全 文 ：第 43卷　第 1期 哈尔滨医科大学学报 Vol.43 , No.1
　 2009年 2月 JOURNALOFHARBINMEDICALUNIVERSITY Feb., 2009
技术与方法
大孔吸附树脂分离纯化红松松塔水提物
屈东香 ,陈秀杰＊ ,朱文良 ,刘永胜 ,刘　磊
(哈尔滨医科大学生物信息科学与技术学院 药代动力学教研室 ,黑龙江 哈尔滨 150081)
[摘要 ] 　目的　研究大孔吸附树脂分离纯化松塔水提物的工艺。方法　使用大孔吸附树脂 ,采用动态吸附-解吸
模式进行纯化 , 通过动态吸附曲线观察吸附量及洗脱能力;利用 HPLC法检测纯化后松塔水提物的含量。结果　
最佳条件为大孔吸附树脂柱柱床体积(BV)的一半;蒸馏水洗脱的体积为 5 BV;所用洗脱剂为体积分数 40%的乙
醇 , 用量为 8BV。结论　弱极性树脂 AB-8适合用于松塔水提物的纯化。
[关键词 ] 　红松松塔;水提物;大孔吸附树脂
[中图分类号 ] R943　　[文献标识码 ] A　　[文章编号 ] 1000-1905(2009)01-0073-03
Separationandpurificationofaqueousextractofpineconeof
PinusKoraiensisbymacroporousadsorptionresins
QUDong-xiang, CHENXiu-jie, ZHUWen-liang, etal
(ColegeofBioinformaticScienceandTechnology, HarbinMedicalUniversity, Harbin150081, China)
Abstract:Objective　Toexploretheprocessofseparationandpurificationofaqueousextractofpinecone
ofPinusKoraiensisbymacroporousadsorptionresins.Methods　Thedynamicadsorption-desorption
characteristicswasusedtopurifythesamplebymacroporousadsorptionresins.Theadsorptionquantity
andelutingpowerwereinvestigatedbydynamicadsorptioncurve.Thecontentsoftheefectivefractionof
aqueousextractofpineconeofPinusKoraiensisweredeterminedbyHPLCafterpurification.Results　
Theoptimalconditionwasthatthemaximumadsorptionquantityofmacroporousadsorptionresinswashalf
thevolumeoftheresinbed(BV), thevolumeofwaterwas5BVandthevolumeof40%(V/V)ethanolas
eluantwas8BV.Conclusion　AB-8macroporousadsorptionresinscanefectivelyandsimplybeusedto
separateandpurifytheaqueousextractofpineconeofPinusKoraiensis.
Keywords:pineconeofPinuskoraiensis;aqueousextract;macroporousadsorptioresins
[收稿日期 ] 2008-03-06
[作者简介 ]屈东香(1984-),女 , 黑龙江齐齐哈尔人 ,硕士研究生。
＊通讯作者
　　松塔系松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物红松 、
马尾松 、华山松 、油松等的球果 。 《本草纲目》记载松
塔具有祛痰 、止咳平喘 、祛风 、润肠 、安神的功效 。现
代文献表明松塔中含有多种具有药理活性的成分 ,
作为药物可以治疗风湿病 ,还具有抗感染 、抗菌等功
效 [ 1-2] 。在民间有人用松塔煮水来治疗胃癌和肝癌 ,
且疗效明显 ,因此具有很大的开发潜力。为了寻找
松塔中水提物的活性部位 ,首先要对水提物进行工
艺优化。本研究通过对 5种大孔吸附树脂的动态吸
附量和洗脱率进行比较后 ,选用 AB-8型大孔吸附树
脂 ,对分布于我国小兴安岭地区的红松松塔进行了
研究 ,力求寻找出无毒无污染的分离纯化方法 ,为红
松松塔的药用奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料
Waters600高效液相色谱仪 , Empower色谱工作
站(美国 Waters公司);色谱柱:AgilentC18柱(250
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哈尔滨医科大学学报 第 43卷
mm×4.6 mm, 5 μm,美国 Agilent公司);D3520型 、
AB-8型 、NKA-9型 、D4020型 、S-8型大孔吸附树脂
(天津海光化工有限公司);松塔(购于黑龙江小兴
安岭红松林区 ,并经哈尔滨医科大学生药学教研室
金锐教授鉴定为松科植物红松松塔);乙腈(色谱
纯),无水乙醇(分析纯)。
1.2　方法
1.2.1　上柱粗提液的制备
1.2.1.1　预处理:取松塔碎片 1 000 g,用 95%乙醇
浸泡 24 h脱脂 。将已脱脂的松塔碎片风干 24 h后 ,
密闭保存备用。
1.2.1.2　粗提液的制备:取已脱脂的松塔碎片 40
g,粉碎至过 20目筛 ,用 8倍蒸馏水 ,回流提取 1 h,
提取 2次 ,趁热抽滤 ,合并两次滤液 ,得粗提液 。
1.2.2　水提物中成分含量的测定
1.2.2.1　高效液相色谱测定条件:色谱柱:Agilent
C18(250 mm×4.6 mm5 μm);流动相:乙腈∶水(6
∶4);检测波长:280 nm;流速:1 mL/min;柱温:室
温;进样量:10μL。
1.2.2.2　测定方法:提取液过 0.45 μm微孔滤膜 ,
吸取 10 μL注入高效液相色谱仪(HPLC)中测定 ,得
提取物的总峰面积 ,并利用公式计算粗提物中物质
的浓度(浓度 =总峰面积 ×液体体积 /红松松塔的质
量)。
1.2.3　大孔吸附树脂纯化红松松塔水提物
1.2.3.1　大孔吸附树脂的筛选:将 D3520型 、AB-8
型 、NKA-9型 、D4020型 、S-8型大孔吸附树脂先用 4
倍体积量 95%乙醇浸洗 ,至浸洗液加适量蒸馏水无
白色浑浊现象时止 ,用水反复清洗干净至无醇味或
无酮味 ,加入 4倍体积量 2 mol/L的氢氧化钠溶液 ,
浸泡 12 h,以水洗至中性;再加入 4倍体积量 4mol/
L的盐酸 ,浸泡 12 h,用蒸馏水洗至中性在 60℃下烘
干后备用。
精确称取 3份经上述预处理的干树脂各 1 g,置
于 100mL三角瓶中 ,精确加入上样粗提液 20mL后
震荡吸附 ,频率 120次 /分 , 1 min间隔振荡 2 h,然后
静置 20 h, 使其达到饱和吸附 , 吸取上层液体经
HPLC测定总峰面积 ,并根据 1.2.2.2中的公式计算
出液体的浓度 ,按下式计算树脂饱和吸附量:饱和吸
附量 =[ (初始浓度-吸附后浓度)×吸附液体积 ] /树
脂量 ,取 3次测定值的平均值 。将经静态饱和吸附
后树脂滤出 ,吸干表面水分 ,精密加入 60%浓度的乙
醇 20mL后同上法震荡 2 h后滤出 ,测定洗脱液总
峰面积 ,计算洗脱率(洗脱率 =[洗脱液浓度 ×洗脱
液体积 ] /饱和吸附量 ×100%),取 3次测定值的平
均值 。
1.2.3.2　动态吸附曲线的绘制:取 AB-8型大孔树
脂 20g,湿法装入 1.2cm×30 cm的色谱柱中 ,树脂
厚度约 20 cm,径高比为 1∶16,柱床体积(BV)为 20
mL。取松塔提取液以 1 BV/h的流速上柱 ,分段收
集过柱流出液 ,每上柱 1 mL就用 HPLC检测(条件
如 1.2.2.1中所述),测定其中成分的总峰面积(未
吸附率(%)=(流出液总峰面积 /松塔提取物原液
总峰面积)×100 %)(原液总峰面积为 43424680)。
以未吸附率为纵坐标 ,以松塔提取物的上柱液量为
横坐标 ,绘制洗脱曲线。
1.2.3.3　水洗终点用水体积的确定:取松塔提取物
10mL上柱 ,以 1BV/h的流速进行树脂吸附 ,再以
成倍柱床体积的蒸馏水洗脱。取洗脱液用 HPLC进
行检测 ,以洗脱液的吸收峰总面积为纵坐标 ,蒸馏水
的柱床体积倍数为横坐标 ,绘制曲线图 。
1.2.3.4　洗脱溶剂体积分数及用量的确定:按上述
确定的工艺条件 ,取供试品溶液 10 mL各 3份 ,以 1
BV/h的流速上柱 ,分别通过 AB-8树脂柱(20 g)进
行吸附 , 3根树脂柱先分别用 100 mL蒸馏水洗脱 ,
再分别用体积分数为 20%、30%、40%的乙醇洗脱 ,
洗脱速度均为 0.5 mL/min。每份收集 20 mL,测定
各份洗脱液中有效成分含量 ,以乙醇的柱床体积倍
数为横坐标 ,以洗脱液的吸收峰总面积为纵坐标 ,绘
制洗脱曲线。
2　结果
2.1　大孔吸附树脂的筛选结果
见附表。
附表　5种树脂对红松松塔粗提液的静态饱和吸附洗脱结果
树脂种类 饱和吸附量 洗脱率(%)
D3520型 90652318 80.35
AB-8型 100078940 93.65
NKA-9型 82659438 84.13
D4020型 89623011 73.24
S-8型树脂 76352648 81.28
　　由测定结果可知 , AB-8型大孔吸附树脂对红松
松塔粗体液的吸附能力和洗脱能力都是最好的 ,故
本研究采用 AB-8型大孔吸附树脂对红松松塔粗提
液进行分离纯化。
2.2　动态吸附曲线结果
由测定结果可知 ,上样量为 10 mL时 ,泄漏量开
始显著增大 ,其累积泄漏百分率接近 5 %,说明此时
开始明显泄漏 ,故确定树脂的最大上样量为 10 mL,
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第 1期 屈东香 ,等.大孔吸附树脂分离纯化红松松塔水提物
即柱床体积的一半 ,见图 1。
图 1　动态吸附曲线
2.3　水洗终点用水体积的结果
由测定结果和洗脱曲线可知 ,当以 5 BV的蒸馏
水洗脱时 ,松塔提取物已经超过 98%被洗脱干净。
当以 6 BV的蒸馏水洗脱时 ,总峰面积已经为 0。所
以 ,用 5 BV的蒸馏水洗脱就能达到较好的效果(图
2 )。
图 2　水的用量结果曲线
2.4　洗脱溶剂体积分数及用量的比较
在使用 40%乙醇洗脱后 ,追加 50%乙醇进行洗
脱 ,其洗脱液经 HPLC检测无吸收峰。由测定结果
和洗脱曲线可知 ,用体积分数为 40%的乙醇洗脱 ,解
吸较快且洗脱剂用量较少 ,色谱带集中 ,洗脱完全 ,
故选择体积分数为 40 %的乙醇为洗脱剂。在洗脱
剂用量为 160 mL时 ,能将大部分成分解吸下来 ,故
确定洗脱剂用量为 8BV(图 3)。
图 3　乙醇体积分数及用量
3　讨论
由于目前红松松塔的水溶性成分不明确 ,没有
固定的质量标准 ,故只能用高效液相色谱(HPLC)的
总吸收峰面积来评价松塔水提液中水提物的含量 。
所以本研究采用 HPLC来进行所有的检测 ,并通过
HPLC的总吸收峰面积简单计算浓度来评价松塔水
提液中水提物的含量。
大孔树脂具有吸附性能好 、吸附效率高 、再生简
单 、解吸方便等优点 ,经常用于植物化学成分的分离
和纯化[ 3] 。 AB-8型大孔吸附树脂是弱极性的 ,适用
于水溶性的具有弱极性的物质的提取 、分离 、纯化 。
提取溶剂为水 ,不易浓缩 。将提取液直接上大
孔树脂柱 ,方法简单快捷 ,可行性高 ,且整个过程所
用溶剂仅仅是乙醇 ,没有有机物残留的问题 ,所得产
品可直接用于药用 ,真正达到了无毒无污染 。
上样及洗脱时流速过大 ,会使树脂的工作吸附
量下降 ,提早泄漏 ,耗能增多 。故在考察其他因素对
纯化影响时 ,尽量将流速限定在最小范围内 。根据
放大验证实验 ,综合考虑洗脱时间和溶剂用量 2个
因素 ,确定上样药液及水洗脱除杂时流速为 1
BV/h,醇洗脱解吸附和树脂再生时流速为 1.5 BV/
h。
红松松塔水提物经 AB-8大孔吸附树脂柱分离
纯化后分成两部分:水洗部分和醇洗部分 ,整个过程
操作简便快捷 ,得到的产品纯度高 ,没有分解 ,为药
效学研究奠定了基础。
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