全 文 ：· 1402 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2010, 45 (11): 1402−1409



快速分离与鉴定天山堇菜中的天然环肽
项 斌 1, 2, 杜国华 1, 王煦辰 1, 张书香 1, 秦咸蕴 1, 孔建强 1,
程克棣 1, 李永吉 2, 王 伟 1*
(1. 中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所 (卫生部天然药物生物合成重点实验室、中草药物质基础与
资源利用教育部重点实验室), 北京 100050; 2. 黑龙江中医药大学中医药研究院, 黑龙江 哈尔滨 150040)
摘要: 为快速准确地分离鉴定天山堇菜的天然环肽分子, 采用 50% 乙醇浸提、不同极性溶剂萃取, 利用
Sephadex LH-20 对含有环肽的正丁醇部分进行色谱分离, 然后直接利用 DTT 还原分离的组分, 结合反相高效
液相色谱 (RP-HPLC) 和质谱跟踪确定含有环肽的组分差异洗脱峰, 进而分离纯化获得单体分子; 利用 DTT 还
原二硫键、碘乙酰胺烷基化保护被还原产生的巯基、蛋白酶 Endo-Glu-C、Endo-Lys-C 和胰蛋白酶酶解、结合
RP-HPLC 分离获得肽段; 用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI TOF/TOF MS) 进行质谱分析, 鉴定
了 2 个环肽分子, 其中一个新的环肽分子命名为 cycloviolacin T1, 另一个为已知结构的 varv E。通过此研究建立
了一套直接利用 DTT 还原色谱分离组分、结合 MALDI TOF/TOF MS 检测进而鉴定天然环肽分子的解析方法。
关键词: 天山堇菜; 植物环肽; MALDI TOF/TOF 质谱鉴定
中图分类号: R284.1 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2010) 11-1402-08
Elucidating the structure of two cyclotides of Viola tianshanica
Maxim by MALDI TOF/TOF MS analysis
XIANG Bin1, 2, DU Guo-hua1, WANG Xu-chen1, ZHANG Shu-xiang1, QIN Xian-yun1,
KONG Jian-qiang1, CHENG Ke-di1, LI Yong-ji2, WANG Wei1*
(1. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Key Laboratory of
Biosynthesis of Natural Products, Ministry of Health of PRC & Key Laboratory of Bioactive Substances and
Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education of PRC, Beijing 100050, China;
2. Institute of Chinese Medicine, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

Abstract: The cyclotides are a family of cyclic “mini” proteins that occur in Violaceae, Rubiaceae and
Cucurbitaceae plant families and contain a head-to-tail cyclic backbone and a cystine knot arranged by three
disulfide bonds. To study the natural cyclotides of V. tianshanica, dried herb was extracted with 50% ethanol,
and the concentrated aqueous extract was subjected to a solvent-solvent partitioning between water and hexane,
ethyl acetate and n-butanol, separately. The n-butanol extract containing cyclotides was subjected to column
chromatography over Sephadex LH-20, eluted with 30% methanol. The subfractions were directly reduced by
DTT and analyzed by reverse-phase HPLC. The peaks with different retention times were shown on the profile
of RP-HPLC and collected. The cyclotides were speculated based on masses range from 3 000 to 3 500 Da.
The purified cyclotides were reduced with DTT, alkylated with iodoacetamide, and then were cleaved with
endoproteinase Glu-C, endoproteinase Lys-C and Trypsin, separately. The digested peptides were purified on
RP-HPLC and analyzed on MALDI TOF/TOF analyzer. A new cyclotide, cycloviolacin T1 and a reported

收稿日期: 2010-06-17.
基金项目: 国家科技重大专项综合平台子课题“天然产物化学”平台 (2009ZX09301-003-4-1); 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资助
(2007ZD06).
*通讯作者 Tel: 86-10-63165196, Fax: 86-10-63017757, E-mail: wwang@imm.ac.cn
项 斌等: 快速分离与鉴定天山堇菜中的天然环肽 · 1403 ·

cyclotide varv E were systemically determined using MALDI TOF/TOF system. So the method for the isolation
and characterization of cyclotides was quickly built up in succession.
Key words: Viola tianshannica; cyclotides; MALDI TOF/TOF MS analysis

植物环肽 (cyclotides) 是 20 世纪 90 年代中期出
现的一个新兴研究领域, 是指由 28～37 个氨基酸残
基组成, 属于“蛋白质”类型的化合物; 其序列由
DNA 编码, 为基因转录表达的产物, 具有独特的三
维结构 [1]。目前已从堇菜科 (Violaceae)、葫芦科
(Cucurbitaceae) 和茜草科 (Rubiaceae) 植物中报道
了 100 余个环肽分子[2]。
植物环肽有着典型而特殊的结构。其分子包括
6 个保守的半胱氨酸残基, 它们之间形成 3 个分子内
二硫键 , 构成了一个结构独特的环状半胱氨酸结
(cyclic cystine knot, CCK), CCK 与环状主链共同决定
了环肽分子的刚性结构, 使得环肽分子非常稳定, 可
以抗蛋白酶水解和热变性, 并造就了环肽独特的立
体结构及多样的生物活性。图 1 是第一个报道的植物
环肽 Kalata B1 的结构。环肽分子内的 6 个半胱氨酸
Ⅰ～Ⅳ、Ⅱ～Ⅴ、Ⅲ～Ⅵ形成二硫键, 且不在同一平
面上, 其中Ⅲ～Ⅵ键穿过Ⅰ～Ⅳ键、Ⅱ～Ⅴ键与环状
骨架形成的环, 将整个分子分成 6 个环, 其中环 1 与
环 4形成内嵌环部分, 在氨基酸组成和数量上最为保
守, 环 2、环 3、环 5、环 6 暴露在分子外部, 连接在
结的外侧[3]。


Figure 1 The sequence and structure of cyclotide Kalata B1,
a cystine knotted arrangement for the I − IV, II − V, III − VI
conectivity[3]

植物环肽的提取分离方法一般采用二氯甲烷-甲
醇 (1∶1) 或甲醇提取后再用正丁醇萃取, 最后再用
色谱方法分离, 常用 Sephadex LH-20、RP-HPLC 等。
由于环肽结构对酸和酶的特殊稳定性, 其结构研究
常采用还原或烷基化后进行酶解或部分酸水解后再
进行序列测定的方法[4]。
植物环肽具有多样的生物活性, 包括促进孕妇
子宫收缩加速分娩[5]、抗 HIV 病毒[6]、抗菌[7]、抗虫[8]、
溶血毒性[9]、血管紧张素抑制活性[10]、抗肿瘤活性[11]
等, 其活性可能与保守的 CCK 结构和其他环的氨基
酸构成多样有关。由于其特殊的稳定性, 此类环肽可
作为肽类药物的模板用于多肽药物的合成研究[12, 13]。
天山堇菜 (Viola tianshanica Maxim.) 干燥全草
药用, 味微苦, 辛, 性凉, 具有祛风清热、解毒消肿的
功效, 天山堇菜不同溶剂提取物对金葡菌等有一定
程度的抑制作用, 其抗菌和抗病毒作用的药效成分
可能与植物中所含的环肽分子存在着直接联系[14]。
本研究选取天山堇菜为实验材料进行天然环肽分子
的分离鉴定研究。

材料与方法
实验试剂 甲醇、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇等
为分析纯试剂, 色谱级乙腈购自 Fisher 公司, DTT、
NH4HCO3、碘乙酰胺购自 Sigma 公司, 测序级纯度的
蛋白酶 (endoproteinase) Glu-C、Lys-C 和胰蛋白酶购
自 Roche 公司。
样品的提取 天山堇菜干燥药材 4.0 kg, 经粉碎
后, 用50%乙醇浸提3次, 每次12 h, 合并提取液, 减
压浓缩回收乙醇; 提取物用水混悬, 依次用正己烷、
乙酸乙酯、正丁醇萃取; 含有环肽的正丁醇部分减压
浓缩后再用水重悬, 样品经 Sephadex LH-20 柱色谱
分离, 采用 30%甲醇洗脱。
目标环肽分子的确定 利用质谱跟踪经
Sephadex LH-20 柱色谱确定含有环肽的流分。取每
个洗脱组分等量的样品 2 份, 其中一份用 DTT 在
37 ℃还原处理 2 h, 利用 Agilent 1200 系统和 GRACE
VYDAC 蛋白多肽半制备 C18 柱 (250 mm × 10 mm,
5 μm, 300 Å) 对两份样品分别进行洗脱分析, 色谱
条件: 流动相 A: 0.5% 的三氟乙酸 (TFA) - 水溶液;
流动相 B: 90% 的乙腈-水溶液; 紫外检测: 220 nm;
进样量: 每次 100 μL; 流速: 2 mL·min−1; 梯度洗脱
(表 1)。确认与对照样品相比的差异峰, 收集各差异
峰流分做质谱检验, 初步确认环肽分子。
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Table 1 Gradient elution program
Solvent /%
Time /min
H2O (0.05% TFA, v/v) CH3CN∶H2O (9∶1)
0.01 98 2
5 85 15
63 55 45
65 0 100
75 0 100
77 98 2

环肽的分离与纯化 经 Sephadex LH-20 分离且
确定含有环肽的组分继续采用 Agilent 1200 系统和
GRACE VYDAC 蛋白多肽半制备 C18 柱进行梯度洗
脱。色谱条件同上, 进样量为每次 400 μL。收集已
确定的差异峰, 减压浓缩, 再用 Agilent 1200 系统和
GRACE VYDAC 蛋白多肽分析型 C18 柱 (250 mm ×
4.6 mm, 5 µm, 30 nm) 进行梯度洗脱; 紫外检测: 220
nm; 进样量: 每次100 μL; 流速: 1 mL·min−1; 梯度洗
脱 (表 2); 利用MALDI TOF/TOF MS进行检测分析。
减压浓缩含有环肽的流分, 冷藏保存。

Table 2 Gradient elution program
Solvent /%
Time /min
H2O (0.05% TFA, v/v) CH3CN∶H2O (9∶1)
0.01 98 2
50 65 35
52 0 100
62 0 100
64 98 2

环肽分子的还原与烷基化保护 参照文献[15]
进行环肽分子的还原与烷基化保护反应。取 50 μg 的
环肽样品溶于 100 mmol·L−1碳酸氢铵缓冲液 (pH 8.0)
100 μL 中, 加入等体积含有摩尔比 30 倍过量 DTT
(约 0.46 mg) 的碳酸氢铵缓冲液后于 37 ℃反应 2 h;
再加入等体积含有还原巯基摩尔比 2.5倍过量的碘乙
酰胺 (约 1.38 mg)碳酸氢铵缓冲液, 室温下避光反应
12 h。还原和烷基化后的样品直接注入 RP-HPLC C18
分析柱, 进行梯度洗脱 (表 2), 收集样品峰, 取 0.5
μL 样品点样于 MALDI 样品板上, 再与等体积的 α-
氰基 -4-羟基肉桂酸 (CHCA) 混匀 , 进行 MALDI
TOF/TOF MS 质谱分析。
蛋白酶 Glu-C、Lys-C 和胰蛋白酶的酶解 将还
原和烷基化的环肽样品通过 RP-HPLC 系统 C18 分析
柱, 进行梯度洗脱纯化, 冷干。将环肽分子溶解在
100 mmol·L−1 碳酸氢铵缓冲液 (pH 8.0) 100 μL 中,
加入 1 μL蛋白酶Glu-C (1 μg·µL−1), 室温下酶解 12 h;
或将环肽分子溶解在 100 mmol·L−1 Tris-HCl (pH 7.5)
100 μL 中, 加入蛋白酶 Lys-C 或胰蛋白酶, 37 ℃下酶
解 12 h。将酶解后的样品直接注入 RP-HPLC C18 分
析柱, 进行梯度洗脱 (表 2) 纯化, 纯化的样品利用
MALDI TOF/TOF MS 进行质谱分析。
MALDI TOF/TOF MS 分析 为了鉴定酶解的
肽段氨基酸残基序列, 利用 ABI 4800 plus MALDI
TOF/TOFTM 系统, 采用正离子模式进行, 利用 50% 乙
腈/0.1% TFA 配置 8 mg·mL−1 CHCA 作为 MALDI 介
质, 质谱仪的扫描范围 m/z 500～4 000, 用于测定每
个样品中肽段的质荷比。首先采用反射手动模式测定
分子离子质荷比, 其激光强度设置在肽段分子离子
化的阈值强度 , 一级质谱激光总照射 (laser shots)
为 800 次; 为了对肽段进行 MS 测序, 激光强度升高
约 10%, 加速电压设置为 1 kV, 激光总照射为 2 000
次, 每个肽段的撞击诱导解离 (CID) 的质谱结果都
按单电荷的反射模式记录, 撞击室内气压分别设置
为 (无、中、高) 3 种工作状态, 若撞击室内没有气压
时系统运行采用源后衰变 (PSD) 模式; 其中母离子
与二级质谱的 mass error 范围分别为 m/z ±0.05 和 m/z
±0.02。肽段氨基酸残基序列的解析利用 ABI 公司
DataExplore v3.5系统, 采用质谱图上 y离子或 b离子
手动解析, 根据相邻离子的分子量差求出氨基酸残
基的分子量, 得到多肽的氨基酸残基序列。

结果
1 目标环肽分子的确定
利用质谱跟踪经 Sephadex LH-20 柱色谱纯化
后含有分子质量在 3 000 Da 左右化合物的环肽组分。
对经 DTT 处理的样品与同体积原始样品进行半制备
C18柱洗脱分析, 两者相比较获得差异峰 (图 2)。图 中
2 是经 DTT 处理后的样品, 在原始样品 1 中保留时间
为 42～48 min 的 3 个洗脱峰对应的分子经 DTT 还原
处理后保留时间明显地缩短。进而用质谱进行确认,
峰 T1、T2的 m/z分别为 2 877.043 0和 2 890.907 5; 而
经过 DTT 还原处理后环肽的 m/z 增加 6 Da, 如峰 T1
经过 DTT 还原处理后其对应的 m/z 为 2 883.064 2 (图
3), 说明该分子内可能含有 3 个二硫键被还原, 初步
确定这些分子为环肽分子。
2 环肽分子的还原与烷基化保护
直接利用 RP-HPLC 分离纯化含有环肽分子的
差异峰 T1、T2; 然后用 DTT 进行还原, 环肽分子的
项 斌等: 快速分离与鉴定天山堇菜中的天然环肽 · 1405 ·


Figure 2 The HPLC analysis of the fractions eluted from
Sephadex LH-20 column. 1: The directly eluted fraction; 2: The
fraction reduced with DTT


Figure 3 The analysis of the original and reduced samples
corresponding to peak T1 in Figure 2. The reduced sample with
an increment of 6 Da of molecular mass

3 个二硫键还原后形成 6 个巯基, m/z 增加 6 Da; 再
用碘乙酰胺烷基化保护, m/z 增加 342 Da (6 × 57 Da),
即环肽分子经还原与烷基化后 m/z增加 348 Da; 上述
差异峰 T1、T2 所对应的环肽分子经还原与烷基化后
m/z 分别为 3 225.297 5 和 3 239.114 5。
3 环肽的酶解和纯化
还原和烷基化处理后的样品进行不同的蛋白酶
处理, 图 4 是差异峰 T2 所对应的环肽分子经还原与
烷基化后不同蛋白酶水解的色谱分析。图中 1 为还原
和烷基化的环肽分子, 2 为蛋白酶 Lys-C 酶解的样品,
其色谱峰与 1相似, 没有被蛋白酶 Lys-C酶解, 3为胰
蛋白酶处理的样品, 还原和烷基化的环肽分子被线
性化, 4 为胰蛋白酶和蛋白酶 Glu-C 酶解的样品, 其
中蛋白酶 Glu-C 能特异地切割谷氨酸羧基端的肽键,
还原和烷基化的线性环肽分子被切割成 2个肽段, 其
中一个较小的肽段保留时间为 13 min 左右。在用胰
蛋白酶或蛋白酶 Glu-C处理后, 分子中一个肽键被水
解, 得到的线性多肽分子中增加一个 H2O, 其 m/z 为
3 257.699 7。


Figure 4 The RP-HPLC analysis of the reduced and alkylated
cyclotides cleaved with endoprotease Lys-C, Glu-C and trypsin,
respectively. 1: The cyclically reduced and alkylated cyclotide;
2: The cyclic peptide cleaved with Lys-C; 3: The cyclic peptide
cleaved with Trypsin; 4: The cyclic peptide cleaved with trypsin
and Endo Glu-C

综上分析, 还原和烷基化的环肽分子经不同蛋
白酶酶解后在 RP-HPLC 色谱图上产生的差异说明该
分子内只含有 1 个 Glu 和 Arg, 而不含有 Lys。
4 环肽氨基酸残基序列的解析
上述分离获得的 2 个环肽分子经还原与烷基化
后再用蛋白酶 Glu-C 和胰蛋白酶酶解, 各自产生 2 个
肽段。还原与烷基化的峰 T1 所对应的环肽分子产生
m/z 846 和 m/z 2 417 的 2 个肽段; 而还原与烷基化的
峰 T2 所对应的环肽分子产生 m/z 861 和 m/z 2 417 的
2 个肽段。其中 m/z 2 417 的肽段为 2 个环肽分子共
有, 通过计算质谱上相邻 y 离子的分子量差, 解析出
此肽段的氨基酸残基序列为 : TC*VGGTC*NTPGC*
SC*SWPVC*TR (C*表示烷基化的半胱氨酸残基), 其
质谱解析如图 5。
峰 T1 中 m/z 846 的肽段, 分别计算质谱中 y 离子
以及 b离子相邻离子的分子量差, 根据氨基酸残基的
分子量数, 并结合已报道环肽分子的同源性分析, 解
析出此肽段的氨基酸残基序列为: NGIPVC*GE (C*表
示烷基化的半胱氨酸残基); 其中 y6 所对应的氨基酸
残基 Ile 在撞击诱导解离 (CID) 模式下导致
Cβ-CH2CH3 键断裂产生 w6a 离子 m/z 629.873 4, 其质
谱解析如图 6。
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Figure 5 MS/MS fragmentation of peptide (m/z 2 417) recorded by MALDI TOF/TOF MS analyzer


Figure 6 MS-MS identification for peptide (m/z 846) from peak T1. A: MALDI TOF/TOF tandem mass spectra with CID off; B: The
CID spectrum
项 斌等: 快速分离与鉴定天山堇菜中的天然环肽 · 1407 ·


峰 T2 中 m/z 861 的肽段, 分别计算质谱中 y 离
子以及 b 离子相邻离子的分子量差, 根据氨基酸残基
的分子量数, 并结合已报道环肽分子的同源性分析,
解析出此肽段的氨基酸残基序列为: NGLPIC*GE (C*
表示烷基化的半胱氨酸残基); 其中 y6 所对应的氨基
酸残基 Leu 在撞击诱导解离 (CID) 模式下导致
Cβ-CH(CH3)2键断裂产生w6离子m/z 628.323 0, 其质
谱解析如图 7。
综合 3 个肽段氨基酸残基序列, 峰 T1 环肽分子
的氨基酸残基序列为: cyclo-(GIPVCGETCVGGTCN
TPGCSCSWPVCTRN), 利用PeptideMass软件 (http://
www.expasy.ch/tools/peptide-mass.html) 计算其理论
分子量 2 878.32 Da, 此环肽分子命名为 cycloviolacin
T1; 峰 T2 环肽分子的氨基酸残基序列为: cyclo-(GLP
ICGETCVGGTCNTPGCSCSWPVCTRN), 理论分子
量 2 892.34 Da, 此分子为已报道的环肽分子 varv E。
讨论
天然环肽分子多富集在正丁醇部分, 直接利用
DTT 还原经 Sephadex LH-20 柱色谱分离的组分, 即
DTT 还原可以打开环肽分子特殊的 CCK 结构, 它是
一个由 3 个二硫键共同形成的环状半胱氨酸结构; 在
DTT的作用下, 二硫键被还原为巯基, 分子极性增大,
经 RP-HPLC 洗脱时保留时间缩短。同时其他蛋白、
多糖类物质也有可能被 DTT 还原, 故收集差异洗脱
峰, 再利用质谱做进一步鉴定获得分子量在 3 000 Da
左右的分子, 可快速准确地确定样品是否含有环肽
分子。
环肽分子经 DTT 还原后分子内增加 6 个氢原子,
用质谱分别检验原始样品与还原后样品的差异峰 ,
如在还原后样品中找到与原始样品差异峰中分子的
分子量增加 6 Da 的分子, 则可初步判断此原始样品
差异峰含有环肽分子。


Figure 7 MS-MS spectrum of peptide (m/z 861) from peak T2. A: MALDI TOF/TOF tandem mass spectra with CID off; B: The CID
spectrum
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在图 4 中色谱分离经 DTT 还原与烷基化保护后
的环肽分子存在两个洗脱峰, 说明还原和烷基化后
的环状多肽分子可能存在两种不同的构象。
经蛋白酶 Lys-C处理后的样品, 其色谱图与酶解
前的样品峰形一致, 说明 Lys-C没有使环肽分子结构
发生变化。因为 Lys-C 可选择性水解多肽中赖氨酸残
基羧基端的肽键, 故环肽分子中不含赖氨酸残基。
经胰蛋白酶处理后的样品, 其洗脱保留时间比
酶解前缩短, 且只有一个洗脱峰, 说明环肽分子的环
状结构被切开, 为一个线状分子。胰蛋白酶可选择性
地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸残基羧基端的肽
键, 鉴于已验证分子中不存在赖氨酸, 故分析环肽分
子中仅含一个精氨酸残基。
经胰蛋白酶和蛋白酶 Glu-C酶解的样品, 色谱图
中洗脱峰保留时间较仅用胰蛋白酶酶解的样品相比
明显缩短, 说明环肽分子由一个完整链状结构被剪
切为 2 段肽段。收集各洗脱峰进行质谱鉴定, 分析每
个肽段的氨基酸排列, 最终确定环肽结构。
质谱测序一般采用 MALDI 或电喷雾离子化
(ESI) 技术结合飞行时间质谱仪、四极杆和离子阱
等。其中 MALDI-TOF/TOF MS 具有很高的灵敏度、
高通量、样品靶点可多次应用测定、主要产生单电荷
准分子离子以及能够耐受一定量的盐和干扰物等特
点, 结合源后衰变技术对多肽进行分析测定。在检测
m/z 2 417 的肽段中氨基酸残基序列时, 谱图中丰富
的 y 离子可以通过简单的相减得到离子间的分子量
差, 再对比各氨基酸残基分子量得到此肽段的氨基
酸残基序列, 如 Thr: y2 (276 Da)-y1 (175 Da) = 101。
其中也有少数特殊碎片离子分子量差与相应的氨基
酸残基不完全对应以及分子量完全相同的 Leu/Ile、
Gln/Lys 的鉴定等问题, 因此在质谱解析中应注意以
下几种情况:
脯氨酸具有环状的特殊结构, 它与另外氨基酸
中羧基形成的肽键 Xxx-Pro 较一般肽键稳定, 不易形
成碎片, 容易产生一个“gap”[16−18]。此类结构在质
谱图中离子峰值往往较高, 所以在质谱解析过程中,
如遇到碎片离子峰值较高, 可用相邻离子分子量差
减去 Pro 残基的分子量 (97 Da) 后再确定氨基酸残
基。例如m/z 2 417的肽段谱图中 y5与 y3相差 196 Da,
经查找后没有与之对应的氨基酸残基, 此时发现在
谱图中 y5 峰值较一般峰值高, 符合 Xxx-Pro 的质谱
特征, 于是用 196 Da 减去 97 Da 得 99 Da, 说明另一
个氨基酸残基是 Val 残基。
环肽分子中存在 3 个由半胱氨酸残基构成的二硫
键, 当环肽被 DTT 还原后, 3 个二硫键被还原形成
6 个巯基, 用碘乙酰胺通过烷基化反应不可逆地修饰
巯基并起到保护作用, 烷基化后的每个半胱氨酸残
基的分子量增加 57 Da。由于半胱氨酸残基原始分
子量为 103 Da, 再经还原与烷基化保护后 R 基减 少
了 -H, 增加了 -CH2CONH2, 氨基酸残基分子量变为
160 Da, 故在质谱检验中, 当相邻离子的分子量相差
为 160 Da 时, 即可认定为 Cys 残基。
质谱图中在 y-离子峰之前往往会伴随出现一分
子量相差 17 Da 的离子峰, 且峰值往往较高, 如 m/z
2 417 的肽段中 y14 峰, 此离子峰已鉴定为天冬酰胺
残基 (y14 − y13 = 114), 在 y13 与 y14 之间可见一个
m/z 1 664的碎片离子峰, 此离子峰与 y13相近且峰值
略高于 y14, 分子量差为 1 681 – 1 664 = 17 Da。在质
谱分析中碎片离子常会出现丢失一个中性氨的现象,
天冬氨酸丢失中性氨后的离子峰高于自身的 y-离子
峰, 这是天冬酰胺所特有的性质, 可作为此氨基酸的
特征峰; 利用此特性, 当质谱中出现两个相近峰, 分
子量相差 17 Da 且 m/z 小的峰值较高时, 即可判定为
天冬酰胺[19]。此外, 结合丢失中性氨 (NH3) 的特征
离子峰和蛋白酶 Lys-C 的特异性酶解分析, 很容易确
定分子量相同的氨基酸残基 Gln 和 Lys[19]。
在蛋白质谱的解析过程中最难区分的 2 个分子
量相同的氨基酸残基是 Leu 和 Ile, 研究采用撞击诱
导解离 (CID) 模式下高能诱导-Cβ-Cγ-R 侧链断裂产
生的特征 w 离子进行鉴别, 通常 Leu 会产生丢失异
丙基的特征碎片离子, 而 Ile 则产生 2 个分别丢失甲
基和乙基的 2 个碎片离子[20−22]。如图 6 中只显示了
丢失甲基的 w6a 碎片离子, 而理论上产生的 w6b 与
碎片离子 b6 的质荷比相同难以区分。在 m/z 861 肽
段的 CID 图谱也只产生了 w6 的碎片离子, 而理论上
y4 离子应该产生 2 个相应的 w4 碎片离子, 但由于脯
氨酸残基的作用没有相应的信号碎片离子, 如何对
此氨基酸残基进行详细解析, 还有待更深入的研究。
总之, 通过对这 2 个环肽分子的分离鉴定, 建立了利
用 DTT 直接还原柱色谱分离的组分, 结合 MALDI
TOF/TOF MS 质谱分析快速分离天然环肽的技术方
法。
References
[1] Craik DJ, Daly NL, Bond T, et al. Plant cyclotides: a unique
family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic
项 斌等: 快速分离与鉴定天山堇菜中的天然环肽 · 1409 ·

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