全 文 ：植 物 学 报 l , 9 1 , 3 ( 1 2 ) : 9 2 7一 9 3 1
A e ot B
o 加 n i e “ S i n i e 。
不同理化因子对新疆紫草愈伤组织生长
及紫草宁衍生物合成的影响 *
叶和春 尹作鸿李国凤 吴 新 董教望 伍正蓉
(中国科学院植物研究所 , 北京 10 0 0 4 4 )
摘 要
本文报道了不同理化因子对新疆紫草 (价 。动 ia eu hc ” 二。 ) 愈伤组织生长及紫草宁衍生
物生物合成的影响。 试验结果表明 , 有利于愈伤组织生长和色素形成的合适温度为 巧℃ ; 培
养基 p H 值的最适范围为 5 . 3一 5 . ;8 白光对愈伤组织的生长和紫草宁衍生物的形成具有强烈
的抑制作用 ;培养基中添加 o . Z m g / L 的 IA A 和 0 . s m g / L 的 K T 对愈伤组织的生长具有促
进作用 ; I A A和 KT 对紫草宁衍生物合成无促进作用 ,并随两者浓度的提高 , 培养物中紫草宁
衍生物的含量与产量逐渐降低。
关键词 新疆紫草 ; 愈伤组织培养 ; 紫草宁衍生物 ;理化因子
E F F E C T S O F P H Y S I C A L A N D C H E M IC A L F A C T O R S O N C A L
。
L U S G R O W T H A N D S H IK O N I N D E R IV A T IV E F O R M A T IO N
IN T H E C A L L U S C U L T U R E S O F A R N E B I A
E U C 月R O 几么A
Y e H e
一 c h u n
,
Y i n Z u o
一
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,
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W u X i n
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( 1 0
52 12“ : e o j B
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A b s t r a e t
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.
A e e o r d i n g t o e x -
p e r ime
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e r a t u r e 王o r e a l l u s g r ow t h a n d s h ik o n i n d e r i v a t i v e f o r m a t i o n w a s
25
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C
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.
3一芍 . 8 . A u rh o r s a l s o f o u n d
ht a t bo th c a l l u s g r o w t h a n d s h i k o n i n d
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C a l l u s g r o w t h w a s P r o m o t e d w h e n 0
.
2 m g / L I A A a n d 0
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.
F u
r th e r m o r e
, th e c o n t e n t : ` n改
本文于 l , 91 年 2 月收到 , 同年 , 月收到修改稿。
* 国家 “ 七五 ” 攻关课题 。
植 物 学 报 3 3 卷
y i e l d o f s h i k o n i n d e r i v a t iv e s i n
K T e o n e e n t r a t i o n i n t h e m e d i a
.
e u l t u r e s d e e r e a s e d i n e o m p a n y w i th ht e I n C T e a s e o f I A A a n d
K e y w o r d ; A
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s i e a l a n d
c h e -
m i e a l f a e t o r s
新疆紫草 ( A : en ib 。 亡 “ 。 hr 口 m a) 系紫草科的一种常用中草药 〔刘 , 药用部位为根 。 紫草
的主要有效成分是其所含的蔡酮色素 ,除供药用外 ,还广泛应用于食品 、 化妆品中【10J 。 由
于大量采挖 , 栽培困难 , 紫草的资源 日趋减少 。 日本进行硬紫草 (白 , h口 ; p。 ; m “ m o yr , h ; 口 -
hr i z 口 , ) 细胞大量培养生产紫草宁衍生物的研究 ,至今已有 10 多年 ls, , ,7] , 并于 1 9 8 3 年 , 成
为应用植物细胞大量培养生产有用代谢产物的第一个实现工业化生产的成功先例 4[] 。 我
们于 1 9 8 8 年首次报道了与上述硬紫草同科不 同属植物新疆紫草的组织培养 ,从四个不同
的外植体都诱导形成了愈伤组织 , 并对其中的紫草宁衍生物进行了分析 『习 。 本文报道不
同理化因子对新疆紫草培养细胞的生长及紫草宁衍生物合成的调节作用 , 以探讨适合于
新疆紫草细胞培养的优良培养条件 , 为进一步开展新疆紫草细胞悬浮培养和大量培养提
供可靠的参数指标 。
材 料 与 方 法
(一 ) 实验材料
供试材料新疆紫草愈伤组织 , 为本实验室筛选获得的优良无性 系 A 一 lo
(二 ) 愈伤组织培养
生长培养基选用 A G 一 7 , 即改良的 L S 培养基 。 将 L S 培养基 6[] 中的 N 4H N O , 改为
( N H
;
)
2 5 0 、 , 含量为 4 6 3 m g / L , 附加 I A A ( o . Zm g / L ) 、 K T ( l . o m g / L ) 。 生产培养基选用
A P
一成筛选编号 ) , 即 M 一 9 基本培养基 10[J , 只是 N a eF 一 E D T A 浓度同 L S 培养基 , 附加
K T ( o
.
s m g / L )
。 培养基在高压灭菌前将 p H 调至 , , 8 , 25 ℃下黑暗培养 21 天 。 鲜重与千
重增加的计算方法为 : 鲜重增加 ~ 收获鲜重 /瓶一接种鲜重 /瓶 ; 干重增加 ~ 收获干重 /
瓶 一接种千重 /瓶 。
(三 ) 愈伤组织中紫草宁衍生物含量与产量的测定
收获的愈伤组织在 65 ℃ 下烘干 , 碾碎 , 称取干愈伤组织 0 . 30 9 , 用石 油醚反复提取至
无色 , 定容为 10 m l , 在 5 2 0n m 处用 75 1分光光度计 (上海分析仪器厂产 7 , I G 型 ) 测溶
旅的吸光度 ( E ) 。 回归方程 : E 一 10 . 9X (X 为紫草宁衍生物的浓度 , 单位 : m g / L )
紫草宁衍生物含量 ( C , 务D w ) 与产量 ( Y , m g / L )的计算方法 :
C ~
E X 10 0
10
。
9 X 0
.
3 X 1 0 0 0
x 1 0 0并 : Y ~ C x D W X 1 0 0 0
( D W 为每升培养基上所收获的愈伤组织千重 ,单位 : g / L )
结 果 与 讨 论
(一 ) 温度对愈伤组织生长及紫草宁衍生物生物合成的影响
在试验中 , 我们选择了 巧℃ 、 25 ℃及 35 ℃三个梯度 , 结果如图 1所示 。 图 1的结果表
12 期 叶和春等 : 不同理化因子对新疆紫草愈伤组织生长及紫草宁衍生物合成的影响 92 ,
明 , 对紫草愈伤组织生长及紫草宁衍生
物生物合成的适宜温度在 2 5℃ 左右。 当
培养温度为 15 ℃ 或 35 ℃ 时 , 对愈伤组
织的生长与紫草宁衍生物的 合 成 均 不
利 。 从图 1 可以看出 , 在这两种培养温
度下 , 愈伤组织的鲜重 、 干重的增加及紫
草宁衍生物的含量 、 产量都 明 显 低 于
25 ℃培养下的结果 。 其中 , 在 巧℃ 与
35 ℃ , 愈伤组织的千重的增加分别只有
25 ℃ 时的 52 . 57 外 , 4 8 . 91 % 。 而紫草宁
衍生 物 的 产 量 分 别又 有 25 ℃ 时 的
2 7
.
4 0 多 , 2 7 . 7 6多 。 这一结果与 T a b a t a
等 ( 19 8 5 ) 1[ 的 在硬紫草细胞培养中所得
到的结果一致 。 在骆驼 蓬 ( eP g a , 。 m
h 。 ; m 。 l 。 ) 愈伤组织培养中也具有 类 似
的结果 , 当温度为 25 ℃ 时 , 生物碱的合
成达到最大值 ,随着培养温度的提高 ,次
生代谢产物的含量迅速下降 〔8] 。 我们试
勃之 - 鲜 飞三重氢F rF e瓜 w e i g h嗯日 事二 ,。
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.
5~
15
温 度
2 5 3 5
T e m p e r a t u r e ( U )
图 l
F i g
温度对愈伤组织生长和紫草宁衍生物合成的 影响
1 E f f e e t s o f t e m p e r a t u r e o n
注 1、
d
s
h i k o n i n d e r i v a t i v e
c a l l u s g r o w t h
f o r m a t i o
l z
验表明温度过高 、 过低都严重影响紫草愈伤组织的生长 , 特别不利于紫草宁衍生物的合
成 。 因此 ,在实际应用中 , 新疆紫草的组织培养应为 25 ℃ 左右为宜 。
(二 ) 光照对紫草愈伤组织生长及紫草宁衍生物合成的影响
在对新疆紫草愈伤组织培养中 , 我们采用了白色光照 (荧光灯连续光照 ,光强 l o 0 1x)
及黑暗两种处理 ,结果如图 2 所示 。 在 白色光照下 , 紫草愈伤组织的鲜重与干 重的增加分
别只有黑暗条件下的 3 , . 24 %与 兑 . 17 多 , 而紫草宁衍生物的含量与产量则分别只有黑暗
条件下的 6 . 52 %与 3 . “ 多 。 观察还发现 , 在白色光照下培养的愈伤组织表面呈黄白色 , 而
黑暗培养条件下的愈伤组织表面呈鲜红色 。 这一结果表明 , 白色光不仅抑制了愈伤组织
的生长 , 而且几乎完全抑制愈伤组织中紫草宁及其衍生物的形成 。 这一结果显示了应用
紫草组织与细胞培养工业化生产紫草宁衍生物的优越性 。 因为采用黑暗培养不仅可以节
省大量的光照能源 ,而且在发酵培养时也省去了照光所带来的工艺设计方面的麻烦 。
对于高等植物细胞大量培养生产有用代谢物质来说 , 光照条件是一个十分重要的物
理因子 。 尽管光因子对次生代谢产物形成的调控机理尚很少开展研究 , 但在组织与细胞
培养中 , 光因子对次生产物生物合成的促进或抑制效应 , 却有很多报道 。 如在 日本黄连
( C
o
tP is 夕。 p 口 , i` 。 ) 细胞培养中 ,光对细胞的生长和小孽碱的合成均具有抑制作用 。 光照
下培养细胞干重的增加只有在黑暗条件下的 74 务 , 同时小孽碱的含量也降低。 在光照下
连续培养后细胞变成白色而且生长缓慢1l[ 。 T ab a at 等 ( 19 7 4 ) 9[] 报道 , 光严重抑制硬 紫
草培养物中茶醒色素的形成 。 我们在新疆紫草培养的研究中 , 同样发现光因子对细胞的
生 长和紫草宁衍生物合成均具有明显的抑制作用 ,而且成为环境因子的关键因素 。
(三 ) 不 同 p H 值对新疆紫草愈伤组织生长及紫草宁衍生物合成的影响
植 物 打 卷一一一一卜 _一口\叻通.梦二`去名昌。书砚ópl斗时袱导牟州小瓣绒八甘U氏协枷引鲡引划六O一26勺;。ū口。月一qsJ O帕舒村偌oQ石.4公.5民/妙ù荡一兰匕PJ os荟u卜ǎ召的.斌\摆上图。q的。J耘O。”时已蕊
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2.0耐。忍翼仆
铸
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乌渺侧玲姨脚阁教
p H值 声 V a l u。
图 2 光照对愈伤组织生长和紫草宁衍生物形成的影响 图 3 H值对愈伤组织生长和紫草宁衍生物形成的影响
F i g
.
2 E f f e e t s o f l i g h t o n e a l lu s g r o w t五
。 P七
F i g
·
3
a n d s h i k o n i n d e r iv a t i v e f o r m a t i o n
E f f e e t吕 o f p H v a l u e o n c a l l u s g r o w t h
a n d 一 h ik o n in d e r i v a t iv e f o r m a t i o n
我们选择了 p H 值分别为 4 . 3 , .4 8 , 5 . 3 , 6 . 3 等 5 个处理水平 , 试验结果 (图 3 ) 表明 :
p H值为 , . 3时 , 鲜重与干重的增加最多。 p H 值从 4 . 3 到 5 . 8 的范围内 , 愈伤组织的生长均
较好 ,而 p H 值为 6 . 3 时 , 愈伤组织的生长受到严重抑制 。 紫草宁衍生物的形成以 p H 值
为 5 . 8 时最好 。 p H 值小于 5 . 8 时 , 紫草宁衍生物的含量明显下降 ; 声 值大于 , . 8 时 , 虽然
紫草宁衍生物的含量与 p H 值为 , . 8时相差无几 , 但 由于细胞生长受到严重抑制 。 因此 ,
对工业性生产来说 , 是不可取的 。 据此 , 我们认为紫草愈伤组织培养的最适 p H 值应在
5
.
3一 5 . 8 之间 。
(四 ) 不同浓度的 IA A 与 K T 对紫草愈伤组织生长及紫草宁衍生物生物合成 的影响
T a b l e
表 1
E f f e c t s
K T
o f
和 ! A A 浓度对愈伤组 织生长 的影响
K T a n d I A A c o n c e n t r a t i o n s o n e a l l u s g r o w t h
K T ( m g / l )
I A A ( m g / l )
鲜重增加
1
。
14 + 0
。
1 1
2
。
6 1+ 0
。
3 1
2
.
6 1+ 0
。
5 3
1
,
5 6 + 0
。
2 8
I n c r e a s e o f F w ( g / F l
a s k )
3
.
5 7士 0 . 0 6
斗. 3 3土 0 。 3 3
3
.
7 3土 0 。 3 2
3
。
7 6 + 0
。
3 7
3
。
83 十 0 。 13
3
。
76 + 0
.
13
4
. 斗1十 0 。 9 1
4
.
14土 0 . 4 4
4
。
t ,士 0。 1 7
3
.
6 7士 0 . 6 6
碍 . 5 2士 0 . 0 7
4
.
8 4士 0 。 5 0
,`Un…
八U0n,1
由表 1 可以看出 , 对新疆紫草愈伤组织的生长以 0 . 2 m g / L 的 IA A + o . sm g L/ K T
组合的效果较为理想 , 因为这一组合是以较低的激素浓度 , 达到较高的细胞生长量。 尽管
在 I A A 与 K T 浓度均较高的组合中 , 愈伤组织的生长量略有提高 , 但可以认为是在误
1 2 期 叶和春等 : 不同理化因于对新弧紫草愈伤组织生长及紫草宁衍生物合成的影响 9 3 1
衰 2 K T 和 IA A 浓度对萦草宁衍生物合成的影响
T a b l e 2 E f l e e t s o王 K T a n d I A A c o n e e n t r a t i o 公 5 o n s h i k o n i n d e r i , a t i v e f o r m a t i o n
I A A ( m g l L ) K T ( m g / L )
0 0
。
5 1
。
0
色素含量 色素产量 色素含量 色素产量 色素含量 色素产量
P i g m e n t P i g m e n t P i g m e n t P i g m e n t P i g m e n t P i g m e n t
C o n t e n t y i e l d C o n t e n t y i e l d C O D t e n t y i e l d
(% D W ) ( m g / L ) (% D W ) ( m g / L ) (% D W ) ( m g /L )
0 17
。
0 0士 0 . 2 1 2 1 0 8 。 0 13 . 77士 0 . 3 5 17 6 2 。 0 8 · 0 4士 0 。 3 9 10 3 0 。 0
0
。
5 12
。
7 0土 0 . 4 4 1 7 7 8 。 0 1 1 · 1 0士 0 . 2 7 l马今4 。 0 4 · 8 6土 0 。 0 7 5 6 4 。 0
1
。
0 12
。
2 1士 0 。 12 1 6 8 4 。 0 8 。 2 1士 0 。 1 8 9 2 0 。 0 4 . 3 0士 0 . 0 9 5 3 4 。 0
差的范围之内。 由表 2 可以看出 , 对紫草宁衍生物形成以 IA A 、 K T 的浓度均为 o 时最
好 , 并且随着 I A A 、 K T 的浓度的增加 , 紫草宁衍生物的含量与产量均逐渐下降 。 由此认
为 , IA A 与 K T 对新疆紫草培养细胞的生长具有一定的促进作用 , 而对紫草宁衍生 物
的形成无促进作用 , 并随两者浓度的提高而产生抑制作用 。 T ab a at 等 ( 1 9 7 4 , 19 8 5 ) 认
为 I A A 浓度在 10一 7一 10一 sln ol / L 之间 , 不但促 进细胞生长而且还促进紫草宁的生物合
成 。 这一结论和我们所获得的实验结果是不完全一致的 。 据此 , 在生产培养基中有可能
不添加任何外源激素 ,这对工业化生产中降低成本 , 减少人们对添加激素的恐惧心理无疑
是十分有利的 。
通过以上试验 , 初步找出了影响新疆紫草愈伤组织生长及紫草宁衍生物合成的某些
理化因子 。 在这些调控因子中 , 光为关键因子 。 至于不同光质 、光量将产生什么效果以及
光因子的作用机理等有待进一步深人研究 。 本文的试验结果为建立新疆紫草二步培养系
统 , 选择合适的生长培养基和生产培养基提供了可靠的科学依据 。
参 考 文 献
[ l] 李国凤 、 伍正蓉 、 叶和春 、 向桂琼、 芦馥荪 , 19 8队 离体培养的新疆紫草蔡酿色素的诱导形成 。 植物学通报 , :5
8 4一 86 。
〔 2J 高菊红 , 19 8 6 ; 紫草的资源 、 化学 、 药理和临床研究概况 。 中草药 , 1:7 2 “ 一 2 71 。
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,
Y
,
Y
.
H a r
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.
S u g a
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.
M
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o n 。 u l t u r e s o f L i t入o s P e , 。 u 二 。 ,夕t人: o r h i z o , . P l a , : C` 11 R e 户o r z : , ( 1) : 6 1一 63 .
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p r o g r e s s i n 。 o m m e r e i a l 伊 o d u e t ion . In : “ p l a n t T i s s u e a n d e e l l e u l t u r e , , . ( e . E . G r e e n e t a l . e d s . ) , A l a n
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.
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16 9一 1 8 5 ·
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,
L
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N i s h i
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L i t几o s P亡 r娜 “ 叨 。 r 夕t无, 口 r 人i z o n e e l l e u l t u r e s . P h 夕r 口 c 人e 从宕了t r y , 2 8 : 18 7 3一 18 7 7 .
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M
. a n d F
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S k o o g , 1 9 6乡: O r g a n i e g r o w t h f a e t o r r e q u i r e m e n t s o f t o b a e e o t i s s u e c u l t u r e s . P人卜
: i口 1
.
P l a 耳 2 . 1 8 : 10 0一 12 7 .
「7 1 M i z u k a m i , H , M . K o n o比 i m a a n d M . T a b a t a , 19 7 7 : E f f e e t o f n u t r a t i的 a l f a e t or s o n sh i k皿 i n d e r i v a t i v e
f
o 丁I n a t i o n 玉n L矛子石o sP e r 爪 “ 仍 e r 少r人r o r h i Z o ” e a l l u s c u l t u r e ` . P无y才口 c几亡柳 f了才r , . 1 6 : 1 18 3一 1 1 9 6 .
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xE
户. B o招作 y, 2 5 : 1 1 1斗一 1 12 3 .〔 9 ] T a b: t a , M . , H . M i z u k a m i , N . H i r a o k a a n d M . K o n o s h i m a , 1 97斗: P ig m e n t f o m a t i o n i n c a l u s e u l t u r e s of
L i多方o s Pe r解 “ 优 e r 夕z人r o r人三
~
。
P h外 o c h e 那 i了t r y , 1 3 : 9 2 7一 9 3 2 .
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F u ji
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.
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p l a n t S
e 主e n e e , , . (M . z a i t l i n e t a l . e d : 净, A e a d e m i e p r e s s , N e w Y o r k , p p . 2 0 7一2 18 .
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扩夕, 2 0 : 5 4 5一 54 7 .