全 文 ：[作者简介] 孙雪飞(1974-),男 ,博士,主治医师 ,研究方向:肺癌的基础研究。[通讯作者] 陈景寒。
文章编号:1671-7554(2006)12-1268-05
藤梨根提取液抗肺癌作用的实验研究
孙雪飞1 ,陈景寒2 ,王德江1 ,李希波1
(1.山东大学齐鲁医院胸外科 , 山东 济南 250012;2.山东省立医院胸外科 ,山东 济南 250021)
　　[摘要] 　目的:观察藤梨根提取液对肺腺癌 A549细胞的生长抑制作用 ,为其治疗肺癌提供实验依据。
方法:采用MTT检测法 、集落形成试验观察药物对细胞的作用 ,用流式细胞术检测细胞凋亡 ,同时分析药物
对细胞周期的影响。采用裸鼠移植瘤模型进行体内实验 ,并绘制移植瘤生长曲线 ,计算抑制率 。结果:各浓
度的藤梨根提取液对肺腺癌A549细胞有较强的抑制效应 ,呈现出明显的时相性和量-效依赖性 ,流式细胞
仪检测结果显示 ,藤梨根提取液作用后 ,G0 G1 期细胞数增加 ,细胞出现凋亡 ,并随药物浓度增大 ,作用增强。
移植瘤体内试验显示 ,藤梨根提取液高剂量组(按 1 000mg kg)和低剂量组(按 500 mg kg)的抑瘤率分别为
71.40%和 40.35%,治疗组移植瘤生长缓慢 ,体积明显小于对照组(P <0.01)。结论:藤梨根提取液在体内
外对人肺腺癌A549细胞生长均有抑制作用 ,体外作用与G0 G1 期阻滞有关 ,并有诱导人肺腺癌 A549细胞凋
亡的作用 。
[关键词] 　肺肿瘤;细胞凋亡;藤梨根提取液;小鼠 ,近交 BALB C
[中图分类号] 　R734.2　　[文献标识码] 　A
Radix Actinidiae extract inhibits the proliferation of human lung
adenocarcinoma cell line A549:an experimental study
SUN Xue-fei1 , CHEN Jing-han2 , WANG De-jiang1 , LI Xi-bo1
(1.Department of Thoracic Surgery , Qilu Hospital of Shandong University , Jinan 250012 , Shandong , China;
2.Department of Thoracic Surgery , Shandong Provincial Hospital , Jinan 250021 , Shandong , China)
[ ABSTRACT] 　Objective:To study the effect of Radix Actinidiae extractive on the proliferation of human lung ad-
enocarcinoma cell line A549.Methods:MTT assay and colony formation test were used to detect the effect of drug on cells
in vitro.Flow cytometry was used to measure the cell apoptosis and cell cycle.In vivo , the tumor growth curve was drawn
and the inhibition ratio was calculated in the athymic mouse bearing A549 cancer cells treated with Radix Actinidiae extrac-
tive.Results:Radix Actinidiae extractive can inhibit the A549 cell proliferation in time-dependent and dose- dependent
manner.Flow cytometry displayed that cells in G0+G1 phases increased and the apoptosis was induced after the Radix Ac-
tinidiae extractive treatment.The tumor inhibiting rates of high-dose and low-dose group were 71.40% and 40.35%, re-
spectively.The transplanted tumor of treatment group grew slowly and was smaller than that of control group.Conclusion:
Radix Actinidiae extractive has anticancer activity on human lung adenocarcinoma cell line A549 and can induce the apop-
tosis of A549 cells both in vivo and in vitro , and its inhibition in vitro may be related to the blockade of G0+G1 phases.
[ KEY WORDS] 　Lung cancer;Apoptosis;Radix Actinidiae extractive;Mice , Inbred BALB C
　　藤梨根为猕猴桃科猕猴桃属软枣猕猴桃的根 , 味甘 、咸寒 、微涩 ,具有清热解毒 、消肿疥 、祛风湿的
第 44卷第 12期
2006年 12月 　　　　
山　东　大　学　学　报　(医　学　版)
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY(HEALTH SCIENCES)　　　　Vol.44 No.12Dec.2006
功效。临床上常用于抗肿瘤治疗 ,尤其对消化道肿
瘤疗效较佳。近年研究表明[ 1-3] ,猕猴桃属其它种类
猕猴桃根提取物在体外对肿瘤细胞也有抑制作用 ,
其药理研究和临床验证受到广泛关注。也有研究显
示[ 4] ,藤梨根乙酸乙酯提取物对体外培养的胃癌细
胞有较好的抑制作用 。有关藤梨根对肺癌的作用尚
未见报道。本研究以人肺腺癌 A549细胞株作为研
究对象 ,从体内外两条途径观察藤梨根乙酸乙酯提
取液对肺癌细胞的生长抑制作用 ,以期为进一步临
床应用提供依据 。
1　材料与方法
1.1　藤梨根乙酸乙酯提取液的制备　将藤梨根(购
自济南建联药店)500 g 粉碎成 20 目的粗粉※加 8
倍水煮 2次 ,每次 1 h;过滤浓缩※加入乙酸乙酯溶
媒萃取3次(每次 300 ml)※回收溶媒 ,得浓缩物约
25 g(含三萜类物质)※蒸馏水热溶※过滤※滤液供
试验用(无菌)。
1.2　细胞株与细胞培养　人肺腺癌A549细胞株由
山东省医学科学院基础所惠赠 ,培养在含 10%小牛
血清 、青霉素及链霉素各 100 U ml 的 RPMI-1640培
养液中 ,37 ℃、5%CO2 饱和湿度条件下培养 ,0.25%
胰蛋白酶消化传代。
1.3　实验动物　BALB C(nu nu)裸鼠购自北京维通
利华实验动物有限公司 ,SPF 级 ,鼠龄 3 ～ 4周 ,体重
16 ～ 18 g ,雄性 ,饲养于超净生物层流架内 ,环境定期
紫外线消毒 , 保持恒温(25±2)℃、恒湿(45%～
50%),笼具 、饮水均经高压蒸汽灭菌 ,实验操作均在
无菌罩内进行。
1.4 　主要试剂和仪器 　RPMI-1640 培养液(美国
Gibco公司),小牛血清(美国 Hyclone 公司),四唑盐
(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均购自美国 Sigma 公司 。
全自动CO2 孵箱(美国杜邦公司 Napoc6100),倒置显
微镜(日产 Olympus ,ZMT-413), 450型酶标仪(美国
BioRad生产)。
1.5　方法
1.5.1　细胞增殖抑制实验　采用MTT 检测法 。取
对数生长期 A549细胞接种于 96孔培养板中 ,每孔
含细胞 1×103 个 ,培养 24 h 后加入适当浓度药物 ,
浓度分别为 25 、50 、100 、200 、400μg ml ,每组样本设 5
个复孔 ,对照组加入等体积 DMSO ,37 ℃、5%CO2 饱
和湿度下培养 24 、48 、72 h ,弃上清 ,每孔中加入 MTT
溶液(5 g L)20μl , 37 ℃继续孵育 4 h ,终止培养 ,小
心吸弃孔内上清液 ,每孔加入 150 μl DMSO 振荡
10min后比色 ,选择 490 nm波长 ,在酶联免疫检测仪
上测定各孔光吸收值(OD),记录结果 ,计算生长抑
制率 。以上试验重复 3次 。
抑制率=(1-实验孔 OD 对照孔OD)×100%
1.5.2　集落形成试验　将对数生长期人肺癌A549
细胞接种于 24孔培养板内 ,每孔 400个细胞 ,每组4
个平行孔 ,培养 24 h后 ,吸弃上清 ,加入含不同浓度
药物 (25 、50 、100 、200 、400μg ml)的培养液 , 并设实
验对照孔(0.04%DMSO+细胞),在培养 24 、48 h 后 ,
更换培养液后继续培养 7 d ,甲醛固定 ,Giemsa染色 ,
镜下计数每孔大于 50 个细胞以上的集落数目。计
算集落形成率 、集落形成抑制率。
集落形成率(%)=(每孔集落数 每孔接中细胞
数)×100%
集落形成抑制率(%)=(1-试验组集落数 对
照组集落数)×100%
1.5.3　流式细胞术检测细胞周期及凋亡率　取对
数生长期的A549细胞 ,细胞浓度为5×105 个 ml ,接
种于 24孔细胞培养板中 ,每孔 2ml。用药组分别加
入不同浓度的药物(25 、50 、100 、200 、400μg ml),对照
组加 PBS ,CO2 孵箱内继续培养 48 h ,分别收集各组
细胞(每组细胞数>1×106 个),加 70%乙醇 500μl
固定 , 4 ℃过夜 , PBS 洗涤 ,离心后细胞沉淀中加入
PI染色液(10mg L)0.5ml ,室温避光染色 1 h后上机
检测细胞周期和凋亡率 。
1.5.4　藤梨根提取液对肺癌裸鼠移植瘤抑制作用
的实验　将A549细胞按常规方法复苏扩增 ,消化后
无血清培养液离心洗涤 2次 ,计数并调整细胞数 ,台
盼蓝染色活细胞计数>99%。用带 6号针头注射器
抽取癌细胞悬液接种于裸鼠前腋部皮下 ,每个部位
接种 0.2ml(含活细胞数 1×106 个),成瘤后随机分
为治疗组和对照组 ,每组 6只 。治疗组分高剂量(按
1 000mg kg)和低剂量组(按 500 mg kg),每日 1次灌
服藤梨根提取液 ,对照组灌服等量蒸馏水 ,共治疗
26 d。实验中注意观察裸鼠精神 、进食 、排便及体重
情况 。隔天称裸鼠体重 ,用游标卡尺测量移植瘤长
径 a和短径 b ,按公式 V=0.5×a×b2 计算瘤体积 ,
绘制生长抑制曲线 。最后1次用药后 24h以颈椎脱
位方式处死裸鼠 ,剥出的移植瘤去除血污 、脂肪等非
瘤组织 , 测量瘤重 , 计算各组平均瘤重及抑瘤率
(IR)。 IR=〔(肿瘤对照组平均瘤重 —给药组平均瘤
重) 对照组平均瘤重〕×100%。并对裸鼠进行解
剖 ,肉眼观察重要脏器及淋巴结情况 ,取肿瘤 、重要
器官及淋巴结以 10%福尔马林固定 、石蜡包埋切
片 ,HE染色光镜下观察 。
孙雪飞 ,等.藤梨根提取液抗肺癌作用的实验研究 1269　 　
1.6　统计学处理　数据处理采用 SPSS10.0 for win-
dows软件包进行统计学分析。组间差异采用 t 检
验 ,以 P<0.05为差异有统计学意义 。
2　结　果
2.1　藤梨根提取液对人肺腺癌A549细胞增殖的影
响　MTT 结果显示 ,藤梨根提取液对人肺腺癌A549
细胞的生长有明显的抑制作用 ,且呈剂量依赖性 ,在
25μg ml时即表现一定的抑制作用 ,随着药物浓度
的增加 ,实验孔内吸光值逐渐降低 ,抑制率增高 ,在
400μg ml时抑制效果最佳;并且同一药物浓度 ,随
着作用时间的延长 ,抑制率逐渐增加 , 呈现出明显
的时间-剂量依赖性 ,见表 1。
表 1　藤梨根乙酸乙酯提取液对人肺腺癌 A549细胞的生长抑制率(%)
组别 剂量(m μg·ml-1)
24 h
吸光值( x±s) 抑制率
48 h
吸光值( x±s) 抑制率
72 h
吸光值( x±s) 抑制率
对照组 0 0.790±0.009 - 0.870±0.008 - 0.950±0.004 -
实验组 25 0.701±0.052 11.20 0.660±0.021 23.79 0.632±0.035 33.47
50 0.613±0.043＊ 22.35 0.561±0.080 ＊ 35.42 0.520±0.079＊ 45.18
100 0.472±0.065＊ 40.17 0.436±0.048 ＊ 49.83 0.377±0.082＊ 60.23
200 0.385±0.013＊ 51.25 0.316±0.027 ＊ 63.59 0.252±0.023＊ 73.45
400 0.291±0.035＊ 63.12 0.218±0.019 ＊ 74.93 0.120±0.046＊ 87.32
　　＊P<0.05 vs 对照组
2.2　藤梨根提取液对人肺腺癌A549细胞集落形成
的影响　集落形成实验结果显示 ,不同浓度的药物
对人肺腺癌A549细胞集落形成均有抑制作用 ,随着
药物浓度的增高 ,抑制作用逐渐明显 ,集落形成率降
低 ,集落抑制率增高 ,随着药物作用时间延长 ,对集
落形成的抑制作用亦更加明显 , 药物浓度在
400μg ml时 ,集落形成抑制率最高 ,24 h为 76.09%,
48 h为 84.76%,见表 2。
表 2　藤梨根乙酸乙酯提取液对人肺腺癌 A549 细胞集落形成的影响
组别 剂量(m μg·ml-1)
集落形成数( x±s)
24 h 48 h
集落形成率(%)
24 h 48 h
集落抑制率(%)
24 h 48 h
对照组 0 220.5±12.0 248.0±15.0 55.38 62.75 - -
实验组 25 177.8±16.3＊ 159.3±19.5＊ 44.26 39.82 19.37 35.77
50 145.3±13.2＊ 114.6±14.2＊ 36.33 28.65 34.10 53.79
100 111.8±14.4＊ 89.7±16.4＊ 27.98 22.43 49.29 63.83
200 83.6±8.5＊ 63.4±8.0＊ 20.96 15.96 61.99 74.43
400 52.7±4.3＊ 37.8±8.5＊ 13.20 9.37 76.09 84.76
　　＊P<0.05 vs 对照组
2.3　藤梨根提取液对人肺腺癌A549细胞细胞周期
和凋亡的影响　细胞在给药 48 h 后 ,经流式细胞分
析仪细胞周期检测表明 ,药物作用后细胞周期发生
明显变化 ,G0 G1 期细胞数目增多 ,S期和G 2 M 期细
胞数目相应减少 ,呈一定的剂量依赖关系 。FCM 凋
亡分析显示 ,当药物干预后细胞凋亡增加 ,细胞凋亡
率随药物浓度的增加而增加 ,提示藤梨根提取液有
诱导人肺腺癌 A549细胞凋亡的作用 ,见表 3。
表 3　藤梨根提取液对人肺腺癌 A549细胞细胞周期和凋亡的影响( x±s)
组别 剂量(m μg·ml-1)
细胞周期比率
G0 G1 S G2 M 凋亡率(%)
对照组 0 43.4±1.21 49.6±0.45 7.3±1.32 1.08±0.42
实验组 25 55.2±0.86 38.3±1.58 6.4±1.76 8.65±1.15 ＊
50 69.5±1.43 ＊ 25.1±0.69 ＊ 5.5±1.54 ＊ 15.60±1.34 ＊
100 78.6±1.52 ＊ 16.6±1.18 ＊ 4.7±1.33 ＊ 24.76±1.59 ＊
200 82.3±1.67 ＊ 13.7±0.98 ＊ 3.9±1.45 ＊ 30.74±1.43 ＊
400 86.5±1.08 ＊ 11.2±1.47 ＊ 2.3±0.92 ＊ 35.85±1.67 ＊
　　＊P<0.05 vs 对照组
　1270　 山　东　大　学　学　报　(医　学　版) 44卷 12期
2.4　藤梨根提取液对人肺腺癌裸鼠移植瘤的影
响　各组裸鼠移植瘤的生长曲线见图 1。由图 1可
见 ,用药组移植瘤生长缓慢 ,高剂量组更为明显 ,用
药26 d后 ,用药组移植瘤体积及瘤重明显小于对照
组 ,高剂量组亦明显小于低剂量组 ,各组间比较差异
有统计学意义(P 均<0.05),见表 4。高剂量组的
抑制率明显高于低剂量组 , 分别为 71.40%和
40.35%。裸鼠体重方面 ,实验组与对照组比较 ,差
异无统计学意义 ,无明显毒性反应 ,解剖后裸鼠重要
脏器及淋巴结连续切片 HE 染色 ,镜下未发现肿瘤
体内转移 。 图 1　各组移植瘤的生长曲线Fig.1　Growth curves of transplanted tumor in each group
表 4　不同处理组裸鼠体重及 A549 细胞移植瘤瘤重和抑制率()
组别 体重(m g)治疗前 治疗后 瘤体积(V mm
3) 瘤重(m mg) 抑制率(%)
对照组 17.0±0.9 24.3±1.7 837.7±31.3 927.3±56.4 -
实验组
　　低剂量 17.1±0.8 23.9±1.5 482.6±23.5＊ 553.1±50.7＊ 40.35
　　高剂量 17.4±0.6 23.1±1.9 237.4±37.2＊ 265.2±35.9 ＊△ 71.40△
　　＊P<0.01 vs 对照组 , △P<0.05 vs 低剂量组
3　讨　论
近年 ,在天然药物中筛选抗肿瘤药物是新药研
究的主要发展方向 ,也为当前研究的热点之一 ,利用
现代科学技术筛选中草药的有效成分和揭示中草药
的作用机制是实现中药现代化 、科学化 、国际化的必
然要求。
藤梨根在临床上用于治疗消化道肿瘤由来已
久。近年实验研究表明 ,藤梨根复方制剂在体内外
均有抑制肿瘤转移[ 5] 、逆转多药耐药[ 6] 、对化疗药物
减毒增效[ 7] 的作用。本研究以肺腺癌 A549 细胞为
研究对象 ,采用MTT 法 、集落形成实验观察藤梨根
单体对肺癌的作用 ,采用流式细胞仪检测细胞周期
及凋亡变化 ,对其作用机制进行初步探讨 ,并采用裸
鼠移植瘤观察药物体内作用效果。结果显示 ,藤梨
根乙酸乙酯提取液在体外对人肺腺癌 A549细胞有
明显的抑制作用 ,并呈现出时间-剂量依赖性 ,随着
药物浓度的加大 ,抑制作用逐渐增强 ,同样药物作用
时间长 ,抑制效果越明显。在药物浓度为 25 μg ml
时即呈现出轻微的抑制作用。药物浓度为400μg ml
时抑制作用最为明显 ,其 24 、48 、72小时抑制率分别
为63.12%、74.93%、87.32%;在此浓度下其集落形
成率也最低 ,体外作用 24 、48小时集落抑制率分别
为76.09%、84.76%。集落形成反映肿瘤细胞中具
有增殖活性的干细胞的增殖能力 ,而干细胞是肿瘤
治疗中的主要靶细胞 ,如对干细胞具有抑制作用 ,说
明其对抑制肿瘤细胞生长有重要作用[ 8] 。以上实验
结果显示 ,藤梨根乙酸乙酯提取液具有抗肺癌的作
用。
G1 期是 DNA合成前期 ,主要是完成与 DNA 复
制 、合成有关的蛋白质的合成 ,S 期是 DNA 合成期 ,
此期细胞 DNA含量较间期增加 1倍 ,S期细胞数在
一定程度上可以反应细胞增殖旺盛与否 ,本研究结
果显示 ,藤梨根乙酸乙酯提取液对细胞周期产生影
响 ,可使 G0 G1 期细胞数目增多 , S 期和 G2 M 期细
胞减少 ,出现 G0 G1 期阻滞 ,提示 ,藤梨根乙酸乙酯
提取液可抑制肿瘤细胞的有丝分裂。流式细胞仪凋
亡检测表明 ,用药组细胞凋亡指数高于对照组 ,且随
着药物浓度的升高 ,凋亡指数亦逐渐增加 ,提示藤梨
根乙酸乙酯提取液具有诱导人肺腺癌 A549细胞凋
亡的作用 ,细胞凋亡是个体发育过程中基因调控下
的细胞自杀活动 ,是多细胞有机体为调控机体发育 ,
维护内环境稳定 ,由基因编码程序的细胞主动死亡 ,
细胞过渡增殖 ,凋亡受阻是恶性肿瘤的主要生物学
特征之一 。而诱导肺癌细胞凋亡可能是藤梨根乙酸
乙酯提取液抗肺癌作用机制之一 。
体内实验采用藤梨根乙酸乙酯提取液灌胃给
药 ,观察其对肺癌裸鼠移植瘤的抑制作用。结果显
示 ,与对照组相比 ,用药组裸鼠移植瘤生长缓慢 。治
疗结束时 ,低 、高剂量组由瘤重对比分析所得抑瘤率
分别为 40.35%和 71.4%。表明藤梨根乙酸乙酯提
孙雪飞 ,等.藤梨根提取液抗肺癌作用的实验研究 1271　 　
取液可以抑制人肺腺癌裸鼠移植瘤在体内的生长 ,
明显减缓裸鼠移植瘤的生长速度 ,具有明显的抗肺
癌作用 ,与体外试验一致 。同时未见药物有毒副反
应 ,实验组与对照组裸鼠体重比较差异无统计学意
义 ,裸鼠脏器及淋巴结解剖后连续切片观察未发现
肺癌体内转移。
本研究结果表明 ,藤梨根乙酸乙酯提取液在体
内外对肺癌均有抑制作用 ,且呈现出时间与剂量依
赖性 ,可使肺癌细胞出现G0 G1 期阻滞 ,影响细胞周
期变化 ,提示其可抑制肿瘤细胞的有丝分裂 ,并可诱
导细胞凋亡 ,但其具体抗癌机制有待进一步研究。
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(编辑:孙玉芝)
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　1272　 山　东　大　学　学　报　(医　学　版) 44卷 12期