫描图像。
3.8　RT -PCR检测测定 MCP -1 mRNA 表达
　TRIZOL法提取细胞总 RNA 。两步法进行逆转录
和聚合酶链扩增反应(RT -PCR), GAPDH 作为内参
照 。PCR反应条件为:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s , 56 ℃
30 s , 72 ℃30 s ,35个循环;72 ℃10 min;扩增产物经
1.7%琼脂糖凝胶电泳后 ,凝胶成像系统成像 ,用 Bio
Rad quanity one 软件对条带进行半定量分析 , MCP-1
mRNA的相对含量分别用其与 GAPDH 特异性条带的
积分光密度之比值表示。引物序列:MCP-1(452 bp),
正链:5′ATGCAGGTCTCTGTCACGCT 3′,负链:5′TCA-
CACTAGTTCTCTGTCATACT 3′;GAPDH(307 bp),正
链:5′GCAGTGGCAAAGTGGAGATTG 3′,负链:5′GCA-
GAAGGGGCGGAGATGAT 3′。
4　统计学方法　用 SPSS 11.5软件对数据进行
分析处理 ,计量资料用( x ±s)表示 ,方差齐者 ,多组间
采用 one-way ANOVA ,组间两两比较用 LSD法。
结　　果
1　HE染色观察青藤碱对肾组织病理形态学的
影响　光镜下可见 ,模型组小鼠肾小管不同程度扩
张 ,甚至小管和间质的结构基本消失;肾小管上皮细
胞肿胀 、空泡变性 ,有的坏死 、脱落;肾间质大量炎细
胞弥漫性浸润 ,模型组肾间质细胞面积占总面积的比
值较假手术组显著增加(P <0.01)。而青藤碱各治疗
组以均可在一定程度上改善上述病理变化 ,蒙诺治疗
组亦可较模型组显著降低肾间质细胞的相对面积 ,但
作用显著弱于青藤碱各组 。见表 1。
表 1　青藤碱对 UUO 小鼠肾小管间质内
细胞相对面积的影响　( x ±s)
组别 n 肾小管间质细胞面积/视野总面积
假手术组　　　 10 0.141±0.017
模型组　　　　 10 0.272±0.030■
青藤碱低剂量组 10 0.216±0.016■☆
青藤碱中剂量组 10 0.207±0.016■☆
青藤碱高剂量组 10 0.216±0.023■☆
蒙诺组　　　　 10 0.244±0.028■☆＊◎◎◆
　注:与假手术组比较 , ■P<0.01;与模型组比较 , ☆P<0.01;与青藤碱
·196·　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中国中西医结合肾病杂志 2007年 4月第 8卷第 4期　CJITWN ,April 2007 , Vol.8, No.4
低剂量组比较 , ＊P<0.01;与青藤碱中剂量组比较 , ◎P<0.05 , ◎◎P<
0.01;与青藤碱高剂量组比较 , ◆P<0.01　(下同)
2　青藤碱对 UUO 小鼠肾小管间质纤维化及
α-SMA蛋白质表达的影响　Masson结果显示 ,模型
组肾小管间质纤维化较假手术组显著增高 ,随着青藤
碱剂量增高 ,青藤碱各治疗组肾小管间质纤维化相对
面积逐渐减少 ,高剂量青藤碱组的间质纤维化程度显
著低于蒙诺组。免疫组化显示 ,在假手术组小鼠肾小
管间质和肾小球中 ,除血管外 ,几乎无α-SMA 的表
达;UUO 模型组小鼠肾组织中的α-SMA阳性染色
主要在肾小管间质大量出现 ,而肾小球内α-SMA阳
性表达不明显。经青藤碱治疗后 , 肾小管间质中
α-SMA表达均显著低于模型组小鼠 ,中 、高剂量青藤
碱治疗组α-SMA表达显著低于蒙诺治疗组。见表 2。
表 2　青藤碱对 UUO小鼠肾间质纤维化的影响　( x±s)
组别 n 肾小管间质细胞面积/视野总面积
肾小管间质α-SMA
阳性面积/视野总面积
假手术组　　　 10 0.072±0.012 0.008±0.013
模型组　　　　 10 0.365±0.019■ 0.251±0.022■
青藤碱低剂量组 10 0.269±0.026■☆ 0.212±0.025■☆
青藤碱中剂量组 10 0.207±0.020■☆ 0.154±0.022■☆＊
青藤碱高剂量组 10 0.176±0.009■☆ 0.166±0.021■☆＊
蒙诺组　　　　 10 0.288±0.018■☆＊◎◎◆ 0.175±0.013■☆＊◎◎
　　3　青藤碱对 UUO小鼠肾组织 ICAM-1蛋白表
达的影响　在假手术组肾组织中有 ICAM -1的少量
表达 ,UUO模型组小鼠肾组织中 ICAM-1的蛋白表
达显著高于假手术组。经青藤碱治疗后 , 肾组织
ICAM -1的蛋白表达均较模型组显著降低 ,中 、高剂
量青藤碱治疗组 ICAM -1的表达显著较低剂量青藤
碱治疗组降低;蒙诺未表现有抑制肾组织 ICAM -1
表达的作用。见图 1。
4　青藤碱对 UUO 小鼠肾组织 MCP-1 mRNA
表达的影响 　假手术组小鼠肾组织几乎无 MCP -1
mRNA的表达 , UUO 模型小鼠肾组织中 MCP -1
mRNA 的表达较假手术组显著上调;青藤碱各治疗组
肾组织MCP-1 mRNA的表达均较模型组显著下调 ,
青藤碱高剂量组肾组织几乎检测不到 MCP-1 mRNA
的表达;蒙诺也可显著下调肾组织 MCP-1 mRNA 的
表达 ,但效果不及青藤碱中 、高剂量组显著。见图 2。
讨　　论
肾小管间质损伤是各种炎症性肾脏疾病进展为终
末期肾衰竭的最后共同通路 ,以间质炎细胞浸润和小管
损伤为特征 ,并最终导致间质纤维化。近年来研究证
明 ,肾小管上皮细胞在最初的损伤或刺激以后 ,可被激
活并表达各种趋化分子 、黏附分子及生长因子等 ,通过
招募巨噬细胞 、多核白细胞和 T 细胞等细胞直接或间
接放大肾间质损伤 ,同时细胞因子之间的协同作用可以
启动更多的炎症反应途径而导致肾间质纤维化。
ICAM -1通过介导细胞与细胞之间 ,细胞与细胞
外基质之间的相互黏附 ,促进炎性细胞活化及浸润 ,
参与炎症反应 、免疫识别及细胞跨膜启动信号传
递[ 2 ,3] 。趋化因子是启动肾间质炎症反应瀑布的关键
因素。欧阳春等[ 4]在 UUO 大鼠模型中的研究发现 ,
MCP-1 参与了肾间质纤维化。除了趋化单核细胞
外 ,MCP-1还可能通过诱导巨噬细胞释放溶酶体 ,产
生氧自由基以及表达一些促炎因子来进一步加重组
织的炎症反应。最新研究显示 , MCP -1可体外诱导
肾小管上皮细胞转分化 ,作为独立因素参与肾间质纤
维化的发展[ 5] 。
本研究采用经典的单侧输尿管结扎(UUO)致肾
间质纤维化模型 ,术后 21 d观察到 ,小鼠梗阻肾发生
广泛的肾小管上皮细胞坏死及间质纤维化 ,肾小管和
间质α-SMA 蛋白大量表达 ,同时肾间质细胞增多 ,
相对面积较假手术组显著增大 。α-SMA不仅是肾小
管上皮细胞或间质细胞向 MyoF 转化的标志 ,也是肾
间质纤维化的重要指标。青藤碱可显著减轻 UUO小
鼠梗阻肾间质纤维化程度 , 同时显著下调肾组织
ICAM -1和 MCP-1的表达 ,并表现一定的剂量依赖
性 。蒙诺抑制肾间质纤维化以及 ICAM -1 和 MCP
-1表达的作用均较青藤碱中 、高剂量显著减弱 。体
外研究亦显示 ,青藤碱可显著下调 IL -1β诱导的肾
小管上皮细胞 ICAM -1和 MCP -1的基因表达[ 6] 。
现代药理研究显示青藤碱有明显的抗炎和免疫调节
作用 ,对体液免疫 、细胞免疫及 IL-1 、TNF -α、环氧
化酶(COX)等炎症介质均有抑制作用[ 7 , 8] 。因此 ,青
·197·中国中西医结合肾病杂志 2007年 4月第 8卷第 4期　CJITWN ,April 2007 , Vol.8, No.4　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
藤碱抑制肾间质纤维化和 MyoF 的积聚的作用可能
通过减缓肾间质炎症损伤 、降低肾脏局部血压 、抑制
转分化细胞的增殖等多方面起作用的。
参　考　文　献
1.Nath KA.Tubulointerstitial changes as a major determinant in
the prog ression of renal damage.Am J Kidney Dis , 1992 , 20
(1):1-17.
2.周同 , 孙桂芝 ,张玉梅 ,等.大鼠单侧输尿管梗阻后黏附分子
与树突状细胞表达分布及抗黏附干预的影响.中国微循环 ,
2003 , 12(7):337-340.
3.张玉梅 , 孙桂芝 ,周同.细胞黏附分子与肾脏疾病.上海第二
医科大学学报 , 2004 , 24(7):524-527.
4.欧阳春 , 宁建平 , 周巧玲.单侧输尿管梗阻大鼠肾间质 MCP
-1 的表达及其意义.中南大学学报(医学版), 2004 , 29(5):
558-561.
5.郑法雷 , 文晓彦 ,李艳 ,等.单核细胞趋化因子和马兜铃酸 Ⅰ
对体外人小管上皮细胞转分化的综合影响.中华内科杂志 ,
2000 , 39(12):831-834.
6.杨汝春 , 王永钧 , 林京莲 , 等.青藤碱对肾小管上皮细胞 MCP
-1 、ICAM-1 基因表达的影响.中国中医药科技 , 2005 , 12
(6):372-374.
7.龙湘俊.青藤碱研究进展.中南药学 , 2000 , 31(5):299-301.
8.王文君 , 王培训 ,李晓娟.青藤碱抗炎机理———青藤碱对人外
周血单个核细胞环氧化酶活性及其基因表达的影响.中国中
药杂志 , 2003 , 28(4):352-354.
(收稿:2006-08-09　修回:2006-10-18)
·体会与交流·
自体尺侧动-静脉内瘘的设计与建立
李海燕①　廖祖春①　叶浩波①
①　四川省德阳市人民医院肾内科　(德阳　618000)
　　终末期肾脏病(CKD)Ⅴ期血液透析病人理想的血管通路
应当能够为血液透析提供足够的血流量 , 使用时间长 , 而且并
发症少。自体动脉-静脉内瘘是目前最理想的选择 , 标准内瘘
的首选部位是双手腕关节处的头静脉-桡动脉内瘘 , 但由于患
者先天自身血管发育异常 ,解剖变异以及同一肢体多次进行内
瘘成形手术等原因占血液透析病人的 8%～ 10%, 此部分疑难
血管内瘘的设计及建立 , 已成为血液净化领域关注的课题[ 1] 。
我院现有长期血透患者 58 个 , 其中 6 人因上述情况成功地进
行了尺侧动-静脉内瘘的制作并使用 ,现报告如下。
资料与方法
1　临床资料　长期血透患者 58 人 , 桡侧动-静脉内瘘
49 例 ,尺侧内瘘 6 例。 6 例中女性 2 例 , 男性 4 例。 疾病构成
为慢性肾炎 3 例 ,高血压肾损害 2 例 , 糖尿病肾病 1 例 , 首次造
瘘2例 , 再次造瘘 4 例。
2　手术方法
2.1　术前评估与设计　(1)血管彩超检查(DOPPLER),
证实桡侧头静脉主干闭塞 ,血管穿刺损害严重和(或)桡动脉血
流量不足 ,但尺侧动脉及贵要静脉条件较好[ 2] 。(2)ALLEN 试
验检查手术侧手掌的动脉弓的交通供血情况良好。(3)避开曾
行中心静脉或外周大静脉插管后 , 有可能导致血管狭窄的
上肢。
2.2　手术方法　将 DOPPLER探侧检查的尺侧动-静脉
作出皮肤标示 ,消毒 、铺巾 , 2%利多卡因局部浸润麻醉 , 逐层剥
离出动脉及静脉 ,清除血管外膜组织 , 结扎静脉运端 , 动脉侧切
口 0.5～ 0.8 cm , 行端侧吻合术 , 连续缝合血管壁 , 静脉与动脉
夹角呈 30°～ 45°之间 ,以减少因血流动力学异常而导致血栓形
成的机会[ 3] 。
2.3　术后观察　6 例病人 , 尤其是高危人群(如糖尿病 、
高龄同一侧肢体多次进行内瘘成形手术者), 术后 24 h 内观察
病人的自觉症状 , 与对侧进行比较 ,进行客观的检查 ,包括皮肤
温度 、感觉功能检查及运动功能检查。
3　术后使用情况　6例尺侧动-静脉内瘘平均成熟时间
(30±5)d ,彩超血流量(780±110)ml/min , 通畅率达 100%, 满
足了临床血液净化的需要 。无 1 例合并肢体肿胀 、盗血 、缺血
及肢体动能障碍等并发症 ,迄今最长使用时间达 3 年。
讨　　论
尺侧动-静脉内瘘手术的设计与建立为血管通路的质量
保证提供了又一个选择和机会 ,腕部内瘘的建立较肘部有如下
优点:(1)比肘部手术容易;(2)较肘部内瘘的并发症少;(3)提
供更多的血管穿刺部位;(4)方便患者治疗过程中和术后压迫
止血。通过 6 例尺侧内瘘术的设计和建立 ,我们体会如下:(1)
首选腕部的血管建立内瘘;(2)术前纠正患者存在的肢体肿胀 、
心包 、胸腔积液及心律失常;(3)术前彩色多普勒评估患者手术
肢体的动静脉血流量;(4)手术缝合方式以端侧吻合为宜 , 动静
脉夹角 30°～ 45°;(5)术后血管成熟期 4～ 6 周为宜。
参　考　文　献
1.Harland RC.Placement of permanent vascular access devices
surgical cinsiderations.Adv Ren Replace Ther , 1994 , 1(2):99
-106.
2.王海燕.建立通路前对病人的评价.见:王海燕.慢性肾脏病
及透析的临床实践指南.第 1 版.北京:人民卫生出版社 ,
2003.463-465.
3.梁发启.血管手术的基本原则.见:梁发启.血管外科手术学.
第 1 版.北京:人民卫生出版社 , 2002.7-13.
(收稿:2007-01-02)
·198·　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中国中西医结合肾病杂志 2007年 4月第 8卷第 4期　CJITWN ,April 2007 , Vol.8, No.4