全 文 :书收稿日期:2014-09-04
基金项目:辽宁省药品检验检测院资助项目(2013年)
作者简介:郭晓璐(1989-),女(满族),辽宁抚顺人,硕士研究生,E-mail guoxiaolu0111@163.com;*通讯作者:袁丹
(1963-),女(汉族),辽宁丹东人,教授,博士,主要从事传统药物质量标准化分析技术和体内药物动力学研究,Tel.
024-23986502,E-mail yuandan_kampo@163.com。
文章编号:1006-2858(2015)08-0618-05 DOI:10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2015.08.007
刺五加果TLC鉴别及原儿茶酸、
绿原酸、金丝桃苷的含量测定
郭晓璐,师子明,齐 文,张国哲,袁 丹*
(沈阳药科大学 中药学院,辽宁 沈阳110016)
摘要:目的 建立刺五加果的TLC定性鉴别法和原儿茶酸、绿原酸、金丝桃苷的 HPLC色谱含量测
定法。方法 以金丝桃苷为对照品,采用氯仿-甲醇-水-冰醋酸(体积比为65∶35∶4∶1)为展开剂,在
UV 254nm下检视,对刺五加果进行薄层色谱法定性鉴别。采用 Hypersil ODS2 柱(150mm×
4.6mm,5μm),冰醋酸-水(体积比为1∶99)和甲醇-乙腈(体积比为1∶1)为流动相,在254nm检测
波长下,以 HPLC法测定刺五加果中原儿茶酸、绿原酸、金丝桃苷的含量。结果 刺五加果薄层色
谱中,金丝桃苷斑点清晰、分离度好。HPLC定量分析中,原儿茶酸、绿原酸、金丝桃苷线性范围分
别为2.0~50.0mg·L-1(r=0.999 8)、8.0~200mg·L-1(r=0.999 6)、2.0~50.0mg·L-1(r=
0.999 5),平均回收率分别为99.4%(RSD=2.7%)、100.9%(RSD=1.8%)和98.1%(RSD=
2.4%)。结论 该方法可用于刺五加果的质量控制。
关键词:刺五加果;金丝桃苷;绿原酸;原儿茶酸;高效液相色谱法;薄层色谱法
中图分类号:R 28 文献标志码:A
刺五加果为五加科植物刺五加 Acantho-
panax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的干
燥成熟果实。历代本草未见有关刺五加果的记
载,但其在民间作为镇定安神药被广泛应用[1]。
刺五加果主要含有机酸类[2]、黄酮类[3]、皂苷
类[4]、萜类[5]、苯丙素类[2]等成分。其中金丝桃苷
具有镇痛[6]、增强免疫力[7]等作用,绿原酸具有抗
菌、抗疲劳[8]等作用,原儿茶酸具有降低心肌耗氧
量、缓解心绞痛[9]作用等。目前市场已有刺五加
果实颗粒剂、口服液等保健食品开发上市。关于
刺五加果的质量评价方法研究,已有的定量分析
方法有:HPLC法测定其中异嗪皮啶[10]、金丝桃
苷[11]、槲皮素鼠李糖苷[12]或齐墩果酸和熊果
酸[13]等单一或两个指标成分的含量,以及三波
长-分光光度法测定其中总黄酮的含量[3]等,TLC
鉴别方法尚未见文献报道。为此,本文作者研究
了刺五加果的TLC定性鉴别法,以及高效液相色
谱同时测定刺五加果中原儿茶酸、绿原酸、金丝桃
苷(结构式见图1)等3种活性成分的含量测定
法,为刺五加果的质量标准化研究提供科学依据。
Fig.1 Structures of protocatechuic acid(1),chlorogenic acid(2)and hyperin(3)
图1 原儿茶酸(1)、绿原酸(2)和金丝桃苷(3)的结构式
第32卷 第8期
2 0 1 5年8月
沈 阳 药 科 大 学 学 报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol.32 No.8
Aug.2015 p.618
1 仪器与材料
Shimadzu LC-2010AHT 高效液相色 谱 仪、
CLASS-VP色谱工作站(日本Shimadzu公司),
AG-245电子天平(瑞士 Mettle-Toledo公司),
KQ-200KDB超声波清洗器(昆山市超声仪器有
限公司),硅胶GF254薄层板(青岛海洋化工厂)。
原儿茶酸、绿原酸、金丝桃苷对照品(中国药
品生 物 制 品 检 定 所,批 号 分 别 为 110809-
200604、110753-200212、1521-200202),甲醇、
乙腈(色谱纯,山东禹王实业有限公司禹城化工
厂),水为重蒸水,其他试剂均为市售分析纯。
11批刺五加果药材采集于辽宁、吉林和黑龙
江等地,或购于三地的药材市场,由沈阳药科大学
袁丹教授鉴定为刺五加Acanthopanax senticosus
(Rupr.et Maxim.)Harms的果实。
2 方法与结果
2.1 薄层色谱鉴别
取刺五加果干燥品粉末1g,加甲醇20mL,
超声(功率100W,频率40kHz)提取20min,滤
过,滤液蒸干,残渣加水20mL使溶解,用石油醚
(60~90℃)振摇萃取2次,每次20mL,弃去石
油醚层,再用乙酸乙酯振摇萃取 2 次,每次
20mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇
0.4mL使溶解,作为供试品溶液。另取金丝桃苷
对照品,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,作
为对照品溶液。照薄层色谱法(《中华人民共和国
药典》2010年版附录ⅥB)试验,吸取上述两种溶
液各5.0、2.5μL,分别点于同一硅胶 GF254薄层
板上,以氯仿-甲醇-水-冰醋酸 (体积比为65∶
35∶4∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯
(254nm)检视。供试品色谱中,在与对照品色谱
相应的位置上,显相同颜色的斑点,结果见图2。
1—Hyperin;2—12—A.senticosus fruits
Fig.2 TLC chromatogram of hyperin in A.senticosusfruits
图2 刺五加果中金丝桃苷的薄层色谱图
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件
色 谱 柱:Hypersil ODS2 柱 (150 mm ×
4.6mm,5μm);流动相:A相为体积分数为1%
的冰醋酸水溶液,B相为体积分数为50%的甲醇
乙腈溶液,线性梯度洗脱,洗脱程序为0~13min:
2% ~15% B,13~35 min:15% ~26% B,
35~40min:26%~50%B,40~45min:50%~
2%B,45~50min:2%~2%B;流速:1.0mL·min-1;
柱温:40℃;检测波长:254nm;进样体积:10μL。
2.2.2 对照品溶液制备
取经五氧化二磷减压干燥24h的原儿茶酸、
绿原酸、金丝桃苷对照品适量,精密称定,加甲醇
溶解并定容,摇匀,制成每1mL 含原儿茶酸
50μg、绿原酸200μg、金丝桃苷50μg的混合溶
液,作为对照品储备液。
2.2.3 供试品溶液制备
取各刺五加果干燥品粉末约0.2g,精密称
定,置具塞锥形瓶中,精密加入体积分数为50%
的甲醇溶液10mL,密塞,称定重量,超声处理
30min,放冷,用体积分数为50%甲醇溶液补足
减失的重量,摇匀。取上清液用0.45μm微孔滤
膜滤过,取续滤液,作为供试品溶液。
2.2.4 色谱系统适用性试验
在上述色谱条件下,理论塔板数以原儿茶酸、
绿原酸、金丝桃苷计均不小于1 700,供试品溶液
中原儿茶酸、绿原酸、金丝桃苷峰形良好,与相邻
色谱峰均达到基线分离。典型色谱图见图3。
2.2.5 线性关系考察
精密吸取对照品储备溶液0.2、0.5、1.0、
2.5、5.0mL,分别置5mL量瓶中,加甲醇定容,
摇匀。分别精密吸取上述溶液各10μL,按上述
色谱条件进样分析,以对照品质量浓度 [ρ/
(mg·L-1)]为横坐标,峰面积(A)为纵坐标,绘制
标准曲线。回归方程分别为原儿茶酸:A=
4.351 9×104ρ+6.631×10
3(r=0.999 8);绿原
酸:A=2.244 1×104ρ + 4.182×10
3 (r=
0.999 6);金 丝 桃 苷:A =3.483 2×104ρ +
1.012 7×104(r=0.999 5)。结果表明原儿茶酸、
绿原酸、金丝桃苷质量浓度分别在2.00~50.0、
8.00~200和2.00~50.0mg·L-1内与峰面积呈
良好线性关系。
916第8期 郭晓璐等:刺五加果TLC鉴别及原儿茶酸、绿原酸、金丝桃苷的含量测定
1—Protocatechuic acid;2—Chlorogenic acid;3—Hyperin
Fig.3 HPLC chromatograms of standard(a)and sample(b)
图3 对照品(a)及样品(b)的HPLC色谱图
2.2.6 精密度试验
精密吸取对照品溶液10μL,按上述色谱条
件连续进样6次,测定峰面积。原儿茶酸、绿原
酸、金丝桃苷峰面积的 RSD 值分别为0.4%、
0.6%和0.5%。结果表明仪器精密度良好。
2.2.7 稳定性试验
取供试品溶液置室温下,分别于0、2、4、6、8、
12、24h,精密吸取10μL,按上述色谱条件测定
峰面积,计算原儿茶酸、绿原酸、金丝桃苷峰面积
的RSD值分别为2.9%、0.9%、1.4%。结果表
明供试品溶液在室温下24h内稳定。
2.2.8 重复性试验
取同一批刺五加果粉末,按上述供试液制备
方法制得6份平行供试品溶液,依法测定,计算原
儿茶酸、绿原酸、金丝桃苷含量的RSD值分别为
2.5%、1.9%、2.5%。结果表明方法重复性良好。
2.2.9 回收率试验
取已知含量的刺五加果 (No.4)粉末约
0.1g,精密称定,共6份,分别精密加入同一质量
浓度对照品适量,按上述供试液制备方法制备供
试品溶液,依法测定,计算原儿茶酸、绿原酸、金丝
桃苷的加样回收率,结果见表1。
Table 1 The results of recovery(n=6)
表1 回收率试验结果(n=6)
Marker component moriginal/mg madded/mg mobserved/mg Recovery/% 珚x/% RSD/%
Protocatechuic acid 0.027 0 0.028 0 0.055 9 103.2 99.4 2.7
0.027 0 0.028 0 0.054 8 99.3
0.027 0 0.028 0 0.054 1 96.8
0.027 0 0.028 0 0.054 1 96.8
0.027 0 0.028 0 0.054 5 98.2
0.027 0 0.028 0 0.055 5 101.8
Chlorogenic acid 0.122 0 0.125 0 0.246 9 99.9 100.9 1.8
0.122 0 0.125 0 0.248 6 101.3
0.122 0 0.125 0 0.250 6 102.9
0.122 0 0.125 0 0.248 4 101.1
0.122 0 0.125 0 0.249 7 102.2
0.122 0 0.125 0 0.244 1 97.7
Hyperin 0.023 0 0.022 0 0.044 0 95.5 98.1 2.4
0.023 0 0.022 0 0.044 7 98.6
0.023 0 0.022 0 0.044 2 96.4
0.023 0 0.022 0 0.044 6 98.2
0.023 0 0.022 0 0.045 5 102.3
0.023 0 0.022 0 0.044 5 97.7
026 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第32卷
2.2.10 供试品含量测定
取各刺五加果样品,按上述供试液制备方法
制备供试品溶液,依法测定,计算各指标成分的含
量,结果见表2。
Table 2 Contents of the marker compounds in A.senticosus fruits
表2 刺五加果中各指标成分的含量
Sample No . Market/Cultivated area
w/%(×10-2)
Protocatechuic acid Chlorogenic acid Hyperin
1 Liaoning Shenyang 2.2 8.7 2.9
2 Liaoning Shenyang 1.5 10.0 3.1
3 Jilin Changbaishan 1.6 4.8 3.1
4 Liaoning Shenyang 2.7 12.2 2.3
5 Heilongjiang Zhangguangcailing 2.7 18.1 2.7
6 Jilin Changbaishan 2.1 7.3 1.4
7 Heilongjiang Hailin 2.4 23.6 3.3
8 Jilin Fusong 2.6 10.3 2.2
9 Heilongjiang Hailin 2.0 10.4 3.1
10 Jilin Changbaishan 1.5 8.0 4.3
11 Jilin Changbaishan 1.0 3.5 1.0
3 讨论
a.《中华人民共和国药典》2010年版收载的
刺五加为其干燥根和根茎或茎,其薄层色谱鉴别
以异嗪皮啶为对照品,三氯甲烷-甲醇(体积比为
19∶1)为展开剂[14]。然而,刺五加果药材提取液
中,异嗪皮啶含量较少,上述薄层色谱鉴别方法并
不适用。因此,以含量较高的金丝桃苷作对照品,
氯仿-甲醇-水-冰醋酸(体积比为65∶35∶4∶1)为展
开剂,11批样品的薄层色谱中,金丝桃苷斑点明
显,重现性好。
b.本文作者考察了不同提取方法(超声波、
热回流)、不同提取溶剂(体积分数分别为50%、
75%、100%的甲醇溶液)和不同超声提取时间(15、
30、45min)等提取条件,结果表明用体积分数为
50%的甲醇超声提取30min的提取效率最高。
c.分析结果显示,不同批次的刺五加果中原
儿茶酸、绿原酸、金丝桃苷的含量质量分数分别是
0.010%~0.027%、0.035%~0.236%和0.010%~
0.043%。其中绿原酸含量最大,但不同批次样品
中含量差别较大。金丝桃苷具有镇痛、解痉[6]、保
护心脑血管[15]、增强免疫力[7]等多种药理学活
性,是刺五加果的主要活性成分之一。因此,绿原
酸和金丝桃苷应作为刺五加果品质评价的主要指
标成分。
d.近年来,刺五加果的食用和药用价值得到
了较广泛的开发,但对其定性定量分析方法的研
究较少。本文作者建立了刺五加果的TLC定性
鉴别法,并采用 HPLC法,建立了同时测定刺五
加果中原儿茶酸、绿原酸、金丝桃苷等3种成分的
定量分析方法。本研究结果对国产刺五加果药材
的质量评价具有一定的参考价值,也为其综合质量
评价及质量标准化的研究提供了详实的实验数据。
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TLC identification of Acanthopanax senticosus
fruits and the quantitative analysis of protocate-
chuic acid,chlorogenic acid and hyperin
GUO Xiao-lu,SHI Zi-ming,QI Wen,ZHANG Guo-zhe,YUAN Dan*
(School of Traditional Chinese Meteria Medica,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang
110016,China)
Abstract:Objective To develop TLC identification methods for Acanthopanaxsenticosusfruits and
the quantitative analysis of protocatechuic acid,chlorogenic acid and hyperin by HPLC.Methods A.
senticosus fruits were identified by TLC,using hyperin as a reference substance,and chloroform-
methanol-water-glacial acetic acid(V∶V∶V∶V=65∶35∶4∶1)as a developing solvent.The contents of
protocatechuic acid,chlorogenic acid and hyperin were determined by HPLC using a Hypersil ODS2
(150 mm×4.6 mm,5μm)column,the mobile phase was a combination of glacial acetic acid-water
(V∶V=1∶99)and methanol-acetonitrile(V∶V=1∶1)at the flow rate of 1.0mL·min-1,and the elu-
ate was monitored with UV absorption at 254 nm.Results The TLC chromatogram of hyperin was of
clearness and good separation.The contents of protocatechuic acid,chlorogenic acid and hyperin in
A.senticosus fruits were determined by HPLC,the linear ranges were 2.0-50.0 mg·L-1(r=0.999
8),8.0-200 mg·L-1(r=0.999 6)and 2.0-50.0 mg·L-1(r=0.999 5),respectively,and the aver-
age recoveries were 99.4%(RSD=2.7%),100.9%(RSD=1.8%)and 98.1%(RSD=2.4%),respec-
tively.The HPLC analysis was of good accuracy,reproducibility and practice.Conclusions The sim-
ple,rapid and reliable methods are helpful for the quality control of A.senticosus fruits.
Key words:Acanthopanax senticosus fruits;hyperin;chlorogenic acid;protocatechuic acid;HPLC;
TLC
226 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第32卷