全 文 ：中药复方“冬夏丸”体外对 6株人
肿瘤细胞系作用的研究
黄培春　邓惠华　赵明伦　黄添友　于留荣
　　摘　要:目的　研究中药复方“冬夏丸”体外对 6株人肿瘤细胞系的作用。方法　分别用微量
板染色法和流式细胞术测定肿瘤细胞的生长和细胞周期分布。结果　中药复方“冬夏丸”对 6株人
肿瘤细胞均有显著的生长抑制效应 ,抑制率均随药物浓度的增加而增高;多数细胞系的半数抑制浓
度(IC50)相近;药物使鼻咽癌细胞 G2期增加并可诱导细胞凋亡 。结论　中药复方“冬夏丸”体外对
包括NPC 在内的多种肿瘤细胞均有显著的生长抑制作用。
关键词:冬夏丸;海洋生物;肿瘤细胞;细胞周期;凋亡
　　中草药和海洋生物应用于肿瘤的防治有广阔前
景[ 1] ,但目前应用复方中草药和海洋生物防治肿瘤
尤其是鼻咽癌(NPC)的报道极少。我们原先的研究
从广东和南海的数十种常见中草药和海洋生物中筛
选出数种具有抑制鼻咽癌细胞生长和 EB 病毒
(EBV)抗原表达的中草药和海洋生物[ 2 , 3] 。在这基
础上 ,将这些中草药和海洋生物配与能增强机体免
疫功能等作用的中草药制成复方制剂“冬夏丸” ,拟
用于NPC 及其它肿瘤的防治。本文观察了中药复
方“冬夏丸”体外对人低分化鼻咽癌上皮细胞系等 6
株人肿瘤细胞系的作用 ,为该药进一步应用于鼻咽
癌及其他肿瘤的临床防治研究提供实验依据 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
1.1.1　受试药物　中药复方“冬夏丸”制剂由冬夏
草 、山豆根 、板兰根 、荚角 、黄芪等十多种中草药和海
洋生物组成 ,经酒精和水提取法提取出水溶性有效
成分 ,每 6g 生药提取出有效成分1g 。实验前用生理
盐水将有效成分配制成 10mg ml溶液 ,过滤除菌 ,存
于4°C备用 。
1.1.2　人肿瘤细胞系　实验所用人肿瘤细胞系 6
析 ,分别为低分化鼻咽癌细胞系(CNE-2Z)、高分化
鼻咽癌细胞系(CNE-1)、低分化肺腺癌细胞系(GLC-
82)、宫颈鳞癌细胞系(宫-743)、胃低分化腺癌细胞
系(BGC-823)、胃低分化粘液腺癌细胞系(MGC-
803)。以上细胞株均由本室保存。实验前分别取各
细胞株复苏 ,用含 15%灭活小牛血清和青霉素 、链
霉素的 RPMI1640(美国 GIBCO公司产品)培养液培
基金项目:全军医药卫生科研基金资助项目的一部分
作者单位:524023湛江 ,广东医学院肿瘤研究所(黄培春 、邓惠
华 、赵明伦);第一军医大学中西医结合研究室(黄添友 、于留荣)
养 ,待细胞生长良好(呈对数生长)时开始实验。
1.2　实验方法
1.2.1 　药物对肿瘤细胞生长影响的测定　采用
Rubinstein
[ 4] 的微量板染色法 , 略加改良 。分别
取对数生长的 6 种人癌细胞 , 用培养液稀释至
5×104 ml ,加入 96 孔培养板(美国产),每孔 0.2ml
(含 1×104 细胞 孔), 37°C 、5%CO2 孵育 2h 使细胞
贴壁 , 然后分别按 230μg ml 、260μg ml 、300μg ml、
350μg ml 、400μg ml终浓度加入药物 ,每浓度组设 3
个重复孔 ,每种细胞均设空白对照孔和阳性对照孔
(5-Fu20μg ml)。加药后细胞于37°C 、5%CO2 培养 ,
定时观察细胞的形态变化 ,48h后弃去培养液 ,用吸
湿纸吸干残液后 ,每孔加入 0.1ml 0.5%的结晶紫溶
液染色 5分钟 ,弃去染液并用温 PBS洗三次 ,吸干残
液后 , 每孔加入 0.1ml 醋酸酒精(1% glacial acetic
acid in 50% alcohol),置振荡器振荡 5 分钟后 ,即用
酶标仪测定各孔 570nm 波长的 OD值 ,然后按(1-实
验组平均OD值 对照组平均OD值)×100%公式计算
细胞生长抑制率。并按点斜法(即改进的 Kärber法)计
算出半数抑制浓度(IC50),具体计算方法按文献[ 5] 。
1.2.2　药物对鼻咽癌细胞周期和凋亡影响的测定
　参照文献[ 6] 方法 ,取 CNE-1和 CNE-2Z 细胞 ,分别
按不同终浓度加入药物 ,培养 48h后收集细胞 ,PBS
洗 2次 ,加入 PI 染液(含 PI100mg L , Rnase100mg L ,
0.1%Triton-X 100 , 0.1%醋酸钠), 4°C避光作用 30
分钟 ,用流式细胞仪(FCM ,美国 Conlter公司生产的
EPICS XL 型)检测细胞周期和细胞凋亡(apoptosis)。
2　结果
2.1　中药复方“冬夏丸”对肿瘤细胞生长的抑制作
用
用于实验的各株瘤细胞在加药后的培养过程
中 ,镜下可见部分瘤细胞出现圆缩 、变小 、折光性降
·330· 肿瘤防治研究 1999 年第 26卷第 5 期
低及脱壁死亡 ,这种变化与药物浓度成正比。药物
作用 48h后 ,对肿瘤细胞生长抑制率测定结果显示 ,
6株肿瘤细胞系均有不同程度的生长抑制作用 ,抑
制率均随药物浓度的增加而增高 ,呈明显的量效关
系。抑制效应最好的是 CNE-2Z 、CNE-1 和 BGC-823
细胞系 ,药物浓度为 350μg ml 和 400μg ml时 , 抑制
率均分别高达 80%和 90%以上 , 明显高于 5-Fu
(20μg ml)的抑制率。对 GLC-82 、MGC-803和宫-743
瘤细胞系的抑制效应亦较好 ,药物浓度为 350μg ml
时 ,抑制率均接近或达 70%以上 ,接近或超过 5-Fu
的抑制率。 IC50以 BGC-823 细胞系最小 ,其余 5株
细胞的 IC50相接近(表1)。
　　表 1 中药复方“冬复丸”对 6株人肿瘤细胞的生长抑制率和 IC50( x ±s , %, n=6)
肿瘤细胞系 冬　　　夏　　　丸　　　(μg ml)
230 260 300 350 400
5-Fu
(20μg ml) IC50
CNE-2Z 　3.1±3.8 16.5±4.8 48.0±28.1 80.3±12.5 92.1±1.6 75.3±7.6 310
CNE-1 4.6±9.8 13.4±10.1 35.0±11.6 87.7±8.1 90.9±3.3 68.9±6.1 314
GLC-82 12.6±4.1 19.2±7.3 49.0±7.9 76.1±7.0 78.7±4.1 71.8±6.6 312
BGC-823 51.2±10.5 51.6±16.2 78.6±18.6 93.7±3.5 93.6±3.9 52.7±6.5 261
MGC-803 19.2±16.9 47.6±23.2 63.8±10.2 76.9±9.7 74.6±9.0 49.9±9.7 293
宫-743 18.0±8.2 20.4±10.8 20.7±4.5 68.7±13.2 84.2±9.9 69.3±8.2 322
2.2　中药复方“冬夏丸”对鼻咽癌细胞周期和凋亡
的影响
中药复方“冬复丸”作用 48h 后 ,经 FCM 细胞周
期百分比分析显示 ,CNE-1细胞的G1期和 S期出现
减少趋势 ,但无统计学意义 ,G2期则随药物浓度增
高而增加 ,与空白对照组比较有显著或非常显著差
异 ,在药物浓度 400μg ml时出现亚二倍体峰即凋亡
峰 。CNE-2Z 细胞的细胞周期变化与 CNE-1细胞相
似 ,在药物浓度 400μg ml 时出现明显的凋亡峰(达
74%)。中药复方“冬夏丸”对 NPC细胞周期的影响
与阳性对照的 5-Fu不同 ,后者使 G1期增多 ,S期或
G2期减少(表 2)。
　　表 2 中药复方“冬复丸”对鼻咽癌细胞周期和凋亡的影响( x ±s , %, n=4)
细胞周期 对照 冬　　　夏　　　丸　　　(μg ml)
230 260 300 350 400
5-Fu
(20μg ml)
CNE-1
G1 79.8±5.6 80.0±6.2 76.9±5.9 74.4±7.1 70.2±6.8 69.8±6.3＊ 91.6±6.5＊
S 17.2±2.5 14.2±2.7 14.4±3.1 14.6±6.5 15.6±2.8 14.2±3.4 5.2±2.3＊＊＊
G2 3.0±1.6 6.5±2.0＊ 8.6±1.3 ＊＊ 11.1±2.2 ＊＊ 14.3±2.5＊＊＊ 16.0±2.1＊＊＊ 3.2±1.8
AP0 0 0 0 0 0 7.1±2.8 11.0±3.6
CNE-2Z
G1 64.2±4.8 67.4±6.3 70.2±8.1 70.1±7.9 69.8±7.7 62.2±6.5 74.1±5.2＊
S 27.0±4.2 25.1±5.1 20.1±6.2 20.6±7.0 19.0±7.7 25.1±3.1 25.5±3.9
G2 8.4±2.1 7.4±3.2 9.7±2.5 9.3±2.6 11.2±3.3 12.7±2.4＊ 0.4±1.2＊＊＊
AP0 0 0 0 0 0 74.1±11.2 49.5±5.9
　　t 检验 ,与对照组比较 , ＊P<0.05 , ＊＊ P<0.01 , ＊＊＊P <0.01
3　讨论
肿瘤细胞的重要特征之一是无限性生长 ,因此 ,
研究抗肿瘤药物首先是观察其抗肿瘤细胞生长的作
用。本实验结果表明中药复方“冬夏丸”在安全剂量
(动物毒性试验无毒性反应)浓度范围内 ,体外对包
括NPC在内的多种人肿瘤细胞有较高的抑制率 ,表
明该药具有较广谱的抑制肿瘤生长作用 。半数抑制
浓度(IC50)可反映药物对不同肿瘤细胞的敏感性 ,
中药复方“冬夏丸”对肿瘤细胞的 IC50 除 BGC-823
较低外 ,其余 5株肿瘤细胞相近 ,说明其对多种肿瘤
细胞生长抑制作用的敏感性相近。
细胞周期和凋亡的变化是反映细胞生长的某些
机制的重要指标 ,本实验对中药复方“冬夏丸”作用
于高 、低分化鼻咽癌细胞后进行细胞周期和凋亡的
FCM 分析结果表明 ,G1期出现减少倾向 ,细胞明显
阻滞于 G2期 ,且在较高药物浓度时出现明显凋亡
峰 ,提示中药复方“冬夏丸”对肿瘤细胞的生长可能
是通过杀伤G1期细胞 、阻止G2期细胞继续分裂及
诱导细胞发生凋亡所致 ,这与 5-Fu主要杀伤 S期或
G2期细胞的作用机理不同。
中药复方 “冬夏丸” 由我们原先证实具有抑瘤
作用或抑制 EBV抗原表达作用的中草药和海洋生
物再配与有增强免疫功能等作用的其他中药组成。
除本实验结果外 , 我们在另外的实验也证实该药在
(下转 334页)
·331·肿瘤防治研究 1999年第 26 卷第 5期
The Clinicopathology and Immunohistochemical Study
of Esophagus Small Cell Carcinoma
XIA He-shun CHEN CHUN-mei WU Jian-ping
Department of pathology , Hubei cancer hospital ,Wuhan 430079
Abstract:Objective study the clinic pathological character and histogenesis of primary esophagus small cell cancer.
Methods use the immunohistochemistry.Results 7 cases were pure small cell types , 4 intermediate types , 3 combined
types.Immunohistochemically , ten cases showed positive immunoreaction to cytokeratin.EMA.NSE.Chromogranin A
Synaptophysin 12.13.6.4 cases , respectively .Among the patients which obtained follow have 6 case died within half
year.Conclusion this study indicate that small cell carcinoma of esophagus is highly malignancy , support its histogenesis
may origin from the multipotent stem cells.
Key words:esophagus neoplasm;small cell carcinoma;Clinical pathology;immunohistochemistry
(上接 326 页)
selected with G418.Cells growth properties , 3H-TdR and cell cycle analysis were done.Results The cyclin E
overexpression could obviously increase the cells growth speed(1.52 fold higher than vector control)and DNA
synthesis(1.75 fold)and also increase the cells progression from G1 to S phase.The hyperphosphorylation
form of pRB was increased(3 fold).ConclusionHigh expression of cyclin E could effect the cell growth and
cell proliferation probably through regulating the phosphorylation of pRB and G1-S progression.
Key words:Cyclin E;Gene transfection;Cell cycle;pRB
(上接 331 页)
体外可抑制 EBV壳抗原(VCA)和早期抗原(EA)表
达及在体内具有降低 IgA VCA和提高细胞免疫功能
的作用[ 7] ,这些作用是化学抗癌药或某些具有抗癌
作用的单味中草药所没有的 ,而这对肿瘤尤其是与
EBV关系密切的鼻咽癌的防治可能是重要的 。本研
究结果为该药进一步应用于肿瘤特别是鼻咽癌的临
床防治研究提供了重要实验依据。
参考文献:
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疫功能的影响.中国免疫学杂志 , 1995 , 11(增刊):581
Effect of Chinese Medicine Compound “Dong Xia Wan” on
6 Human Tumor Cell Lines in Vitro
HUANG Pei-chun ,DENG Hui-hua ,ZHAO Ming-lun , et al
Institute of Oncology , Guangdong Medicol College , Zhanjiang 524023
Abstract:Objective To research the effect of Chinese medicine “dong xia wan” on 6 human tumor cell
lines in vitro.Methods growth and cell cycle of human tumor cells lines were determined by microplate staining
and flow cytometry measurement.Results growth of all examined tumor cell lines were markedly inhibited by
“dong xia wan” .The inhibitory rate of growth was increased as the concentration of drug was increased.IC50 of
the drug was like for most tumor cell lines.For nasopharyngeal carcinoma(NPC)cells treated by the drug , the
percentage of G2 was much increased and cell apoptosis was induced.Conclusion Chinese medicine “dong xia
xan” can inhibit the growth of NPC and many kinds of tumor cells.
Key words:Dong xia wan;Marine organism;Tumor cells;Cell cycle;Apoptosis
·334· 肿瘤防治研究 1999 年第 26卷第 5 期