全 文 ：第 35 卷第 4 期
2015 年 8 月
林 产 化 学 与 工 业
Chemistry and Industry of Forest Products
Vol． 35 No． 4
Aug． 2015
doi:10． 3969 / j． issn． 0253-2417． 2015． 04． 021
产香叶醇重组大肠杆菌发酵培养基的优化
收稿日期:2014-07-22
基金项目:国家 863 计划资助(2013AA050703 － 2);国家自然科学基金资助项目(21376255);青岛生物能源与过程研究所所长创新
基金青年人才专项资助(无编号)
作者简介:田 宁(1990—)，女，河北石家庄人，硕士生，主要从事生物化工方面的研究
* 通讯作者:胡仰栋(1957—)，男，教授，博士生导师，主要从事化工过程系统工程方面的研究;E-mail:ydhuhd@ ouc． edu． cn。
TIAN Ning
田 宁1，咸 漠2，胡仰栋1
*
，刘 炜2
(1．中国海洋大学化学化工学院，山东 青岛 266100;2．中国科学院生物基材料重点实验室;
中国科学院青岛生物能源与过程研究所，山东 青岛 266101)
摘 要: 利用 Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验和中心组合设计对产香叶醇重组大肠杆菌的发
酵培养基进行了优化。首先运用 Plackett-Burman 设计对 7 种培养基组分进行了筛选;然后运用最
陡爬坡法使关键因素的浓度接近最佳响应区域;最后通过中心组合设计确定了关键因素的最佳浓
度及回归模型。结果表明柠檬酸铁铵、硫酸镁和微量元素混合液为影响香叶醇产量的关键因素，其最佳浓度分别为
0. 13 g /L，2． 12 g /L和 16． 7 mL /L，在此条件下香叶醇的产量可达 223． 24 mg /L，是优化前香叶醇产量(68． 5 mg /L)的
3. 26 倍。
关键词: 香叶醇;培养基优化;响应面;重组大肠杆菌
中图分类号:TQ35 文献标识码:A 文章编号:0253-2417(2015)04-0131-07
引文格式:田宁，咸漠，胡仰栋，等．产香叶醇重组大肠杆菌发酵培养基的优化［J］．林产化学与工业，2015，35(4):131－137．
Optimization of Medium for Production of Geraniol by the
Ｒecombinant Escherichia coli
TIAN Ning1，XIAN Mo2，HU Yang-dong1，LIU Wei2
(1． College of Chemistry and Chemical Technology，Ocean University of China，Qingdao 266100，China;
2． CAS Key Laboratory of Biobased Materials，Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess
Technology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266101，China)
Abstract:The Plackett-Burman experiment，the steepest ascent experiment and the central composite design were used to
optimize the fermentation medium for the production of geraniol by the recombinant E． coli． Firstly，Plackett-Burman design was
used to screen the critical factors which influenced the geraniol production from seven mediums． Secondly，the method of steepest
ascent was adopted to make the key factors approach the optimal response area． Finally，the optimal concentration of key factors
and regression model were obtained by central composite design． It was indicated that ammonium ferric citrate，MgSO4，and trace
element solution were identified to be the significant factors and the it optimal concentrations were 0． 13 g /L，2． 12 g /L，and
16. 7 mL /L，respectively． The geraniol concentration increased to 223． 24 mg /L under these conditions． It was about 3. 26 times
more than that of before．
Key words:geraniol;medium optimization;response surface methodology;recombinant E． coli
香叶醇(2，6-二甲基-2，6-辛二烯-8-醇)是一种无环单萜烯醇，作为玫瑰系香精的主剂，广泛应用于
日化、烟草和食品等领域［1－2］。此外，香叶醇还可用作天然低毒防虫剂及新型的化学防癌制剂［3－4］，市场
需求旺盛。目前香叶醇的来源主要分为 2 个部分，一是植物的提取，二是工业上常用的化学合成。然而
植物中香叶醇的含量非常低，且容易受到季节变化、植物病害和环境的影响［5］。化学合成法中的原料
为不可再生的石油化工产品，反应过程会造成环境污染，且选择性差，属于非天然途径［6］。针对香叶醇
132 林 产 化 学 与 工 业 第 35 卷
传统合成方法的瓶颈问题及市场对天然香叶醇需求的日益增长，以廉价、可再生的生物质为原料生物合
成香叶醇已成为发展趋势。目前，生物法合成香叶醇已有初步研究。Fischer 等［7］在酿酒酵母中通过过
表达法呢基焦磷酸合成酶的突变酶(FPPS)和甜罗勒的香叶醇合成酶(ObGES)使香叶醇产量仅为
5 mg /L;Liu等［8］在酿酒酵母中优化甲羟戊酸(MVA)途径中的关键控制点使香叶醇产量达到 36. 04 mg /L。
然而，现有报道均是从分子水平修饰代谢途径来提高香叶醇产量，而从物质优化角度提高产量的报道尚
未见报道。发酵培养基对菌体的生长、产物的合成与产量均有重要影响，培养基的优化在发酵生产中举
足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。近年来，响应面法广泛应用于微生物发酵培养基的优化，
并取得良好的效果［9－11］。本研究采用前期构建的、可利用葡萄糖合成香叶醇的工程大肠杆菌 LWG6，在
前期单因素试验的基础上，利用 Plackett-Burman 实验、最陡爬坡实验和中心组合实验对产香叶醇重组
大肠杆菌的发酵培养基进行了优化，进一步提高了香叶醇产量，为香叶醇的进一步放大研究提供了理论
基础与技术支持。
1 实 验
1． 1 材料
1． 1． 1 菌株 重组大肠杆菌(Escherichia coli)LWG6 可利用葡萄糖生物合成香叶醇，该菌株由中国科
学院青岛生物能源与过程研究所生物基化学品团队实验室构建和保存。
1． 1． 2 试剂 胰蛋白胨、酵母提取物购自 OXOID公司;酵母浸粉购自北京奥博星生物技术有限责任公
司;琼脂、氨苄青霉素、氯霉素、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自索莱宝科技有限公司;香叶醇标准品购
自西格玛奥德里奇贸易有限公司;氯化钠、磷酸氢二钾、一水合柠檬酸(C6H8O7·H2O)、柠檬酸铁铵、葡
萄糖、硫酸镁、(NH4)6Mo7O24·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnCl2·4H2O，均为分析纯。
1． 1． 3 仪器 ZHWY-1112B型恒温摇床，上海智诚分析仪器制造有限公司;1-14 型台式高速离心机，德
国 Sigma公司;Vortex-Genie-2 型涡旋振荡器，美国 Scientific Industries公司;SP-6890 型气相色谱仪，山东
鲁南瑞虹公司;Agilent 7890-5975C型气相色谱-四极杆质谱联用仪，美国安捷伦公司;Cary 50 UV-Vis型
紫外分光光度计，美国 Varian公司。
1． 1． 4 培养基 每种培养基添加 100 mg /L氨苄青霉素和 34 mg /L氯霉素。
1． 1． 4． 1 LB培养基 胰蛋白胨 10 g /L，酵母提取物 5 g /L，氯化钠 10g /L，pH值 7． 0，固体培养基添加
20 g /L琼脂。
1． 1． 4． 2 初始 M9 发酵培养基 葡萄糖 2 g /L，酵母浸粉 9 g /L，磷酸氢二钾 9． 8 g /L，一水合柠檬酸
2． 1 g /L，柠檬酸铁铵 0． 3 g /L，硫酸镁 0． 24 g /L，微量元素(ZnSO4·7H2O 2． 9 g /L，(NH4)6Mo7O24·4H2O
3． 7 g /L，H3BO3 24． 7 g /L，CuSO4·5H2O 2． 5 g /L，MnCl2·4H2O 15． 8 g /L)混合液 1 mL /L，pH值 6． 5。
1． 2 培养条件和方法
挑取 LB固体培养基上的 LWG6 单克隆于装有 5 mL LB 培养基的 20 mL 小瓶中，37 ℃、180 r /min
摇床培养 12 h;然后按 1%接种量转接到装有 50 mL LB培养基的 100 mL三角瓶中，37 ℃、180 r /min摇
床摇菌 5 h;再将 1 mL的种子液接种到装有 100 mL发酵培养基的 600 mL输液瓶中，37 ℃、180 r /min摇床
培养，当菌体 600 nm处光密度(OD600)值达到 0． 8 ～ 1． 0 时，加入终浓度为 1． 0 mmol /L 的 IPTG 进行诱
导，30 ℃、180 r /min发酵 48 h。
1． 3 发酵培养基的优化
1． 3． 1 Plackett-Burman实验设计 对 7种培养基组分进行筛选，根据前期单因素试验结果，选择酵母浸
粉(X1)、葡萄糖(X2)、磷酸氢二钾(X3)、一水合柠檬酸(X4)、柠檬酸铁铵(X5)、硫酸镁(X6)和微量元素混
合液(X7)7个因素，以及 X8、X9、X10和 X11 4 个空项作误差分析，每个因素取高低 2 个水平，采用 Design
expert 7． 0软件进行 n =12的 P-B实验设计，每组实验重复 3次取平均值。根据所得结果分析各因素对香
叶醇产量的效应，并进行显著性(P ＜0． 05)评价，从而筛选出对香叶醇产量有显著影响的因素。
1． 3． 2 最陡爬坡实验 根据 P-B实验结果选出的关键因素进行最陡爬坡实验，使关键因素的浓度快速
第 4 期 田 宁，等:产香叶醇重组大肠杆菌发酵培养基的优化 133
逼近最佳响应区域。
1． 3． 3 中心组合实验设计(CCD实验) 中心组合实验设计用于确定 3 种关键因素的最佳浓度，并分
析各因素的主效应和交互效应，最终提高香叶醇产量。根据 P-B 实验确定的 3 个显著因素和最陡爬坡
实验得到的中心点，实验采用 3 因素 5 水平，一个星点，α 为 1． 68，中心点重复 6 次，运用 Design expert
7． 0 软件进行 n = 20 的实验设计，每组实验重复 3 次取平均值［12］。
1． 4 香叶醇的检测及菌浓测定
发酵结束后，取 2 mL发酵液，12 000 r /min离心 1 min，取 1 mL 上清液并加入等体积乙酸乙酯，涡
旋振荡 5 min，静置 10 min，取上层有机相进行检测。首先运用 GC-MS 进行定性鉴定，确定发酵产物为
香叶醇之后，实验中的产物运用气相色谱检测，均以香叶醇标准品作为定性定量标准。Agilent 7890-
5975C型气相色谱-四极杆质谱联用仪，色谱柱为 HP-INNOWAX 柱(30 m × 0． 25 mm × 0． 25 μm)，检测
器分别为氢火焰离子化检测器和四级杆质谱检测器，柱室温度 50 ℃起步以 10 ℃ /min 升温至 250 ℃，
保温 5 min，气化室和检测室温度均为 250 ℃。SP-6890 气相色谱仪，色谱柱为 HP-INNOWAX 柱，检测
器为氢火焰离子化检测器，柱室、气化室和检测器温度同上。紫外分光光度计在波长为 600 nm 时测定
菌体浓度。
2 结果与讨论
2． 1 发酵产物定性检测结果
香叶醇标准品及发酵产物的 GC-MS图如图 1 所示。由图 1 可知，发酵产物峰的保留时间与香叶醇
标准品峰的保留时间相同，且质谱图一致，均有香叶醇理论相对分子质量 154 的峰，则能确定发酵产物
为香叶醇。
图 1 GC-MS检测结果
Fig． 1 The GC-MS results
2． 2 Plackett-Burman实验结果
P-B设计及结果见表 1。根据表 1 结果对各因素进行显著性分析，结果见表 2。由表 2 的回归分析
可知，模型的 F值为 14． 53，P值为 0． 010 6，表明该模型在 95%的置信度内显著，实验有 1． 06%的可能
性被影响。由各变量的系数得知，酵母浸粉、葡萄糖、磷酸氢二钾和柠檬酸铁铵对香叶醇产量显示负效
应，而一水合柠檬酸、硫酸镁和微量元素混合液对香叶醇产量显示正效应。其中，X5(柠檬酸铁铵，P =
0． 035 9)、X6(硫酸镁，P = 0． 017 8)和 X7(微量元素混合液，P = 0． 001 4)在 95%的置信度内对香叶醇
产量有显著影响，因此筛选出这 3 个因素为关键因素。分析原因可能是:柠檬酸铁铵不仅为微生物生长
提供碳源，而且还能提供微生物代谢所必需的微量元素铁离子;硫酸镁是许多酶的活化剂，对酶的催化
有重要影响，同时促进碳水化合物的新陈代谢、磷酸盐的转化等;微量元素作为酶的组成部分和激活剂，
影响酶的催化活性，还可调节培养基的渗透压、氧化还原电位等［13－14］，三者均在一定程度上影响着菌体
的生长和代谢产物的形成。此外，其余不显著因素根据正负效应浓度分别为:葡萄糖 8 g /L，酵母浸粉
6 g /L，K2HPO4·3H2O 3． 5 g /L，一水合柠檬酸 1． 4 g /L。
134 林 产 化 学 与 工 业 第 35 卷
表 1 P-B实验设计及结果1)
Table 1 The design and results of Plackett-Burman experiment
编号
No．
X1 /
(g·L－1)
X2 /
(g·L－1)
X3 /
(g·L－1)
X4 /
(g·L－1)
X5 /
(g·L－1)
X6 /
(g·L－1)
X7 /
(mL·L－1)
X8 X9 X10 X11
香叶醇质量浓度 /
(mg·L－1)
geraniol
concentration
1 6 16 7 0． 7 0． 2 2． 4 20 － 1 － 1 － 1 1 170． 0
2 12 8 7 1． 4 0． 1 2． 4 20 1 － 1 － 1 － 1 184． 8
3 12 16 7 0． 7 0． 1 1． 2 20 － 1 1 1 － 1 165． 8
4 12 8 3． 5 0． 7 0． 2 1． 2 20 1 － 1 1 1 163． 1
5 6 8 7 0． 7 0． 2 2． 4 10 1 1 1 － 1 146． 0
6 12 8 7 1． 4 0． 2 1． 2 10 － 1 1 － 1 1 138． 9
7 6 8 3． 5 0． 7 0． 1 1． 2 10 － 1 － 1 － 1 － 1 157． 2
8 6 16 7 1． 4 0． 1 1． 2 10 1 － 1 1 1 140． 3
9 12 16 3． 5 0． 7 0． 1 2． 4 10 1 1 － 1 1 151． 0
10 12 16 3． 5 1． 4 0． 2 2． 4 10 － 1 － 1 1 － 1 155． 2
11 6 16 3． 5 1． 4 0． 2 1． 2 20 1 1 － 1 － 1 164． 6
12 6 8 3． 5 1． 4 0． 1 2． 4 20 － 1 1 1 1 202． 2
1)X1:酵母浸粉 yeast extract powder;X2:葡萄糖 glucose;X3:K2HPO4·3H2O;X4:C6H8O7·H2O;X5:柠檬酸铁铵 ammonium ferric citrate;
X6:MgSO4;X7:微量元素混合液 trace element solution;X8 ～ X11:空项 null term
表 2 P-B实验设计效应分析
Table 2 The effect analysis in Plackett-Burman experiment
因素
factor
平方和
SS
均方
MS
F值
F-value
P值
P-value
系数
coefficient
显著性
significance
模型 model 3532． 11 504． 59 14． 53 0． 0106 161． 59 *
X1 38． 52 38． 52 1． 11 0． 3517 － 1． 79
X2 171． 01 171． 01 4． 92 0． 0907 － 3． 77
X3 188． 02 188． 02 5． 41 0． 0806 － 3． 96
X4 90． 20 90． 20 2． 60 0． 1824 2． 74
X5 336． 02 336． 02 9． 67 0． 0359 － 5． 29 *
X6 524． 04 524． 04 15． 09 0． 0178 6． 61 *
X7 2184． 30 2184． 30 62． 88 0． 0014 13． 49 ＊＊
2． 3 最陡爬坡实验结果
最陡爬坡实验中关键因素的变化步长和爬坡方向是根据 P-B实验结果的系数确定，如果系数为正，
则该因素水平递增，反之递减，其他因素的取值也是根据系数的正负而定，系数为正的取高水平，反之取
低水平。每组实验重复 3 次取平均值，实验结果中香叶醇产量最高的一组为中心组合实验的中心
点［15－16］。最陡爬坡实验设计与结果见表 3，由表可知，香叶醇产量随关键因素浓度的变化而变化，产量
最高的为第 4 组，所以选第 4 组为中心组合实验(CCD 实验)的中心点，用于发酵培养基组分的进一步
优化，使关键因素的浓度接近最佳响应区域。
表 3 最陡爬坡实验设计及结果
Table 3 The design and results of steepest ascent experiment
实验号
No．
柠檬酸铁铵 /(g·L－1)
ammonium ferric citrate
MgSO4 /(g·L－1) 微量元素混合液 /(mL·L－1)
trace element solution
香叶醇质量浓度 /(mg·L－1)
geraniol concentration
1 0． 200 1． 2 10 160． 0
2 0． 175 1． 5 12． 5 166． 8
3 0． 150 1． 8 15 178． 2
4 0． 125 2． 1 17． 5 198． 5
5 0． 100 2． 4 20 181． 6
第 4 期 田 宁，等:产香叶醇重组大肠杆菌发酵培养基的优化 135
2． 4 中心组合实验(CCD实验)结果
选用最陡爬坡实验得到的中心点设为零水平，采用 Design expert 7． 0 软件进行中心组合实验设计，
实验设计及结果见表 4，方差分析见表 5。
表 4 中心组合实验设计及结果
Table 4 The design and results of central composite experiment
实验号
No．
x1
柠檬酸铁铵 /(g·L－1)
ammonium ferric citrate
x2
MgSO4 /(g·L－1)
x3
微量元素混合液 /(mL·L－1)
trace element solution
香叶醇质量浓度 /(mg·L－1)
geraniol concentration
1 0． 100 1． 8 20． 0 155． 1
2 0． 125 2． 6 17． 5 158． 9
3 0． 170 2． 1 17． 5 170． 2
4 0． 125 1． 6 17． 5 165． 7
5 0． 100 2． 4 15． 0 188． 5
6 0． 125 2． 1 17． 5 224． 6
7 0． 080 2． 1 17． 5 164． 9
8 0． 125 2． 1 21． 7 169． 3
9 0． 150 1． 8 15． 0 193． 8
10 0． 125 2． 1 17． 5 223． 1
11 0． 125 2． 1 17． 5 235． 7
12 0． 125 2． 1 13． 3 195． 3
13 0． 150 2． 4 15． 0 192． 5
14 0． 100 2． 4 20． 0 188． 3
15 0． 150 1． 8 20． 0 157． 8
16 0． 150 2． 4 20． 0 184． 8
17 0． 125 2． 1 17． 5 213． 3
18 0． 100 1． 8 15． 0 175． 6
19 0． 125 2． 1 17． 5 221． 9
20 0． 125 2． 1 17． 5 224． 4
表 5 中心组合设计回归模型的方差分析
Table 5 ANOVA of regression model in central composite design
变量
variables
自由度
degree of freedom
平方和
sum of square
均方
mean square
F值
F-value
P值
P-value
显著性
significance
模型 model 9 11541． 68 1282． 41 11． 31 0． 0004 ＊＊
x1 1 67． 29 67． 29 0． 59 0． 4590
x2 1 266． 81 266． 81 2． 35 0． 1561
x3 1 856． 08 856． 08 7． 55 0． 0206 *
x1 x2 1 52． 02 52． 02 0． 46 0． 5136
x1 x3 1 66． 12 66． 12 0． 58 0． 4628
x2 x3 1 295． 25 295． 25 2． 60 0． 1377
x21 1 4340． 72 4340． 72 38． 27 0． 0001 ＊＊
x22 1 5318． 86 5318． 86 46． 90 ＜ 0． 0001 ＊＊
x23 1 2124． 03 2124． 03 18． 73 0． 0015 ＊＊
残差 residual 10 1134． 17 113． 42
失拟项 lack of fit 5 877． 21 175． 44 3． 41 0． 1020
纯误差 pure error 5 256． 95 51． 39
总变异 corrected total 19 12679． 85
由实验结果得到的三元二次回归方程为:
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y =8 549． 859 79x1 +812． 0126 3x2 +53． 558 57x3 － 340． 0x1x2 － 46． 0x1x3 + 8． 1x2x3 － 27 768． 294 38x
2
1 －
213． 459 33x22 － 1． 942 44x
2
3 － 1 625． 481 27
模型的相关系数:Ｒ2 = 0． 910 5。由表 5 得知，模型的 P值 0． 000 4，表明回归方程极显著。变量 x3、
x21、x
2
2、x
2
3 在 95%的置信度上显著，而 x1、x2、x1x2、x1x3 和 x2x3 没有表现出对香叶醇产量的显著影响，则
说明各因素间的交互作用不显著。模型的 Ｒ2 = 0． 910 5，表明该模型以 91． 05%的精确度解释培养基成
分对产量的影响。
通过软件分析，得出回归模型的极值点，即最佳浓度为柠檬酸铁铵 0． 13 g /L，硫酸镁 2． 12 g /L，微量
元素混合液 16． 7 mL /L，此时模型的响应值为 224． 94 mg /L。为了验证模型的准确性，对此预测值进行
了 3 次重复实验，结果得到香叶醇质量浓度为 223． 24 mg /L，实验值与预测值接近，说明模型与真实情
况高度相符。相比优化前初始培养基的香叶醇产量(68． 5 mg /L)提高了 2． 26 倍。
3 结 论
3． 1 通过 Plackett-Burman实验对 7 种培养基组分进行了筛选，最终筛选出柠檬酸铁铵、硫酸镁和微量
元素混合液为影响香叶醇产量的关键因素。
3． 2 通过最陡爬坡实验和中心组合设计确定了培养基组分的最佳浓度:葡萄糖 8 g /L，酵母浸粉 6 g /L，
K2HPO4·3H2O 3． 5 g /L，一水合柠檬酸 1． 4 g /L，柠檬酸铁铵 0． 13 g /L，硫酸镁 2． 12 g /L，微量元素混合
液 16． 7 mL /L。
3． 3 根据优化条件对回归模型进行验证，香叶醇产量达到 223． 24 mg /L，与预测值(224． 94 mg /L)接
近，说明模型与真实情况高度相符。相比优化前初始培养基的香叶醇产量(68． 5 mg /L)提高了 2． 26
倍。说明运用该模型来优化重组大肠杆菌产香叶醇的发酵培养基是行之有效的，且为进一步放大实验
提供了有力参考。
参考文献:
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*
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