全 文 ：药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (9): 1503−1509 · 1503·
卷柏中穗花杉双黄酮对 TNF-α诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用
郑晓珂, 刘彩霞, 翟英英, 李玲玲, 王小兰, 冯卫生*
(河南中医学院, 河南 郑州 450046)
关键词: 穗花杉双黄酮; 人脐静脉内皮细胞; 血管内皮损伤; 血管内皮保护作用
中图分类号: R963 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2013) 09-1503-07
Protection effect of amentoflavone in Selaginella tamariscina against
TNF-α-induced vascular injure of endothelial cells
ZHENG Xiao-ke, LIU Cai-xia, ZHAI Ying-ying, LI Ling-ling, WANG Xiao-lan, FENG Wei-sheng*
(Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China)
Abstract: This study is to observe the protection effect of amentoflavone (AMT) in Selaginella tamariscina
against TNF-α-induced vascular inflammation injury of endothelial cells. On the basis of TNF-α induced
human umbilical vein endothelial cell, observe the influence of AMT on endothelial active factor, the contents of
SOD and MDA, the protein expression of vascular endothelial adhesion molecules and inflammatory factor;
study the effect of its common related signal pathways such as NF-κB; research the effect of AMT against TNF-α
induced human umbilical vein endothelial cell injury by means of MTT, ELISA, Western blotting and the cell
immunofluorescence. The results showed that AMT could increase the content of NO and decrease the levels of
VCAM-1, E-selectin, IL-6, IL-8 and ET-1; enhance the activity of SOD, reduce the content of MDA; down-
regulate the protein expressions of VCAM-1, E-selectin, NF-κBp65 and up-regulate IκBα, attenuate the NF-
κBp65 transfer to cell nucleus. AMT has the effect of protect vascular endothelial and maybe via the signal
pathway of NF-κB to down-regulate the inflammation factor and oxidative damage factor of downstream.
Key words: amentoflavone; HUVEC; vascular endothelial injury; vascular endothelial protective effect
卷柏 [Selaginella tamariscina (Beauv.) Spring]
为卷柏科 (Selaginellaceae) 植物卷柏的干燥全草 ,
具有活血通经的功效。现代药理及临床研究表明, 卷
柏提取物具有降血脂[1]、降血糖[2]、抗菌[3]、抗病毒[4]、
抗辐射[5]、抗氧化[6]、植物雌激素[7]等作用。本实验
室前期在采用去势大鼠模型研究卷柏的雌激素样作
用时, 意外发现卷柏有良好的降血糖、降血脂作用 ,
收稿日期: 2013-01-17; 修回日期: 2013-03-27.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (81073034); 国家“重大新药
创制”科技重大专项 (2013ZX09102-022); 国家重点基础
研究发展计划 (973计划) 资助项目 (2013CB531802).
*通讯作者 Tel / Fax: 86-371-65680011, E-mail: fwsh@hactcm.edu.cn
进而对其化学成分进行了系统研究, 从中得到大量
黄酮类、木脂素类、酚酸类等成分[8−10], 通过活性筛
选发现卷柏总黄酮 (total flavonoids of Selaginella
tamariscina, TFST) 是卷柏降血糖、降血脂的有效部
位 [11], 而在 TFST 中穗花杉双黄酮 (amentoflavone,
AMT, 图 1) 为其主要成分[12], 且近年研究发现AMT
在降血脂同时还有抗炎、促进血管新生[13]的作用。鉴
于此 , 本实验以体外 TNF-α (tumor necrosis factor-
alpha) 诱导人脐静脉内皮细胞 (human umbilical
vein endothelial cell, HUVEC) 复制血管内皮细胞损
伤模型, 从细胞增殖、血管内皮细胞功能、炎症、氧
化损伤及对 NF-κB信号通路调节等方面来探讨 AMT
·研究简报·
· 1504· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (9): 1503−1509
对血管内皮的保护作用及其机制。
Figure 1 Chemical structure of amentoflavone (AMT)
材料与方法
实验药物及配制 干燥卷柏全草购自本草国
药堂责任有限公司 , 经河南中医学院药用植物教
研室陈随清教授鉴定为卷柏科植物卷柏 [Selaginella
tamariscina (Beauv.) Spring]。穗花杉双黄酮为本实验
室分离得到, HPLC归一化法测定其纯度为 98.12%。
称取穗花杉双黄酮 1.02 mg, 用适当的溶剂
(DMSO) 溶解, 加入含 5%血清的 RPMI 1640培养基
20 mL, 调至终质量浓度为 50 μg·mL−1, 0.22 μm孔径
滤膜过滤除菌, 4℃冰箱内保存备用。使用时用含 5%
血清的 RPMI 1640培养基稀释至所需浓度。
细胞培养 取人脐静脉内皮细胞株 (HUVEC, 河
南中医学院第一附属医院李强老师赠送, 购自中国典
型培养物保藏中心), 根据相差显微镜下观察细胞呈单
层鹅卵石样排列、免疫细胞化学法染色细胞第 VIII因
子相关抗原呈阳性, 确定培养细胞为内皮细胞。
将细胞培养在含 10%胎牛血清的 RPMI 1640培
养基中 (含青霉素 100 u·mL−1, 链霉素 100 u·mL−1),
置于 37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养, 均取对
数生长期细胞用于实验。
试剂及仪器 肿瘤坏死因子 (Sigma); NO 试剂
盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒 (南京建成生物科技
有限公司); VCAM-1、E-selectin、IL-6、IL-8 ELISA试
剂盒 (R&D); 兔抗人一抗 VCAM-1、E-selectin、IκBα、
NF-κBp65、Lamin B1 (Santa Cruz); 抗β-actin兔单克
隆抗体、山羊抗兔 IgG、HRP (北京康为世纪生物科
技有限公司); ECL显色试剂盒 (北京 Solarbio生物科
技有限公司 ); FITC AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG
(H+L) (美国 EarthOx); DYCZ-24DN 型垂直板电泳
仪、半干转膜电泳槽 (北京六一仪器厂); 半干转膜
仪 (GE); iMarkTM型酶标仪 (BIO-RAD); BioMate 3S
型紫外分光光度仪 (Thermo); G: BOX 凝胶成像仪
(Syngene); 激发光共聚焦显微镜 FV1000 (Olympus)。
MTT 法检测细胞活力 收集对数生长期细胞 ,
按细胞数 1×104/孔接种于 96孔培养板, 每孔含细胞
悬液 200 μL; 置于 37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱
中孵育, 细胞贴壁后弃上清液; 分为 5组: 对照组和
穗花杉双黄酮 (3.72×10−3、7.43×10−3、11.15×10−3及
14.87×10−3 mol·L−1) 组, 每组 6个复孔, 培养一定时
间后, 每孔加入 MTT 20 μL, 继续孵育 4 h, 弃培养
液, 每孔加入 DMSO 150 μL, 于酶标仪 490 nm测定
吸光度 (A) 值。细胞存活率 (%) = (给药组 A值 −对
照组 A值) /对照组 A值 ×100%。
流式细胞术检测细胞周期 细胞培养同“MTT
法检测细胞活力”。收集经药物处理的 HUVEC细胞,
制成细胞数为 1×106的单细胞悬液; PBS洗涤后离心
沉淀细胞, 70%乙醇 4 ℃固定过夜, 800×g离心 5 min
弃上清液, 留下约 50 μL的单细胞悬液; 加入 RNase
溶液 100 μL, 37 ℃水浴孵育 30 min, 然后加入 PBS
800 μL、PI 染色液 50 μL, 避光染色 30 min 后进行
FCS检测。
MTT法检测 TNF-α诱导的 HUVEC细胞增殖实
验 诱导剂 TNF-α配制[14, 15]: 取 10 μg包装的 TNF-α,
用无菌的超纯水 1 mL溶解, 分装 10份 (100 μL/份),
保存于−20℃, 用含 5%血清的 RPMI 1640培养基稀
释至所需浓度。
实验分为 6 组 , 正常组 (control); 模型组
(MC, TNF-α 10 ng·mL−1); AMT-I 组 (AMT 3.72×10−3
mol·L−1 + TNF-α 10 ng·mL−1), AMT-II组 (AMT 7.43×
10−3 mol·L−1 + TNF-α 10 ng·mL−1), AMT-III 组 (AMT
11.15×10−3 mol·L−1 + TNF-α 10 ng·mL−1), AMT-IV 组
(AMT 14.87×10−3 mol·L−1 + TNF-α 10 ng·mL−1); 其中
AMT 组在加入 TNF-α 12 h 后加入 AMT 共同作用
12 h, HUVEC细胞培养及检测方法同“MTT法检测
细胞活力”。
硝酸还原酶法测定 NO的含量 实验分组与给
药同“MTT 法检测 TNF-α诱导的 HUVEC细胞增殖
实验”。收集对数生长期细胞, 按细胞数 1×104接种
于 96孔培养板, 每孔含细胞悬液 200 μL, 置于 37℃、
5% CO2饱和湿度培养箱中孵育; 细胞贴壁后弃上清
液, 给各组加药, 每组 6 个复孔; 作用一定时间后,
分别收集上述经药物处理的细胞上清液 , 3 000×g离
心 20 min, 无菌管收集上清液冻存于−20℃。按照试
剂盒的操作检测 NO的含量。
NO含量 (μmol·L−1)=(测定管吸光度 −空白管吸
光度) / (标准管吸光度 −空白管吸光度)×标准品浓度
(100 μmol·L−1) ×样品测试前稀释倍数
郑晓珂等: 卷柏中穗花杉双黄酮对 TNF-α诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用 · 1505·
ELISA法检测细胞因子浓度 实验分组与加药
培养同“MTT法检测 TNF-α诱导的 HUVEC细胞增
殖实验”。细胞因子 VCAM-1、E-selectin、ET-1、IL-6
及 IL-8的分泌情况均采用 ELISA试剂盒检测。向预
先包被细胞因子抗体的微孔板中加入标准品、待测样
本和辣根过氧化物 (HRP) 酶标记的细胞因子抗体,
经过温和洗涤, 去除未结合的组分, 然后加入底物
A、B显色, 最后加酸终止反应。用酶标仪在 450 nm
波长检测 A值, 通过标准曲线计算样品中细胞因子
浓度。
Western blotting检测蛋白表达 实验分组与加
药培养同“MTT法检测 TNF-α诱导的 HUVEC细胞
增殖实验”。收集各组经药物处理的细胞, 按总蛋白
提取试剂盒说明书操作, 提取总蛋白。得蛋白饼后,
加入适量 2% SDS 水溶液, 95 ℃加热 10 min 溶解蛋
白, 4 ℃过夜, 12 000×g离心 5 min, 吸取上清液。另
外, 收集各组经药物处理的细胞, 按胞浆/核蛋白提
取试剂盒操作, 提取胞核蛋白, 95℃煮 10 min溶解蛋
白, 4℃过夜, 12 000×g离心 5 min后吸取上清液。蛋
白浓度测定按总蛋白测定试剂盒 (BCA法) 说明书操
作, 经 SDS-PAGE电泳分离后电转移至 PVDF膜, 用
5%脱脂奶粉封闭 2 h, 加入一抗 VCAM-1 (1∶400)、
E-selectin (1∶4 00)、IκBα (1∶800)、NF-κBp65 (1∶200)、
β-actin (1∶3 000) 及 Lamin B1 (1∶400), 4 ℃孵育过
夜, 加入二抗山羊抗兔 (1∶2 000), 于 37℃孵育 1 h,
ECL化学发光试剂盒显色, X光片显影, 用 Syngene
G: Box Chemi XR 凝胶分析系统对蛋白条带进行分
析。
激发光共聚焦显微镜检测 NF-κBp65 向胞核中
迁移的情况 将细胞接种于放有盖玻片的 6孔板中,
孵化 24 h, 实验分组与加药培养同“MTT 法检测
TNF-α诱导的 HUVEC 细胞增殖实验”。取出作用
一定时间的盖玻片, 用 PBS洗数次, 用 4%多聚甲醛
4 ℃固定 15 min, PBS 漂洗 3 次 , 然后 0.3% Triton
X-100 4℃透膜 10 min, PBS漂洗。10% BSA湿盒室
温封闭 1 h后, 用一抗孵化 (NF-κBp65, 1∶100), 4℃
湿盒中过夜。PBS漂洗 3次后, 用 FITC标记的二抗
(1∶50) 避光孵化 1 h, PBS避光漂洗, 滴加 PI避光室
温孵育 30 min, PBS避光漂洗 3次。最后, 待爬片晾
干, 用封片剂封片, 使用激发光共聚焦显微镜观察 ,
尽快照相。
SOD活性和MDA含量的检测 HUVEC细胞培
养同“MTT 法检测 TNF-α诱导的 HUVEC细胞增殖
实验”。药物作用一定时间后取上清液, 检测 SOD
活性和 MDA含量 (严格按照试剂盒的说明书进行)。
统计学处理 实验数据以 x ± s表示, 采用单因
素方差分析 (one-way ANOVA) 进行组间差异的比
较。
结果
1 穗花杉双黄酮对 HUVEC细胞活力的影响
前期实验已经筛选出 AMT 对 HUVEC 细胞的
最佳作用时间为12 h, 有效剂量在3.72×10−3～14.87×
10−3 mol·L−1。本研究在最佳时效、量效范围下, 考
察了 AMT促 HUVEC细胞活力作用: 与对照组相比,
AMT 3.72×10−3、7.43×10−3、11.15×10−3及 14.87×10−3
mol·L−1剂量组均可显著升高 HUVEC 细胞存活率
(%), 分别为 (103.36 ± 0.96) %、(117.93 ± 1.02) %、
(131.93 ± 1.31) %和 (128.01 ± 0.78) % (P < 0.05, P <
0.01)。
2 穗花杉双黄酮对 HUVEC细胞周期的影响
为了进一步探讨 AMT 对细胞增殖的作用机制,
对细胞周期的影响进行了检测 (图 2)。与对照组相比,
AMT 3.72×10−3、7.43×10−3、11.15×10−3及 14.87×10−3
mol·L−1剂量组的 HUVEC细胞的 S期百分比均有显
著升高 (P < 0.01, 表 1)。
3 穗花杉双黄酮对 TNF-α诱导的HUVEC细胞活力
的影响
由上述结果可知, AMT 对 HUVEC 细胞有促存
活的作用, 前期实验已确认诱导剂 TNF-α在 24 h、10
ng·mL−1时对 HUVEC细胞损伤效果最佳, 本实验在
Table 1 Effect of AMT on cell cycle of HUVEC. n = 3, x ± s. **P < 0.01 vs control group
Group Dose/mol·L−1
Cell cycle / %
G0/G1 S G2/M
Control − 51.53 ± 0.75 34.80 ± 0.26 14.10 ± 0.26
AMT-I 3.72×10−3 50.60 ± 0.56 38.30 ± 0.20** 11.06 ± 0.81**
AMT-II 7.43×10−3 45.20 ± 0.26** 41.33 ± 0.15** 13.47 ± 0.35
AMT-III 11.15×10−3 45.83 ± 0.31** 43.30 ± 0.20** 10.77 ± 0.40**
AMT-IV 14.87×10−3 46.73 ± 0.47** 38.77 ± 0.31** 14.50 ± 0.26
· 1506· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (9): 1503−1509
Figure 2 Effect of AMT on cell cycle of HUVEC
上述实验结果的基础上, 检测了 AMT对 TNF-α诱导
的 HUVEC细胞活力的影响。与正常组相比, 模型组
的细胞存活率显著降低为 (63.27 ± 0.68)% (P< 0.01);
与模型组相比, AMT 3.72×10−3、7.43×10−3、11.15×10−3
及 14.87×10−3 mol·L−1剂量组均可使细胞存活率有显
著升高, 分别为 (68.21±1.03) %、(79.09±1.12) %、
(87.96±0.79) %和 (80.56±0.85) % (P<0.01)。
4 穗花杉双黄酮对 TNF-α诱导的 HUVEC细胞 NO
和 ET-1的影响
由上述结果可知, AMT 对损伤的 HUVEC 细胞
仍有增殖作用, 故检测其对内皮细胞功能的调节作用。
与正常组相比, 模型组的NO含量显著降低 (P<0.01),
ET-1 蛋白表达显著升高 (P < 0.01); 与模型组相比 ,
AMT可使 NO含量显著升高 (P<0.01), ET-1蛋白表
达显著降低 (P < 0.05, P < 0.01), 见表 2。
5 穗花杉双黄酮对 TNF-α诱导的 HUVEC 细胞
IL-6、IL-8表达的影响
ELISA结果 (表 3) 提示: 与正常组相比, 模型组
的 IL-6和 IL-8表达均显著升高 (P<0.01); 与模型组
相比, AMT可使 IL-6及 IL-8表达显著降低 (P < 0.01)。
6 穗花杉双黄酮对 TNF-α诱导的 HUVEC 细胞
VCAM-1、E-selectin蛋白表达的影响
ELISA 结果 (表 3) 提示: 与正常组相比, 模型
组 VCAM-1 和 E-selectin 蛋白表达均显著升高 (P <
0.01); 与 模 型 组 相 比 , AMT 可 使 VCAM-1 及
E-selectin蛋白表达显著降低 (P < 0.01)。
为了验证上述结果, 采用了Western blotting法检
测 VCAM-1、E-selectin蛋白表达, 蛋白表达条带 (图
3A和 3C) 的凝胶成像定量分析结果显示: 与正常组
相比, 模型组 VCAM-1、E-selectin蛋白表达均显著上
Table 2 Effect of AMT on the content of NO, ET-1, SOD and MDA of HUVEC proliferation induced by TNF-α. n = 3, x ± s. *P <
0.05, **P<0.01 vs control group; ΔP<0.05, ΔΔP<0.01vs MC (model control) group
Group Dose/mol·L−1 NO/μmol·L−1 ET-1/ng·L−1 SOD/U·mL−1 MDA/nmol·mL−1
Control − 815.41 ± 6.17ΔΔ 98.34 ± 4.59ΔΔ 10.620 ± 0.070ΔΔ 2.217 ± 0.080ΔΔ
MC (TNF-α) 10 ng·mL−1 696.51 ± 33.71** 131.60 ± 5.35** 6.487 ± 2.187** 5.953 ± 0.049**
AMT-I 3.72×10−3 770.06 ± 30.83*ΔΔ 121.10 ± 2.83** 7.607 ± 0.482Δ 5.193 ± 0.577**ΔΔ
AMT-II 7.43×10−3 785.47 ± 9.87*ΔΔ 114.75 ± 5.25*Δ 8.698 ± 0.261*Δ 4.477 ± 0.081**ΔΔ
AMT-III 11.15×10−3 800.87 ± 6.17*ΔΔ 107.55 ± 6.60ΔΔ 9.440 ± 0.108*ΔΔ 3.810 ± 0.086**ΔΔ
AMT-IV 14.87×10−3 796.80 ± 3.69*ΔΔ 113.25 ± 6.22*Δ 9.303 ± 0.076*Δ 4.333 ± 0.167**ΔΔ
郑晓珂等: 卷柏中穗花杉双黄酮对 TNF-α诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用 · 1507·
Table 3 Effect of AMT on the expression of IL-6, IL-8, VCAM-1 and E-selectin of HUVEC induced by TNF-α. n = 3, x ± s. *P <
0.05, **P < 0.01vs control group; ΔΔP < 0.01vs MC group
Group Dose/mol·L−1 IL-6/ng·L−1 IL-8/ng·L−1 VCAM-1/μg·mL−1 E-selectin/pg·mL−1
Control − 25.02 ± 0.79ΔΔ 407.44 ± 0.01ΔΔ 0.77 ± 0.06ΔΔ 292.33 ± 7.77ΔΔ
MC (TNF-α) 10 ng·mL−1 31.99 ± 0.18** 598.18 ± 32.55** 20.20 ± 2.12** 967.33 ± 56.54**
AMT-I 3.72×10−3 28.96 ± 0.18**ΔΔ 546.33 ± 8.48**ΔΔ 15.10 ± 0.79**ΔΔ 813.00 ± 11.14**ΔΔ
AMT-II 7.43×10−3 26.35 ± 0.52**ΔΔ 490.78 ± 17.86**ΔΔ 14.54 ± 0.13**ΔΔ 763.00 ± 17.09**ΔΔ
AMT-III 11.15×10−3 24.23 ± 0.30*ΔΔ 477.44 ± 3.15**ΔΔ 13.73 ± 0.29**ΔΔ 559.33 ± 19.09**ΔΔ
AMT-IV 14.87×10−3 28.44 ± 0.63**ΔΔ 542.63 ± 16.97**ΔΔ 11.29 ± 0.91**ΔΔ 747.67 ± 44.77**ΔΔ
Figure 3 Effect of AMT on the expression of VCAM-1 (A, B)
and E-selectin (C, D) of HUVEC induced by TNF-α. n= 3, x ± s.
**P<0.01 vs control group; ΔP<0.05, ΔΔP<0.01 vs MC group
调 (P< 0.01); 与模型组相比, AMT 可使 VCAM-1、
E-selectin 蛋白表达均显著下调 (P < 0.05, P < 0.01),
见图 3B和 3D。
7 穗花杉双黄酮对 TNF-α诱导的 HUVEC细胞 NF-
κB信号通路中 NF-κBp65和 IκBα蛋白表达的影响
Western blotting 法检测 NF-κB 信号通路中
NF-κB的抑制蛋白 IκBα和胞核蛋白NF-κBp65的表达
(图 4A和4C); 凝胶成像结果显示: 与正常组相比, 模
型组 IκBα蛋白表达显著下调, 胞核蛋白NF-κBp65表
达显著上调 (P < 0.01); 与模型组相比, AMT可显著
上调 IκBα蛋白表达, 使胞核蛋白 NF-κBp65表达 显
著下调 (P< 0.05, P<0.01), 见图 4B和 4D。
8 激发光共聚焦显微镜技术 (CLSM) 检测 NF-κB
p65向胞核的迁移情况
FITC 标记的 NF-κBp65 显示绿色荧光 , PI 标记
的细胞核显示红色荧光, 两种荧光细胞图像叠加时
颜色的变化, 可反映 NF-κBp65在细胞核内外的表达
情况。结果如图 5所示, 随着 AMT浓度的增加 (0～
11.15×10−3 mol·L−1), 荧光由黄色到橘色 , 提示 NF-
κBp65从胞浆迁移进入胞核量的由多到少, 即 NF-κB
的活性强度逐渐减弱。结果提示 AMT在一定浓度范
围内 (3.72×10−3～11.15×10−3 mol·L−1) 能抑制 NF-
κBp65向胞核迁移, 并呈剂量依赖关系。
9 穗花杉双黄酮对TNF-α诱导的HUVEC细胞SOD
活性和MDA含量的影响
与正常组相比 , 模型组的 SOD 活性显著降低
(P<0.01); 与模型组相比, AMT 可使 SOD 活性显著
升高 (P<0.01)。与正常组相比, 模型组的 MDA含量
显著升高 (P<0.01); 与模型组相比, AMT可使 MDA
含量显著降低 (P<0.01), 见表 2。
讨论
动脉粥样硬化是一种常见疾病 , 有文献证实血
管内皮损伤是 AS (atherosclerosis) 发生发展的始动
环节[16]。因此保护血管内皮免受各种刺激因子损伤,
是抗 AS的重要环节。本实验室前期在对去势大鼠脂
代谢研究中发现卷柏提取物对腹主动脉内皮具有一
定保护作用[17], 且卷柏提取物中的主要成分是 AMT,
本实验首先采用 MTT法检测 AMT对 HUVEC细胞
活力的作用, 实验结果表明, AMT显著促进 HUVEC
细胞的存活率, 主要是使 S期细胞比例增加。
· 1508· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (9): 1503−1509
Figure 4 Effect of AMT on the expression of IκBα (A, B) and
NF-κBp65 (C, D) of HUVEC induced by TNF-α. n = 3, x ± s.
*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; ΔP < 0.05, ΔΔP < 0.01vs
MC group
本研究进而探讨了 AMT 对 TNF-α诱导损伤的
HUVEC细胞内皮功能的修复作用, 血液中 ET-1/NO
水平的变化能够反映内皮的功能状态, 两者平衡的破
坏是动脉内皮受损的显著特征。AMT可使 TNF-α诱
导损伤的HUVEC细胞的上清液中NO含量升高, ET-1
水平降低。提示AMT可能对血管内皮具有保护作用。
炎症反应产生的细胞因子在AS的形成中起了极
其重要的作用。VCAM-1与 E-selectin在内皮激活状
态下表达增加, 是 AS形成的主要起始阶段的关键因
子, 而 IL-6、IL-8可进一步诱发炎症反应的产生[18], 加
剧 AS的形成。本实验结果显示, AMT可抑制黏附因
子 VCAM-1、E-selectin和炎症因子 IL-6、IL-8的表
达, 提示 AMT可能有保护血管内皮免遭炎症损伤从
而保护血管内皮的作用。
NF-κB是参与炎症反应的重要转录因子[19]。TNF-α
Figure 5 Effect of AMT on NF-κB activation of HUVEC
induced by TNF-α. NF-κBp65 marked by FITC showed green
fluorescence, the cell nucleus marked by PI showed red
fluorescence, two kinds of fluorescence superposition showed
yellow image. Magnification, 40×
可激活 NF-κB, 使其从 IκBα三聚体解离为 NF-κB
(p50/p65), 随后 p50/p65从胞浆迁移入胞核中, 与胞核
中的特异性增强子元件结合介导下游多种生物活性
物质的表达, 导致 AS 的发生。实验结果显示 AMT
可上调 NF-κB活化的抑制蛋白 IκBα的表达, 下调其
转录因子 NF-κBp65在核中表达, 提示 AMT可以抑
制 NF-κB信号通路的激活。同时通过 CLSM技术, 采
用双重荧光标记法更直观地观察到了 AMT对 TNF-α
诱导的 HUVEC细胞 NF-κB亚基 p65 从胞浆向胞核
中迁移的抑制作用, 该结果与 Western blotting 的检
测结果相一致, 提示 AMT保护血管内皮免遭炎症损
伤可能是通过抑制 NF-κB信号通路的激活来发挥作
用的。
近年来大量的流行病学研究表明 , AS 的某些病
理过程和环节与脂质过氧化损伤有关[20]。本实验室前
期在研究对 2型糖尿病大鼠的治疗作用中发现 TFST
具有抗氧化作用[21], 而AMT是 TFST中的主要成分。
本实验结果表明, AMT可显著抑制MDA的生成和升
高 SOD的活性。
郑晓珂等: 卷柏中穗花杉双黄酮对 TNF-α诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用 · 1509·
本研究从细胞增殖、血管内皮细胞功能、抗炎、
抗氧化损伤及对 NF-κB 信号通路等方面 , 探讨了
AMT对血管内皮细胞的保护作用及机制。目前国内
外已开发的抗 AS类药物, 许多在临床治疗中对肝脏
存在一定的毒副作用, 而前期研究结果表明 TFST具
有保肝的作用[22], 因而 AMT为抗 AS性疾病的可能
性提供了研究基础。
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