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收稿日期：344494:9!;修回日期：344!94!94:
$通讯作者：<(/：8= 7 3> 7 33#=48?
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新疆紫草素诱导人大肠癌细胞的凋亡
蒋英丽， 宋今丹$
5卫生部细胞生物学重点实验室，中国医科大学医学分子生物学研究所2 辽宁 沈阳 !!444! 6
【摘 要】 目的：探讨新疆紫草素对人大肠癌细胞株 $$G33: 的诱导凋亡作用。方法：应用 H<<比色法检测新
疆紫草素对人大肠癌细胞株 $$G33:的增殖抑制作用，用 IJK琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术 5 L$H6及
时间（3>、>8、?3 %）后，IJK琼脂糖凝胶电泳呈现细胞凋亡的典型梯形条带图谱，L$H出现明显的亚二倍体峰，
中图分类号：P3## 文献标识码：K 文章编号：!444 7 >=?Q5344! 6!3 7 !## 7 4>
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细胞凋亡是由基因编程控制的一种细胞生理性
死亡，是机体维持正常的生理活动所必需的。近年
的研究发现，细胞凋亡在许多疾病的发生，尤其在肿
瘤的发生、发展和转归中起着重要作用 _ ! ‘，诱导肿瘤
细胞凋亡是临床肿瘤治疗的新思路。新疆紫草素是
从新疆紫草根中提取的萘醌类化合物 5见图 ! 6，可
对多种肿瘤2 如小鼠腹水型肉瘤 U!84、自发性乳腺肿
瘤、恶性葡萄胎等起抑制作用 _ 3， ‘，但尚未见其诱导
肿瘤细胞凋亡的报道。本实验中，我们对新疆紫草素
图 E 新疆紫草素化学结构图
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!#$ 蒋英丽%等 & 新疆紫草素诱导人大肠癌细胞的凋亡
图 ’()琼脂糖凝胶电泳结果
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G427,;2; 61 14/ A,;A/;1+612,; ,0 !H !3 I -. 0,+ J? 4&
诱导人大肠癌细胞株 ::>??@凋亡进行了研究。
! 材料与方法
! ! 材料
人大肠癌 ::>??@ 细胞株由美国 ’6;6L*6+M/+
肿瘤所惠赠，新疆紫草素为中科院新疆化学所提供，
经无水乙醇溶解，无菌过滤。四甲基唑氮蓝（5NN）和
脱氧核苷酸末端转移酶（N’N）介导的原位凋亡检测
试剂盒购自华美生物工程有限公司。
! # 细胞培养
细胞在含 !HO小牛血清的 ’5K5 培养液中，
JP、#O :Q?条件下培养，RS 4换液一次。取对数生
长期细胞进行实验。
! $ %&&法
将贴壁细胞用含 H& H?OK’N)的 H& ?#O胰蛋白
酶消化后计数，调整细胞浓度为 ? T !HR I -.，接种于
@$孔板，待 ?R 4细胞贴壁后加入新疆紫草素。实验
时分成 H& !、!U H、!HU H !3 I -. 个药物浓度组及对照
组，每组 !?复孔。分别于加药后第 !、?、天测定各孔
的吸光度值 V !值 W，测定前每孔加 # -3 I -.的5NN ?H
!.，温育 R 4，弃上清后，加入二甲基亚砜 ?HH !. I孔，
同时振荡至结晶完全溶解，用酶标仪在 RSS ;-波长
下测定。用各组的平均 !值计算细胞生长抑制率。
生长抑制率 X V! Y实验组 !值 I对照组 !值 W T !HHO
! ’ 琼脂糖凝胶电泳
将上述不同浓度的新疆紫草素处理 J? 4 的细
胞及未经处理的对照组细胞，按文献 Z R [介绍的方法
提取 ’()，在 !O的琼脂糖凝胶中 SH \电泳 !& # 4，
然后于紫外灯下观察拍照。
! ( 流式细胞仪（)*%）分析
经流式细胞术常规预处理细胞后，用 *):GA6;
（9/A1,; ’2A72;B,;，5,<;162; \2/D，:)，]G)）流式细
胞仪测定亚二倍体峰及各个细胞周期的细胞，以未加
药者为对照组，*:5测定采用单染色单激光法 Z # [。
实验结果采用 5,C021软件进行分析。
! + &,&法检测凋亡细胞
N’N 法将生物素标记的 CL]N^ 在末端转移酶
的作用下，标记到 ’()的 #_端缺口上，再用亲和素
标记的 ‘a^与之结合，然后加入底物 ’)9，从而使
凋亡细胞核呈现棕褐色。本方法是检测凋亡的早期
手段，且较敏感。用 ! !3 I -. 的紫草素作用于
::>??@细胞不同时间，然后按华美公司原位细胞凋
亡检测试剂盒的操作程序进行染色，显微镜下观察
拍照，其中胞核内有棕黄色颗粒或呈均质的棕黄色
染色者为凋亡细胞。按此标准随机计数 ?HH个细胞
中的凋亡细胞，计算凋亡细胞所占比例。
# 结 果
# ! %&&法测细胞生长抑制率
结果显示新疆紫草素对 ::>??@细胞有生长抑
制作用，这种作用随着药物浓度的升高和作用时间
的延长而增强。用 ! !3 I -.的药物作用 ?R 4，细胞生
长抑制率为 ?$& RO；当延长至 J? 4时，抑制率上升
至 J?& SO；而 !H !3 I -.的药物作用 J? 4，可使 S#O
以上的细胞生长受到抑制 V见图 ? W。
# # ,-.琼脂糖凝胶电泳分析
H& !、!U H、!HU H !3 I -. 新疆紫草素作用于
::>??@细胞 J? 4后，均出现凋亡特有的梯形条带，
提示 ’()在核小体连接部位被切断，这是细胞凋亡
的最重要的生化改变特征。对照组未观察到梯度带
的出现 V见图 W。
图 ? 新疆紫草素对 ::>??@细胞生长的抑制作用
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!#$蒋英丽%等 & 新疆紫草素诱导人大肠癌细胞的凋亡
图 ! 流式细胞仪检测分析
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’& ()*+,)- .,)/01 2& ((3445 67--8 +,79+7: ;<+= ><*?<9*. @=
在药物作用下，有明显的亚二倍体峰出现，通
过 JK’ 含量分析发现，! !. C D- 的药物处理 4E =
后，凋亡细胞比例为 4G& !GH，当延长至 EF =和 $4 =
后，凋亡细胞比例分别上升至 45& $IH和 I!& I!H；
而相应地 L! 期细胞比例分别由 #F& 4GH 下降至
4& !GH和 4#& EGH，而 L4 期细胞比例也有轻微降
低。前者升高的幅度与后者下降的幅度相一致 M见
图 E N。由此推测，新疆紫草素可能是选择性地诱导
L!期细胞凋亡。
! $ %&%法检测凋亡细胞
当用 ! !. C D-新疆紫草素处理 ((3445细胞 4E
= 时，可检测到形态尚未发生改变的早期凋亡细
胞；而当药物作用时间延长至 $4 = 时，可见凋亡
细胞变圆，体积明显缩小，核染色质浓缩，变成
新月形，此为晚期凋亡细胞 M见图 # N。随着时间的
推移，凋亡细胞比例逐渐增加，与 O(P分析得到
的结果一致 M见图 I N。
# 讨 论
肿瘤生长是受肿瘤细胞的增殖与死亡比例调
节的。许多年来肿瘤细胞的增殖一直是人们研究的
热点，而细胞死亡的机制仅近几年才受到人们的重
视。通过大量的实验，人们发现肿瘤细胞可以自发
性死亡 Q I R，也可由化疗药物诱导而程序化死亡。抗肿
瘤治疗的有效性依赖于肿瘤细胞对程序化死亡的
反应性，并且肿瘤细胞程序化死亡的比率与肿瘤的
恶变有关 Q $ R。因此药物诱导程序化死亡在临床肿瘤
图 # S:S法检测凋亡细胞形态
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治疗中日益受到重视。
实验发现新疆紫草素可诱导大肠癌 %%&’’(细
胞凋亡。)* !、!* )、!) !+ , -.浓度的紫草素作用后，
%%&’’(细胞均具有明显的凋亡特征，细胞核 /01
呈梯状降解，流式细胞仪检测可见明显的亚二倍体
峰，2304&染色可见不同时期的凋亡细胞，并且凋
亡细胞的比例与药物浓度和作用时间之间有一定的
相关性。
由此可见，诱导肿瘤细胞凋亡是新疆紫草素发
挥其抗肿瘤作用的机制之一。有研究表明新疆紫草
素可选择性地抑制 /01拓扑异构酶 5 6$ 7。/01拓扑
异构酶是一种基本核酶，它可催化 /01的超螺旋状
态与解螺旋状态之间的相互转换过程，而超螺旋解
旋是 /01复制与转录前的必要准备。/01拓扑异
构酶 5 的抑制剂可介导 /01单链断裂，它们的抗癌
作用并不在于抑制酶本身的活性，而在于促使酶 8
/01断裂复合物的形成，延长其半衰期，并使之稳
定，从而最终导致 /01链的断裂，阻断基因的转录，
引起细胞死亡。因此我们推测，新疆紫草素可能是通
过作用于 /01拓扑异构酶 5来介导细胞凋亡的。但
由于可引起细胞凋亡的因素很多，细胞凋亡的信号
传导途径极其复杂，因此其具体机制还有待进一步
探讨。
6 参 考 文 献 7
29:-;<:= >?@ ABCD=+E F@ AG9EHI= J?* 1;:;B:
JCEK@ !((’@ !：#(O 8 P)*
路桂荣，廖 静，李延钧@ 等 * 紫草萘醌单体分离物的抗癌生
物效应测试 6 ? 7 * 中西医结合杂志，!(()，!)（O）：Q’’ 8 Q’#*
胡艳萍，王骏业 * 紫草素增加小鼠肝癌和 &ERI<肺癌放射治
疗效应的初步研究 6 ? 7 * 肿瘤防治研究，!((!，!$（’）：O! 8
O*
张亚历，姜 泊，周殿元 * 程序化细胞死亡常用研究方法
6S 7 * 见：姜泊等主编 T 分子生物学常用实验方法 * 北京：人
民军医出版社，!((P：!O) 8 !$#*
/DCUV=NIERIGU W@ MCX=: A@ /E. MI=: Y@ EB D.* ZEDBXCE< :L
D;:;B:BIG GE..< -ED
任一萍@ 李 智 * 细胞凋亡与肿瘤 6 ? 7 * 生物学杂志，!(($，
$’（’）：!P 8 !O*
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6编辑：张 菊；校对：甘可建 7
蒋英丽@等 * 新疆紫草素诱导人大肠癌细胞的凋亡
图 P 2/2法检测凋亡细胞比例
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