全 文 ：新疆雪莲遗传转化中 Basta筛选压的确定
武运芳，杨 林，周宜君，韦善君* (中央民族大学生命与环境科学学院，北京 100081)
摘要 ［目的］研究新疆雪莲(Saussurea involucrate Kar． et Kir．)遗传转化中除草剂 Basta的筛选压。［方法］用新疆雪莲愈伤组织或再生
苗转接于含不同浓度 Basta培养基上，观察其存活状况。［结果］浓度为 2 ～12 mg /L的 Basta对雪莲愈伤组织或再生苗的生长有不同程
度的抑制作用。［结论］Basta可以作为新疆雪莲遗传转化体的一种有效筛选剂，筛选压设为 4 ～5 mg /L比较合适。
关键词 新疆雪莲;组织培养;遗传转化;Basta
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)13 －07643 －02
Determination of Best Basta Concentration for the Genetic Transformation of Saussurea involucrate Kar． et Kir．
WU Yun-fang et al (College of Life and Environmental Sciences，The Minzu University of China，Beijing 100081)
Abstract ［Objective］To find out the suitable concentration of herbicide Basta to be used for the transformant screening of Saussurea involu-
crate． ［Method］Callus tissue or regenerated plants were grown on the medium containing different concentrations of Basta． ［Result］ The
growth of callus tissue or regenerated plants was inhibited to different extent by 2 － 12 mg /L Basta． ［Conclusion］4 － 5 mg /L Basta can be
used in Saussurea involucrate transgenic researches．
Key words Saussurea involucrate;Tissue culture;Genetic transformation;Basta
基金项目 中央民族大学青年科学基金资助项目(0910KYQN51)。
作者简介 武运芳(1985 －) ，女，河北邯郸人，硕士研究生，研究方向:
植物与分子生物学，E-mail:huantianxidi1986 @ 126． com。
* 通讯作者，讲师，博士，硕士生导师，从事植物基因工程以
及植物逆境生理与分子生物学研究，E-mail:wei． s． j@ 163．
com。
收稿日期 2012-02-13
新疆雪莲(Saussurea involucrate Kar． et Kir．)是高寒地区
人们常用的一种具有通经活血、暖宫散瘀、散寒除湿和强筋
助阳等多种功能的名贵中草药［1］。长期以来的过度收购、乱
采乱挖使得野生新疆雪莲遭到严重破坏，天然资源面临枯
竭。通过基因工程手段培育优良品种，提高雪莲的人工栽培
效率，是解决雪莲自然资源短缺的有效方法。
在植物转基因研究中通常需要选用适宜的标记以高效
地筛选转化体。目前，常用的选择标记基因有除草剂的抗性
基因———bar、潮霉素抗性基因———hpt 和卡那霉素(Kan)抗
性基因Ⅱ———nptlI。由于 bar 基因兼有选择标记和抗除草剂
Basta的双重功能而倍受欢迎。除草剂 Basta 是 L-谷氨酸的
结构类似物，在植物细胞内与 L-谷氨酸竞争谷氨酰胺合成酶
(GS) ，导致 NH4
+无法与 L-谷氨酸结合形成谷氨酰胺，游离
NH4
+的积累最终使植物细胞的生长受到抑制或死亡。bar
基因编码 Basta的乙酰转移酶可以解除其毒性，因此 bar 基
因的转化体对 Basta有明显的抗性［2］。实际研究中有效选择
雪莲的 bar基因转化体需要选用适宜浓度的 Basta。关于新
疆雪莲对 Basta的敏感性尚未有报道。该试验通过在含不同
浓度 Basta的培养基上培养新疆雪莲愈伤组织或再生苗，观
察并比较各处理中材料的存活状况，确定抑制非转化细胞生
长的适宜浓度，以期为转化体的筛选提供试验方法。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 植物材料。雪莲种子采自新疆，由新疆维吾尔自治
区中药民族药研究贾晓光研究员提供。
1． 1． 2 试剂。Basta(草胺磷铵盐)购自浙江永农化工有限公
司，配成 10 mg /ml水溶液，过滤除菌后备用。
1． 2 方法
1． 2． 1 愈伤组织筛选压的确定。以无菌幼叶和茎基为外植
体诱导获得愈伤组织。取生长旺盛的愈伤组织，切为直径 2
～3 mm 的小块，分别转接到 Basta浓度为 0、2、4、8、12 mg /L
的培养基(MS +2． 0 mg /L NAA +0． 1 mg /L 6-BA)上［3］，每个
处理接 30块愈伤组织，培养 30 d，期间更换 1次培养基。培
养条件为:温度(22 ± 2)℃，光照照度 2 500 lx，光照时间 16
h /d，相对湿度为 70%。观察并记录不同处理的愈伤组织存
活状况。
1． 2． 2 再生苗筛选压的确定。根据愈伤组织的敏感性测定
结果，配制含适宜浓度 Basta 的增殖培养基(MS + 0． 5 mg /L
6-BA +0． 05 mg /L NAA) ，将再生芽丛转接到该培养基上。
每个处理 15丛苗，其培养条件、观察和结果记录同“1． 2． 1”。
2 结果与分析
2． 1 Basta对雪莲愈伤组织生长的影响 在无除草剂的新
鲜培养基上，新疆雪莲愈伤组织生长旺盛，颜色逐渐变绿
(图 1A)。在含有 2 mg /L Basta培养基上，愈伤组织略有生
长，颜色偏黄，褐化死亡不明显;当 Basta浓度为 4 mg /L时，
培养 4 周后 75%的愈伤组织褐化并趋近死亡，其余的组织
块上面的部分有存活并保持绿色，但没有明显生长迹象(图
1B) ，将该绿色部分切下转接到新鲜培养基中，其很快死亡;
当 Basta浓度达 8 mg /L以上时，培养 2 周后愈伤组织死亡
率为 100%。
2． 2 Basta对雪莲再生苗生长的影响 根据愈伤组织的敏
感性试验结果，雪莲再生苗对 Basta的敏感性测定中设置了
0、2和 5 mg /L Basta浓度的 3组试验。与愈伤组织相似，在
无除草剂的培养基上，植株生长、增殖旺盛，叶片挺立，色绿
(图 2A)。当培养基含 2 mg /L Basta 时，植株生长非常缓
慢，底部叶片呈黄绿色，向下弯卷，但没有死亡(图 2B)。
将 2 mg /L Basta培养基上的再生苗转接到 5 mg /L Basta 培
养基上时，植株生长受到明显的毒害作用，2 周后即黄化死
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(13):7643 － 7644 责任编辑 王春艳 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.13.108
亡(图 2C)。
3 结论与讨论
在植物转基因研究中，适合的筛选压可以有效减少因选
择压过小造成的非转化体逃逸现象，也可避免无效地加大选
择压所造成的浪费及其负面效应［4］。不同植物对 Basta的敏
感性有差异，例如，对匍匐小菊(Dendranthema morifolium cv．
pink carpet)的适宜筛选浓度为 0． 2 mg / L［4］，对玉米来说选
择压以 6 mg /L为宜［2］。该试验测定了新疆雪莲对 Basta 的
敏感性，结果表明，Basta浓度为2 ～12 mg /L时愈伤组织或再
生苗的生长即受到不同程度的抑制作用，这表明它是一种有
效的转化体筛选剂。虽然 Basta 浓度为 2 mg /L时对愈伤组
织或组培苗的生长也有抑制作用，但处理 4 周后死亡率低，
这将提高在转化体筛选中的假阳性以及加大工作量;Basta
浓度为 8 mg /L及以上时，2 周后愈伤组织 100%死亡，这说
明该筛选浓度过高;相比之下，4 ～ 5 mg /L 的筛选压比较合
适，在该浓度下培养 4周后，愈伤组织逐渐褐化死亡，再生植
株逐渐黄化死亡。该结果为 bar基因转化体的筛选提供了指
导方法。
注:A为对照;B为 4 mg /L Basta。
图 1 Basta对雪莲愈伤组织生长的抑制作用
注:A为对照;B为 2． 0 mg /L Basta;C为 5． 0 mg /L Basta。
图 2 Basta对雪莲再生苗生长的抑制作用
在转化体筛选中，抗 Basta的现象还不足以完全确定植
株是否为转基因愈伤组织，实际研究需要多次筛选培养或分
化出株系后，再结合 PCR 检测、Southern 杂交等方法来进行
筛选。
参考文献
［1］江苏新医学院．中药大辞典:下册［K］．上海:上海科学技术出版社，
1977:2087．
［2］赵天永，王国英，黄忠，等．玉米愈伤组织对草丁膦的抗性及氨基酸对
这种抗性的影响［J］．植物学报，1998，40(1):1010 －1014．
［3］杨林，覃筱燕．新疆雪莲的组织培养及植株再生［J］．中央民族大学学
报:自然科学版，2006，15(1):26 －29．
［4］高凤娟，黄丛林，马荣才，等．匍匐小菊遗传转化过程中选择压力的确
定［J］．北方园艺，2008(10):147 －149．
4467 安徽农业科学 2012 年