全 文 ：中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2013, 44(2) · ·189
华山松 (Pinus armandi Franch.) 为松科松属植
物，为我国特有的优质用材针叶树种，其松塔中主
要含萜类、黄酮类和多糖类成分，有祛痰、止咳和
华山松松塔多糖中单糖组分的 HPLC法分析及测定
张海珠，周 萍*，刘光明，夏从龙，史志婷
(大理学院药学院，云南大理 671000)
摘要：建立了高效液相色谱法分析并测定华山松松塔多糖中的单糖。以三氟乙酸水解华山松松塔多糖，水解物加入 1-苯
基 -3-甲基 -5-吡唑酮(PMP)进行衍生化。使用 Agilent Venusil XBP-C18色谱柱，以乙腈 -0.05 mol/L乙酸铵缓冲液(pH 5.5)
(20︰ 80) 为流动相，检测波长 250 nm。华山松松塔多糖由 10种单糖 (其中 3种未鉴定 )组成。已鉴定出的 7种单糖均
在 0.005～ 0.2 mg/ml范围内线性关系良好，回收率为 89.2％～ 101.6％，RSD<3.0％。在华山松松塔提取物 C、D、E
和 F中的 D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和 D-阿拉伯糖的相对平均含量分别为
0.144％～ 1.24％、0.13％～ 2.14％、0～ 0.99％、0.17％～ 2.27％、0.76％～ 2.73％、0.14％～ 9.17％和 0.16％～ 8.16％。
关键词：华山松松塔多糖；单糖；衍生化；高效液相色谱；测定
中图分类号：O657.7+2 文献标志码：A 文章编号：1001-8255(2013)02-0189-03
收稿日期：2012-09-20
基金项目：国家自然科学基金(81260632)
作者简介：张海珠(1983-)，女，硕士研究生，专业方向：药品质
量控制。
E-mail：hzningjing@163.com
通信联系人：周 萍(1972-)，女，教授，从事药物代谢研究。
Tel：0872-2257417
E-mail：zhouping725@126.com
Analysis and Determination of Monosaccharide Composition in Polysaccharides from
Pinecone of Pinus armandi Franch. by HPLC
ZHANG Haizhu, ZHOU Ping*, LIU Guangming, XIA Conglong, SHI Zhiting
(College of Pharmacy, Dali University, Dali 671000)
ABSTRACT: An HPLC method was established for the analysis and determination of the monosaccharides in
polysaccharides from pinecone of Pinus armandi Franch.. The sample was hydrolyzed by trifl uoroacetic acid and the
hydrolysate was derivatized by reaction with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP). An Agilent Venusil XBP-C18
column was used with the mobile phase of acetonitrile-0.05 mol/L ammonium acetate buffer(pH 5.5) (20︰80) at
the detection wavelength of 250 nm. The polysaccharides were composed of ten monosaccharides (including three
unidentifi ed monosaccharides). The calibration curves for the seven identifi ed monosaccharides were linear in the range
of 0.005 - 0.2 mg/ml. Their recoveries were 89.2％ - 101.6％, with RSDs less than 3％. In extractions C, D, E and F
from pinecone of Pinus armandi Franch., the relative average contents of mannose, rhamnose, D-glucuronic acid, D-(+)
galacturonic acid, glucose, glactose and D-arabinose were 0.144％ - 1.24％, 0.13％ - 2.14％、0 - 0.99％, 0.17％ - 2.27％,
0.76％ - 2.73％, 0.14％ - 9.17％ and 0.16％ - 8.16％, respectively.
Key Words: polysaccharide from pinecone of Pinus armandi Franch.; monosaccharide; derivatization; HPLC;
determination
平喘之功效 [1,2]。研究表明植物多糖具有抗肿瘤、
抗炎、抗凝血、抗病毒、抗衰老、抗辐射、降血脂
和调节机体免疫等作用，已有香菇多糖、灵芝多糖
等应用于临床 [3,4]。课题组前期研究表明华山松松
塔提取物有良好的抗艾滋病病毒活性 [5]，已知其提
取物中含有大量的糖类物质，测定了其中的多糖含
量，但对于其多糖的单糖组成及含量均未见报道。
本研究参照文献 [6]，将多糖水解成单糖，采用 1-
苯基 -3-甲基 -5-吡唑酮 (PMP) 柱前衍生化 HPLC
DOI:10.16522/j.cnki.cjph.2013.02.016
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法分析单糖组分及含量，为下一步研究提供帮助。
1 仪器与试药
Waters 600E型高效液相色谱仪，包括 2998型 PAD检
测器、717型自动进样器和Waters 600E型色谱工作站 (美
国Waters公司 )。
D-甘露糖 (1，批号 140651-200602)、鼠李糖 (2，批号
111683-200402)、D-葡萄糖醛酸 (3，批号 14068-200602)、
D-半乳糖醛酸 (4，批号 111646-200301)、葡萄糖 (5，批号
111648-200406)、半乳糖 (6，批号 100226-200404) 和 D-阿
拉伯糖 (7，批号 1506-200203) 的对照品均购自中国食品药
品检定研究院，纯度 >99.9％；PMP( 化学纯，中国医药集
团化学试剂有限公司 )；乙腈为色谱纯，水为超纯水，乙酸
铵为优级纯，其他试剂均为分析纯。
松塔样品 2009年 8月 18日采集于云南省大理市感通
寺，经大理学院药学院生药教研室周浓副教授鉴定为华山松
(Pinus armandi) 松塔。华山松松塔提取物 C、D、E和 F为
本室自制样品 [7]。
2 方法与结果
2.1 溶液配制
混合对照品溶液：分别称取单糖 1～ 7对照品
4 mg置 2 ml量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，即
得单糖的对照品贮备液，进一步稀释成 0.2 mg/ml。
供试品溶液：精密称取华山松松塔提取物 C、
D、E和 F 20 mg，置安瓿管中，注入 2 mol/L三氟
乙酸 (TFA)2 ml，置沸水浴水解 8 h，冷却至室温，
以 2 mol/L氢氧化钠溶液调至 pH 7.0，即得。
空白溶液：取 2 mol/L TFA 2 ml，沸水浴 8 h，
取出冷却至室温，以 2 mol/L氢氧化钠溶液调至 pH
7.0，即得。
2.2 衍生化产物的制备
精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和空白
溶液各 200 l，分别加入 0.3 mol/L氢氧化钠溶液
和 0.5 mol/L PMP甲醇溶液各 100 l，混匀，70 ℃
水浴反应 40 min，取出反应物，冷却至室温后加入
0.3 mol/L盐酸 100 l。精密加入氯仿 400 l，涡旋
3 min，离心 (3 000×g)5 min，弃去下层，重复 3次，
取上层水相即得衍生化后的单糖混合对照品溶液、
供试品溶液和空白溶液。
2.3 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱 Agilent Venusil XBP-C18色谱柱 (4.6 mm×
250 mm，5 μm) ；流动相 乙腈 -0.05 mol/L乙酸铵
缓冲液 (pH 5.5)(20︰ 80) ；流速 1 ml/min；检测
波长 250 nm；柱温 30 ℃；进样量 10 l。单糖衍生
化产物的 HPLC色谱图见图 1。
2.4 线性试验
分别精密量取 0.2 mg/ml的对照品溶液和
2 mg/ml的对照品贮备液各 50、100和 200 l，各
置 2 ml量瓶中，加水定容，摇匀，得系列浓度对照
品混合溶液，按“2.2”项下方法进行衍生化处理，
分别进样测定。以浓度 c为横坐标，色谱峰面积 A
为纵坐标绘制标准曲线。7种单糖的回归方程见表1。
表 1 7种单糖的标准曲线
单糖 回归方程1)
1 A=3.32×106c-3.14×105
2 A=2.58×106c-3.29×104
3 A=2.49×106c-5.51×104
4 A=3.02×106c-2.17×105
5 A=2.91×106c-3.05×104
6 A=3.19×106c-7.27×104
7 A=6.94×106c-1.96×105
注：1)r≥ 0.999，线性范围均为 0.005～ 0.2 mg/ml
2.5 精密度和稳定性试验
精密称取华山松松塔提取物 F 20 mg，共 6份，
按上述条件进行水解及衍生化处理，进样测定，计
算得 1～ 7峰面积的RSD分别为 2.3％、2.7％、1.9％、
2.1％、1.3％、1.5％和 2.9％。
同上制备华山松松塔提取物 F供试品溶液，衍
生化后分别于 0、2、4、8和 12 h进样测定，计算
得样品中 1～ 7峰面积的 RSD分别为 1.1％、2.9％、
1.4％、2.5％、1.7％、1.2％和 0.9％。结果表明 7
种单糖在 12 h内较稳定。
2.6 回收率试验
精密称取华山松松塔提取物 F 10 mg，共 9份，
分别加入 0.1 mg/ml混合对照品溶液 80、100和
120 l，制备低、中、高浓度的供试品溶液，各 3
份，按上述条件进行水解及衍生化处理，进样测定，
记录色谱峰面积。结果表明，1～ 7的平均加样回
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A：混合对照品溶液，B：空白溶液，C～ F：华山松松塔提取物 C、D、E、F的供试品溶液
1～ 7-1～ 7；8-PMP；9～ 11- 未知组分
图 1 单糖衍生化产物的 HPLC图谱
收率分别为 96.3％、101.2％、101.6％、98.4％、
96.7％、89.2％和 94.9％，RSD分别为 1.7％、2.0％、
1.5％、1.8％、2.3％、2.6％和 2.6％。
2.7 样品测定
分别精密称取华山松松塔提取物 C、D、E和 F
20 mg，各 3份，分别进行水解及衍生化处理，进
样测定。确定华山松松塔多糖中含有 1～ 7( 松塔
提取物 C组分中不含 3) ；9～ 11号峰 (暂称为化
合物 9、10、11) 为 3种未知糖。根据所测得的峰
面积计算华山松松塔提取物 C、D、E、F中所含几
种单糖的相对平均含量，结果见表 2。
3 讨论
3.1 试验前对华山松松塔提取物 C、D、E、F进行
了菲林试验，结果显示提取物溶液中不含还原糖。
3.2 本试验比较了多糖 TFA水解方法与硫酸水解方
法。结果表明 TFA水解操作简单，在样品制备过
程中单糖组分损失较小，方法精密度较高。另考察
了水解时间的影响，沸水浴下分别水解 2、4、6、8
和 10 h，再进行衍生化处理，结果所得的单糖峰面
积在 8 h最大，此时水解较完全，故选择 8 h为水
解时间。
3.3 预试验中制备几种单糖的混合对照品溶液时，
除了文中提到的 7种糖以外，还加入了 D-木糖和
果糖。但由于 D-木糖出峰时间与 D-阿拉伯糖相近
且其峰面积相对较小，而果糖在上述色谱条件下不
出峰，为避免对测定结果造成干扰，故在试验中制
备单糖混合对照品溶液时没有加入 D-木糖和果糖。
(下转第213页)
表 2 华山松松塔提取物 C、D、E、F中的单糖组成
及相对平均含量 /％
单糖 提取物C 提取物D 提取物E 提取物F
1 0.144 0.65 1.24 0.99
2 0.13 1.28 2.14 0.69
3 - 0.79 0.99 0.40
4 0.17 1.06 2.27 1.05
5 0.76 2.17 2.73 1.27
6 0.14 6.54 9.17 1.74
7 0.16 4.05 8.16 2.93
9 0.16 - - 0.23
10 - 1.07 1.35 0.42
11 2.81 1.29 1.11 0.39
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化合物或技术发明，这是专利网的核心，然而我国
大多数制药企业的规模小，难以做到新型化合物的
开发，因此，专利外围网的开发便成为了我国多数
制药企业专利网战略的主要内容。多数企业通过研
发 me-too药物或者 me-better药物以规避已有专利，
并以此专利作为核心构建专利网，一般而言，申请
路线如下 [9] ：
基本化合物专利→化合物制备方法专利→衍
生物专利→化合物中间体专利→药物组合专利、
药物制剂专利或药物用途专利。
4.3 提高企业专利管理水平
企业专利管理是指企业专利管理机构和专利人
员为执行国家的专利制度，促进企业科技进步和提
高经济效益，而进行的专利服务、规划、监督、保护、
协调和鼓励等组织活动的总称 [10]。目前，我国多
数制药企业缺乏科学规范的专利管理工作，不利于
企业保护自主知识产品以及避开专利纠纷，因此，
我国制药企业应当树立专利管理意识，建立专门的
专利管理机构。专利管理机构的职责在于搜集专利
信息、分类处理信息、发掘创新的专利产品、研发
前立项评估、处理专利纠纷等。通过专利管理机构，
企业能够快速获取最新的专利信息，通过专利人员
的专业分析，企业能够快速定位其研发战略，降低
侵犯已有专利的风险。
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(上接第191页)
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