全 文 ：檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶
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［责任编辑 邹晓翠］
［收稿日期］ 20121105(011)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(61173098)
［第一作者］ 郝鹤，硕士，Tel:15210674987，E-mail:hao6239@ 163. com
［通讯作者］ * 王红，博士，教授，从事中药植物次生代谢与代谢工程研究，Tel:13671003972，E-mail:hwang@ ucas． ac． an
新疆紫草 7 种萘醌类成分的同时测定
郝鹤1，李鹏跃2，叶和春3，池剑亭1，王红1*
( 1. 中国科学院大学，北京 100049; 2. 中国中医科学院中药研究所，北京 100700;
3. 中国科学院植物研究所，北京 100093)
［摘要］ 目的:建立同时测定新疆紫草中紫草酸、紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫
草素、异戊酰紫草素 7 种成分的 HPLC检测方法。方法:选用安捷伦 ZOＲBAX SB-C18(4. 6 mm × 250 mm，5 μm)色谱柱，以乙
腈-0. 03%甲酸为流动相进行梯度洗脱，检测波长 516，254 nm，柱温 30 ℃，进样量 6 μL，流速 1 mL·min －1。结果:7 种萘醌类对
照品在进样量范围内分别与峰面积呈现的良好线性关系(r ＞ 0. 999 1) ;仪器精密度和稳定性 ＲSD 均 ＜ 3%;加样回收率在
97% ～103% (n = 3)。结论:该方法快速、准确、重复性好，可同时定量新疆紫草的 7 种水溶性及脂溶性萘醌类成分，为新疆紫
草的质量评价提供了更为全面的科学依据。
［关键词］ 新疆紫草;愈伤组织;萘醌类色素;高效液相色谱
［中图分类号］ Ｒ284． 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)18-0108-05
［doi］ 10． 11653 /syfj2013180108
Simultaneous Determination of Seven Naphthoquinones in
Crude Extract of Arnebia euchroma
HAO He1，LI Peng-yue2，YE He-chun3，CHI Jian-ting1，WANG Hong1*
(1. University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China;
2. Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100070，China;
3. Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100093，China)
·801·
第 19 卷第 18 期
2013 年 9 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 18
Sep．，2013
［Abstract］ Objective:To establish a new ＲP-HPLC method for simultaneous determination of the seven
naphthoquinones in crude extract of Arnebia euchroma，namely lithospermum acid，shikonin，acetyl shikonin，
deoxyshikonin， isobutyryl shikonin， β， β-dimethylacry shikonin and isovalerylshikonin． Method: Agilent
ZOＲBAX SB-C18 (4. 6 mm ×250 mm，5 μm)column was used with acetonitrile-pure water (with 0. 03% formic
acid)as mobile phase in gradients elution． The flow rate was 1 mL·min －1，and the UV detector was monitored at
254，516 nm． Ｒesult:All the calibration curves of the seven naphthoquinones showed good linearity in test ranges
(r ＞ 0. 999 1) ;and the overall recoveries were in the range of 97% -103% (n = 3)with ＲSD less than 3% ． The
overall of ＲSD of precision test were less than 3% ． A HPLC method for simultaneous determination of the seven
naphthoquinones in crude extract of A． euchroma was established． Conclusion:The established HPLC method is
rapid，accurate，credible and repeatable for the determination of the seven water-soluble (lithospermum acid)and
liposoluble (the rest of six components)components simultaneously，and provide a more comprehensive scientific
basis for the quality evaluation of A． euchroma．
［Key words］ Arnebia euchroma;calli;naphthoquinones;HPLC
新疆紫草 Arnebia euchroma (Ｒoyle)Johnst具有
清热凉血、解毒透疹等功效［1］，主要含有萘醌类、单
萜苯醌、有机酸、萜类、甾体类、香豆素及内酯、黄酮
类、苯酚类、酚酸类以及多糖类等多种具有生物活性
的化合物［2-3］。新疆紫草的有效药用成分主要集中
在萘醌类色素［4-5］，新疆紫草提取物极性部位的成
分具有增强免疫力［6-8］、止血［9］等功效。目前，《中
国药典》2010 年版中仅以紫草素、β，β-二甲基丙烯
酰紫草素为指标成分［10］进行新疆紫草药材及饮片
的质量控制，缺乏质量评价的科学性和全面性。大
量文献报道［11-13］多以紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫
草素、乙酰紫草素、异丁酰紫草素这几种成分为指
标，很少能兼顾到紫草的水溶性和脂溶性成分。
本试验的材料是能形成萘醌类色素的新疆紫草
愈伤组织，最早由李国凤等［14］获得。在适当培养条
件下，该愈伤组织经过 25 d的培养能收获大量萘醌
类产物。笔者采用梯度洗脱法，建立了同时全面检
测新疆紫草中极性差异较大的水溶性紫草酸及脂溶
性紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、β，β-二甲基丙
烯酰紫草素，异丁酰紫草素、异戊酰紫草素 7 种化合
物的液相色谱法，为科学评价新疆紫草药材、饮片及
其制剂的质量提供了参考依据。
1 材料
1. 1 仪器 Agilent 1200 型高效液相色谱仪(美国
安捷伦公司) ，含柱温箱，标准自动进样器，DAD 阵
列检测器，Agilent chemstation 化学工作站。Mettler
toledo AL 104 型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公
司) ，SB-3200DTN 型超声清洗仪(宁波新芝生物技
术股份有限公司) ，Laborota 4400 型旋转蒸发仪(德
国海道夫公司) ，DGX-9240 型鼓风干燥箱(上海昨
非实验室设备有限公司) ，LＲH-250A 型生化培养箱
(韶关泰宏医疗器械有限公司)。
1. 2 试药 乙酰紫草素对照品(上海同田生物制
品有限公司，批号 11122931)、去氧紫草素对照品
(东京化成工业株式会社，批号 C23420C)、β，β-二甲
基丙烯酰紫草素对照品(东京化成工业株式会社，
批号 C140492C)、异丁酰紫草素对照品(东京化成
工业株式会社，批号 A11000A)、异戊酰紫草素对照
品(东京化成工业株式会社，批号 C01830C) ;紫草
酸对照品(北京翔悦环宇科技发展有限公司，批号
110427)、左旋紫草素对照品(中国药品生物制品检
定所，批号 110769-200405)。新疆紫草药材甲醇提
取液(本实验室提取) ，新疆紫草愈伤组织甲醇提取
液(本实验室提取) ，乙腈、甲醇均为色谱纯，购自
Tedia(美国)公司;水(纯化水，杭州娃哈哈公司) ，
其他试剂均为分析纯。新疆紫草药材采自新疆地
区，由中国科学院植物研究所叶和春研究员提供;新
疆紫草愈伤组织由叶和春研究员提供，本实验室继
代保存。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 选用安捷伦 ZOＲBAX SB-C18(4. 6
mm ×250 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈-0. 03%甲酸为
流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序见表 1，检测波
长 254，516 nm，柱温 30 ℃，进样量 6 μL，流速 1. 0
mL·min －1。
在上述色谱条件下，紫草酸、紫草素、乙酰紫草
素、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰
紫草素、异戊酰紫草素的保留时间分别为 6. 62，
29. 87，39. 08，44. 41，46. 61，48. 5，49. 49 min。
2. 2 对照品溶液的制备 分别准确称量紫草酸
·901·
郝鹤，等:新疆紫草 7 种萘醌类成分的同时测定
表 1 流动相梯度洗脱程序
t /min 乙腈量 /% 0. 03%甲酸 /%
0 20 80
10 30 70
20 45 55
30 55 45
40 70 30
50 85 15
60 85 15
65 20 80
80 20 80
5. 4 mg、紫草素 2. 9 mg、乙酰紫草素 3. 4 mg、去氧紫
草素 2. 8 mg、异丁酰紫草素 3. 6 mg、β，β-二甲基丙
烯酰紫草素 3. 8 mg、异戊酰紫草素 3. 8 mg，置于
1 mL量瓶中，用甲醇定容，在涡旋仪上摇匀，制得质
量浓度为 5. 4，2. 9，3. 4，2. 8，3. 6，3. 8，3. 8 g·L －1的
紫草酸、紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、异丁酰紫
草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素、异戊酰紫草素对照
品溶液。准确称量紫草酸 5. 4 mg、紫草素 2. 9 mg、
乙酰紫草素 3. 4 mg、去氧紫草素 2. 8 mg、异丁酰紫
草素 3. 6 mg、β，β-二甲基丙烯酰紫草素 3. 8 mg、异
戊酰紫草素 3. 8 mg，置于 1 mL量瓶中，用甲醇溶解，
摇匀后定容，制得混标溶液。上清液过 0. 22 μm微孔
滤膜后，避光、冷藏备用。
2. 3 供试品溶液的制备 精密量取新疆紫草甲醇
提取液 20 mL(相当于药材 1. 25 g) ，置洁净蒸馏瓶
中，40 ℃减压蒸干，加入适量甲醇复溶，后转入 10 mL
量瓶，再加入甲醇到刻度，密塞，超声提取 10 min，放
冷，密塞，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续
滤液，以微孔滤膜(0. 22 μm)滤过，即得。
2. 4 系统关系考察 按照 2. 1 所述色谱条件，依次
对混标、新疆紫草药材、新疆紫草愈伤组织样品溶液
进行检测。结果见图 1 ～ 3。
2. 4. 1 线性关系 对 2. 2 中所配制的混标溶液进
行稀释，分别将混标溶液稀释到原溶液的 0. 01，
0. 02，0. 055 6，0. 125，0. 25，0. 333，0. 375，0. 625，
0. 75 倍，用 1 mL 量瓶定容。按照浓度由小到大的
顺序上样，每个样品的进样量为 6 μL，按照 2. 1 的
色谱条件进行检测。以 254 nm 的色谱峰面积 (Y)
对进样量 (X)进行线性回归，绘制标准曲线。结果
表明在进样量范围内线性关系良好。
回归方程 Y紫草酸 = 384. 1X － 7. 596 (r = 0. 999 9)，
线性范围 0. 324 ～ 24. 0 μg;Y 紫草素 = 715. 3X － 7. 596
1. 紫草酸;2. 紫草素;3. 乙酰紫草素;4. 去氧紫草素;
5. 异丁酰紫草素;6. β，β-二甲基丙烯酰紫草素;7. 异戊酰;
A. 254 nm;B. 516 nm(图 2 ～ 3 同)
图 1 混标 HPLC色谱
图 2 新疆紫草愈伤组织提取物 HPLC
图 3 新疆紫草药材提取物 HPLC
(r = 0. 999 9) ，线性范围 0. 174 ～ 13. 05 μg;
Y乙酰紫草素 = 660. 3X － 100. 4 (r = 0. 999 5) ，线性范围
0. 204 ～ 15. 30 μg;Y去氧紫草素 = 904. 2X － 21. 41 (r =
0. 999 2) ，线性范围 0. 168 ～ 12. 6 μg;Y异丁酰紫草素 =
712. 2X － 76. 32 (r = 0. 999 6) ，线性范围 0. 216 ～
16. 20 μg;Yβ，β-二甲基丙烯酰紫草素 = 753. 7X － 108. 1 (r =
0. 999 6) ，线性范围 0. 228 ～ 17. 10 μg;Y异戊酰紫草素 =
638. 6X － 48. 11 (r = 0. 999 2) ，线性范围 0. 228 ～
17. 10 μg。
在 2. 1 所述色谱条件下，对混标和新疆紫草提
取样品进行检测，混标及样品溶液色谱图分别如图
1 ～ 3，各成分的分离度及峰型符合含量测定要求。
2. 4. 2 精密度考察 精确吸取同一对照品溶液，在
2. 1 所述色谱条件下，1 日内连续进样 5 次，记录峰
面积 ＲSD;同一对照品溶液，在 2. 1 的色谱条件下每
天进样 1 次，连续进样 5 d，进样量 6 μL，分别计算峰
面积 ＲSD。紫草酸、紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草
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第 19 卷第 18 期
2013 年 9 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 18
Sep．，2013
素、异丁酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素、异戊酰
紫草素，日内峰面积 ＲSD 分别为 0. 87%，0. 93%，
1. 04%，1. 12%，1. 03%，1. 10%，1. 47%。日间峰面积
ＲSD分别为 3. 93%，3. 08%，1. 88%，3. 27%，2. 57%，
2. 66%，2. 49%。表明仪器精密度良好。
2. 4. 3 重复性考察 对 2. 3 提取获得的新疆紫草
溶液同一样品，同时制备 6 份，按 2. 1 色谱条件进行
检测，计算各物质的含量，紫草酸、紫草素、乙酰紫草
素、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫
草素、异戊酰紫草素获得的 ＲSD 分别为 3. 2%，
0. 56%，0. 27%，1. 48%，0. 56%，0. 54%，0. 24%。
由于紫草酸的含量比较少，因此误差略大。总体来
看，本法的重复性良好。
2. 4. 4 稳定性考察 分别取 2. 3 新疆紫草样品溶
液，按照 2. 1 的色谱条件，在 0，4，8，20，28，48 h 上
样，测定其峰面积。紫草酸、紫草素、乙酰紫草素、去
氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草
素、异戊酰紫草素的 ＲSD 分别为 2. 74%，1. 65%，
1. 45%，1. 42%，1. 40%，1. 49%，1. 45%，表明本系
统的稳定性良好。
2. 4. 5 回收率考察 采用加样回收率方法。取已
知含量的新疆紫草甲醇提取液 10 mL，精密称定 9
份，平均分成 3 份，分别加入 160，200，240 μL，3 个
低、中、高量的混合对照品溶液，按 2. 3 的方法蒸干，
定容至 10 mL，在 2. 1 的色谱条件下测定，各物质的
总量与 ＲSD，结果见表 2。
表 2 新疆紫草愈伤组织提取物中 7 种成分加样回收率试验(n = 3)
成分 样品中量 /mg 加入量 /mg 测得量 /mg 回收率 /% 平均值 /% ＲSD /%
紫草酸 1. 079 0. 864 1. 950 100. 810 102. 389 1. 541
1. 081 1. 080 2. 203 103. 889
1. 083 1. 296 2. 411 102. 469
紫草素 0. 018 0. 464 0. 473 98. 060 99. 609 2. 498
0. 018 0. 58 0. 588 98. 276
0. 018 0. 522 0. 553 102. 490
乙酰紫草素 2. 012 0. 544 2. 571 102. 757 102. 564 1. 659
2. 010 0. 680 2. 718 104. 118
2. 017 0. 612 2. 634 100. 817
去氧紫草素 0. 136 0. 448 0. 582 99. 554 100. 804 1. 140
0. 138 0. 560 0. 704 101. 071
0. 133 0. 504 0. 646 101. 786
异丁酰紫草素 1. 321 0. 576 1. 906 101. 563 102. 368 1. 686
1. 324 0. 720 2. 075 104. 306
1. 328 0. 648 1. 984 101. 235
β，β-二甲基丙烯酰紫草素 0. 324 0. 608 0. 940 101. 316 101. 009 2. 187
0. 327 0. 760 1. 110 103. 026
0. 321 0. 684 0. 996 98. 684
异戊酰紫草素 4. 683 0. 608 5. 305 102. 303 101. 518 2. 394
4. 681 0. 760 5. 467 103. 421
4. 677 0. 684 5. 353 98. 830
2. 5 样品测定 新疆紫草药材与新疆紫草愈伤组
织按照 2. 3 的方法制备样品，所得提取溶液按 2. 1
的色谱条件检测，测定紫草酸、紫草素、乙酰紫草素、
去氧紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素、异丁酰紫草
素、异戊酰紫草素的峰面积，按照回归方程计算出每
克药材中所含上述各成分的含量，结果见表 3。
从表 3 中对比新疆紫草药材与愈伤组织的紫草
素含量可以得出，新疆紫草药材中紫草素含量是愈
伤组织的 20 多倍。比较它们之间的色谱峰可以看
出，愈伤组织提取物看不到明显的色谱峰，在某些情
况下笔者也可以忽略愈伤组织中的紫草素，认为它
不含紫草素。新疆紫草药材中 β，β-二甲基丙烯酰
紫草素含量是愈伤组织的 5 倍左右，但是愈伤组织
中异戊酰紫草素、去氧紫草素、异丁酰紫草素、紫草
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郝鹤，等:新疆紫草 7 种萘醌类成分的同时测定
表 3 新疆紫草药材与愈伤组织 7 种成分含量 mg·g － 1
成分 新疆紫草愈伤组织 新疆紫草药材
紫草酸 1. 000 0. 292
紫草素 0. 0287 0. 617
乙酰紫草素 4. 417 5. 363
去氧紫草素 2. 793 0. 682
异丁酰紫草素 3. 344 0. 682
β，β-二甲基丙烯酰紫草素 0. 595 3. 083
异戊酰紫草素 11. 792 3. 941
酸的含量却高于新疆紫草药材中的相应成分的
含量。
3 讨论
新疆紫草提取物在可见光区和紫外光区都有吸
收峰，笔者增加可见光 516 nm 处检测，主要是由于
在 516 nm处，萘醌类化合物有吸收峰而其他化合物
没有吸收峰，使得在该波长处的色谱峰相对较少，有
利于对萘醌类化合物的研究。本研究使用了 4 种溶
剂，即石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇和乙腈依次对材
料进行提取，该方法简单适用，易于操作，最重要的
是该方法能最大量的提取材料中的各类化合物，为
新疆紫草物质基础的相关研究奠定了基础。
本研究所建立的反相 C18柱高效液相色谱同时
测定紫草酸、紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、β，β-
二甲基丙烯酰紫草素、异丁酰紫草素、异戊酰紫草素
含量的方法，操作简单、快速、重复性好、测定结果稳
定可靠，可用于新疆紫草的质量鉴定，也可以用于对
新疆紫草代谢物谱的研究。
由于新疆紫草至今不能进行有效地人工种植，
再加上市场的需求量日益增长，野生新疆紫草被掠
夺性采挖，从而导致新疆紫草资源日益枯竭，因此，
新疆紫草的药物来源成为一个难题。笔者研究的新
疆紫草愈伤组织生长繁殖快，能克服野生新疆紫草
生长慢、不能快繁的缺点［14］。从表 3 的检测结果可
以发现除紫草素外，其他新疆紫草的有效成分在新
疆紫草愈伤组织中均有大量合成，因此，对新疆紫草
愈伤组织的生理生化特性进行进一步研究，有助于
解决新疆紫草药物来源匮乏的难题。
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［责任编辑 邹晓翠］
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第 19 卷第 18 期
2013 年 9 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 18
Sep．，2013