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铁钉菜甲醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用



全 文 :中国农学通报 2015,31(35):79-83
Chinese Agricultural Science Bulletin
铁钉菜甲醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用
陈景明 1,黄晓冬 2,蔡建秀 2
(1泉州幼儿师范高等专科学校,福建泉州 362000;2泉州师范学院化学与生命科学学院,福建泉州 362000)
摘 要:为了研究海藻铁钉菜提取物的酪氨酸酶抑制活性,采用多巴速率氧化法测定不同浓度的铁钉菜
甲醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制率,通过酶促动力学方法与绘制Lineweaver-Burk曲线推断其抑制类
型;福林酚法分析其总酚含量、苯酚硫酸法测定其多糖含量、AlCl3显色法测定其总黄酮含量。结果表
明:铁钉菜甲醇提取物能显著抑制酪氨酸酶活性,其半效应浓度 IC50为1.823 g/L,抑制类型为非竞争型
抑制;化学分析发现该甲醇提取物具有较高含量的总酚、多糖与总黄酮,含量分别为(51.37±2.77)、
(35.92±5.27)、(43.16±0.33) mg/g。
关键词:铁钉菜;甲醇提取物;酪氨酸酶;抑制动力学
中图分类号:Q949.95;R282.705 文献标志码:A 论文编号:casb15070068
Inhibitory Effect of the Methanol Extracts from Ishige okamurai Yendo on Tyrosinase
Chen Jingming1, Huang Xiaodong2, Cai Jianxiu2
(1Quanzhou Preschool Education College, Quanzhou Fujian 362000;
2College of Chemistry and Life Science, Quanzhou Normal University, Quanzhou Fujian 362000)
Abstract: To study the inhibitory effect of the extract from Ishige okamurai Yendo on tyrosinase, inhibition
ratio of the methanol extracts from Ishige okamurai on the activity of tyrosinase was researched by the method
of oxidation rate of L- DOPA, and its inhibition kinetic type was inferred by enzymatic dynamic test and
Lineweaver-Burk curve method. The content of total phenols, polysaccharide and flavonoids was determined
by Folin-Ciocalteu method, phenol- sulfuric acid method and AlCl3 color- developing method, respectively.
The results showed that the methanol extracts from Ishige okamurai could obviously inhibited activity of
tyrosinase with IC50 being 1.823 g/L. The inhibition kinetic characteristics were in accord with the
noncompetitive inhibition. Chemical analysis showed that the methanol extracts had high content of total
phenol, polysaccharides and flavonoids, which was (51.37 ± 2.77), (35.92 ± 5.27), (43.16 ± 0.33) mg/g,
respectively.
Key words: Ishige okamurai Yendo; methanol extracts; tyrosinase; inhibition kinetics
0 引言
大型海藻是生长于海洋中的低等隐花植物,自古
以来是沿海居民药食两用的材料。由于生境的特殊性
使其具有与陆岸植物差异较大的化学组成,具有较高
含量的海藻多糖特别是硫酸化多糖与海藻多酚等独特
的活性成分。铁钉菜(Ishige okamurai Yendo),隶属褐
藻门铁钉菜科,广泛分布于中国东南沿海,是重要的经
济和药用藻类,民间用于喉炎、淋巴结炎、甲状腺肿等
的治疗[1]。研究发现铁钉菜中有海藻甾醇[2]、多糖[3]、凝
集素[4]、糖脂类与脂肪酸类[5]等化学成分,生物活性检
测发现其有机溶剂提取物萃取相及薄层层析分离条带
大多具有抗菌活性[6-8],岩藻甾醇、3β,28ξ-二羟基-24-乙
基金项目:福建省教育厅A类科技项目“海藻铁钉菜提取物抗氧化与抗酪氨酸酶活性研究”(JA14431);泉州市科技计划项目“海藻铁钉菜保健型降糖
冲剂的制备与应用研究”(2014Z129)。
第一作者简介:陈景明,男,1966年出生,福建泉州人,副教授,本科,主要从事资源动植物学研究。通信地址:362000福建省泉州市泉州幼儿师范高
等专科学校,E-mail:849182746@qq.com。
收稿日期:2015-07-12,修回日期:2015-09-28。
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基-5,23Z-胆甾二烯,132S-羟基脱镁叶绿素 a,脱镁叶绿
素 a等化合物具有肿瘤细细胞毒性[2,5,9],岩藻黄质具有
较 强 的 抗 癌 作 用 [10],多 酚 化 合 物
diphlorethohydroxycarmalol (DPHC)具有神经保护 [11]、
防止细胞高血糖氧化损伤等作用[12],还可以防辐射损
伤[13];铁钉菜乙醇提取物还具有抗炎作用[14]、80%甲醇
提取物具有降低血糖与改善胰岛素抵抗[15]等作用。目
前,对铁钉菜提取物作为酪氨酸酶抑制剂的研究尚未
见报道。本研究旨在测定铁钉菜甲醇提取物对酪氨酸
酶的抑制作用,同时测定其有关化学成分,以期为铁钉
菜甲醇提取物应用于新型海藻源美白化妆品、生物杀
虫剂与食品添加剂的研制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
主 要 仪 器 :TECAN Infinite ® M200 PRO
NanoQuant多功能酶标仪(瑞士TECAN);JJ-2组织捣
碎机(金坛市城东新瑞仪器厂);N-1000旋转蒸发仪
(上海爱朗仪器有限公司)等。
主要试剂:酪氨酸酶Mushroom tyrosinase(480 U/mg,
美国Worthington,用 50 mmol/L PBS配制成相应浓
度),芦丁对照品(中国药品生物制品检定所,纯度
92.5%,批号:100080-200707),没食子酸对照品(中国
药品生物制品检定所,纯度 89.9%,批号:110831-
201204),葡萄糖标准品(贵州迪大科技生物有限公司,
纯度≥98%,批号:QZDD- 0144- 201207),左旋多巴
(L-DOPA)购自Sigma,二甲亚砜(DMSO),磷酸二氢钠,
磷酸氢二钠等均为国产分析纯。
1.2 铁钉菜甲醇提取物及其样液的制备
供试海藻铁钉菜采自中国福建省围头湾岩礁,拣
除杂藻后新鲜海水、蒸馏水洗净沥干,称重后置于组织
捣碎机搅碎制成匀浆,加入 10倍量体积(mL)的甲醇,
暗处振摇(180 r/min)提取,提取3次,72 h/次,提取液抽
滤,合并滤液,滤液过0.22 μm尼龙滤膜以滤除微细不
溶物,所得滤液再经 40℃减压浓缩去甲醇[16]得甲醇提
取物,用药刮刮下称重并计算得率。甲醇提取物遮
光 -20℃贮存备用,使用时以 DMSO配成质量浓度
10.000 g/L母液,并稀释成不同浓度样液。
1.3 铁钉菜甲醇提取物中部分化学成分分析
1.3.1 总酚含量测定 采用福林酚法[16-17]略加修改。取
50 μL浓度为 1.000 g/L的样液加入 75 μL去离子水,
50 μL 10倍稀释的福林酚试剂,漩涡混匀,1 min后加
入50 μL 20% Na2CO3溶液,充分混合后,暗处37℃反应
60 min。750 nm处测吸光度,3次重复求平均值。以
没食子酸为标准,总酚含量以等量的没食子酸(gallic
acid equivalents, GAE)计。
1.3.2 总糖含量测定 采用苯酚-硫酸法[18]。吸取浓度
为1.000 g/L的样液0.25 mL,加入0.25 ml蒸馏水,后加
入0.5 mL 5%苯酚溶液,再迅速加入2.5 mL浓硫酸,摇
匀后静置15 min,然后置于沸水浴中30 min,冷水冷却
至室温。以蒸馏水代替样液按同样显色操作空白调
零,在 490 nm波长下测定其吸光度(752型分光光度
计),以葡萄糖为标准品,样品总糖含量以等量葡萄糖
(Glucose equivalents,GE)计。
1.3.3 总黄酮含量测定 参考Cox等[19]的方法。取150 μL
浓度为 1.000 g/L的样液与 7.5 μL 5% NaNO2(现配,棕
色瓶)充分混合,6 min后加入 200 μL 10% AlCl3水溶
液,5 min后加入 50 μL 1 mol/L NaOH,混匀后 510 nm
测吸光度,3次重复求平均值。以芦丁为标准,总黄酮
含量以等量的芦丁(Rutin equivalents, RE)计。
1.4 铁钉菜甲醇提取物对酪氨酸酶活性抑制的测定
采用酶标法 [20],210 μL 0.05mol/L PBS (pH 6.8),
40 μL 5 mmol/L多巴,10 μL的样液与 40 μL的酪氨酸
酶 (100 units/mL)加入 96孔酶标板,混匀,37℃温育
10 min后,测475 nm的吸光值As,以10 μL PBS代替样
液测得Aa,同时测不加样液与酪氨酸酶的空白本底值
Ab,不加酪氨酸酶的样液本底值Ac,按公式(1)计算酶活
抑制率(I)。
I = æèç
ö
ø÷1 -
As - Ac
Aa - Ab
× 100% ……………………… (1)
酪氨酸酶抑制活性以 50%抑制率所对应的浓度
IC50表示。在上述反应体系条件下,分别测定 0.000、
0.200、0.600、1.000 g/L质量浓度的铁钉菜甲醇提取物
样液对不同浓度酪氨酸酶活性(E分别为 20、40、60、
80、100 U/mL)的影响,实验重复 3次。酪氨酸酶催化
反应的速率 v以体系10 min反应终止后所测得的吸光
值A475(A475=A3-A4,A3、A4分别是样液组吸光度值、样液
组背景吸光度值)定量表征[21],以A475对酶浓度E作图,
并依此判断抑制剂的作用类型。
1.5 铁钉菜甲醇提取物对酪氨酸酶活性抑制的动力学
研究
在上述酶活反应体系中,改变L-DOPA底物浓度
([S]分别为 0.33、0.5、1.0、2.0 mmol/L),测定不同质量
浓度([I]分别为 0.000、0.200、0.400、1.000 g/L)的铁钉
菜甲醇提取物对酪氨酸酶活性的影响,于波长475 nm
处测定吸光度值,实验重复 3次。采用 Lineweaver-
Burk双倒数法[22]作图分析,求得米氏常数Km和酶促
反应最大速率 v m,根据样液浓度与Km、v m的关系判
断酶抑制类型。
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陈景明等:铁钉菜甲醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用
2 结果与分析
2.1 铁钉菜甲醇提取物的主要化学成分含量
实验测得铁钉菜甲醇提取物得率为11.92%,该提
取物的主要化学组成含量见表1。表1显示,铁钉菜甲
醇提取物的总酚含量为(51.37±2.77) mg/g,多糖含量
(35.92±5.27) mg/g,多酚类物质中的总黄酮含量为
(43.16±0.33) mg/g。
2.2 不同浓度铁钉菜甲醇提取物对酪氨酸酶活力的
影响
不同浓度铁钉菜甲醇提取物对酪氨酸酶活力的影
响结果如图1。图1显示,铁钉菜甲醇提取物对酪氨酸
酶活性的抑制能力均随样液浓度的增大而增强,在质
量浓度 10 g/L时,铁钉菜甲醇提取物的酪氨酸酶活性
抑制率高达88%,其剂量-抑制效应满足Allometric1曲
甲醇提取物
得率/%
11.92
含量/(mg/g)
总酚(以GAE计)
51.37±2.77
多糖(以GE计)
35.92±5.27
总黄酮(以RE计)
43.16±0.33
表1 铁钉菜甲醇提取物的得率及其化学组成(n=3)
线方程 y=40.646x0.345(Adj.R2=0.9898),由此推算其半效
应浓度 IC50为1.823 g/L。
2.3 铁钉菜甲醇提取物对不同浓度酪氨酸酶的抑制
作用
铁钉菜甲醇提取物对不同浓度酪氨酸酶的抑制作
用如图2所示。由图2可以看出,在铁钉菜甲醇提取物
样液浓度一定的情况下,随着酪氨酸酶浓度的增加,其
吸光度值A475都呈线性的增加,而在酪氨酸酶浓度一
定的情况下,随着样液浓度的增加,A475呈下降的趋势,
以A475对酶浓度作图,呈 4条直线,直线斜率呈下降趋
势,且4条直线均可通过原点,说明铁钉菜甲醇提取物
对酪氨酸酶的抑制作用为可逆性抑制,抑制作用是通
过降低酶的活力来实现的,而不是通过降低其有效
酶量。
2.4 铁钉菜甲醇提取物对酪氨酸酶活性作用的动力学
分析
在测酶活体系中,通过固定酪氨酸酶的浓度,改变
底物L-DOPA浓度,测定不同浓度铁钉菜甲醇提取物
样液(0.000, 0.200, 0.400, 1.000 g/L)对酪氨酸酶活力的
影响,结果以Lineweaver-Burk双倒数作图并计算出米
氏常数Km与酶促反应的最大速率Vm(见图 3,表 2)。
从图 3可以看出该组直线相交于X轴,随着提取物质
010
2030
4050
6070
8090
100
0 2 4 6 8 10 12
样液浓度/(g/L)



/%
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0 20 40 60 80 100
酪氨酸酶浓度/(U/mL)
A 475
0.000 g/L 0.200 g/L0.600 g/L 1.000 g/L
图1 铁钉菜甲醇提取物对酪氨酸酶抑制的量效关系 图2 不同浓度铁钉菜提取物对酪氨酸酶活性的抑制活性
-40
-20
0
20
40
60
80
-2 -1 0 1 2 3 41/[S]
1/v
0.000 g/L0.200 g/L0.400 g/L1.000 g/L
图3 不同浓度铁钉菜提取物对酪氨酸酶活性抑制的
Lineweaver-Burk图
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中国农学通报 http://www.casb.org.cn
量浓度的增加,米氏常数Km保持不变,酶促反应最大
速率Vm减小(见表2),这些特征与非竞争性抑制类型
的动力学特征相符,即提取物作为抑制剂可以和游离
酶结合,但并不是结合在酶活性中心的底物结合部位
上,而是结合在底物结合部位以外的的必需基团上,从
而影响酶的活性,其酶抑制程度随提取物浓度增加而
增大,但与底物无关[22]。以图 3各直线斜率对相应的
[I]再作图可得一条直线(见图 4),依此求得抑制常数
y=11.689x+12.234
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5[I]







表2 铁钉菜甲醇提取物对酪氨酸酶抑制的动力学参数
提取物浓度/(g/L)
0.000
0.200
0.400
1.000
Lineweaver-Burk方程
1/v=12.409/[S]+0.8244
1/v=13.865/[S]+0.9212
1/v=17.562/[S]+1.1675
1/v=23.804/[S]+1.5810
Km/(g/L)
15.05
15.05
15.04
15.05
Vm(1/A475nm)
1.21
1.08
0.86
0.63
KI为1.05 g/L。
3 结论与讨论
酪氨酸酶(Tyrosinase)是一种广泛存在于动植物、
真菌及微生物体内的含铜多酚氧化酶[23],是生物体合
成黑色素的关键限速酶。研究发现酪氨酸酶具有多种
生物功能,不仅过量表达时易使人体产生雀斑、黄褐斑
与老年班等色素沉着性疾病[24-27];而且在果蔬的褐变反
应中发挥着关键作用[28],并影响着昆虫的伤口愈合、免
疫系统与蜕皮生长[25,29]。因此,抑制酪氨酸酶的活性为
防止果蔬褐变、色素沉着障碍[30]以及研制生物源杀虫
剂[31]提供了可行的思路,研发与应用酪氨酸酶抑制剂
(tyrosinase inhibitors, TI)受到各国研究者的广泛关注。
鉴于化学合成的酪氨酸酶抑制剂的黑色素细胞毒性与
副作用[20],如氢醌的致敏作用[32]、曲酸的致癌作用[33],寻
找与开发无毒、高效、特异性强的天然源酪氨酸酶抑制
剂成为众多研究者的关注点[25]。
植物是天然源酪氨酸酶抑制剂的主要来源,但该
类研究主要集中在高等植物中[34],海藻来源的酪氨酸
酶抑制剂的研究相对较少,商飞[35]对11种海藻的研究
发现不同海藻具有不同程度的酪氨酸酶抑制活性。本
实验对铁钉菜甲醇提取物的研究发现该提取物具有明
显的酪氨酸酶抑制作用,半效应浓度 IC50为1.823 g/L;
抑制动力学分析发现该提取物对酪氨酸酶的抑制类型
为非竞争型抑制,抑制常数KI为1.05 g/L,表现为随着
提取物质量浓度的增加,米氏常数Km保持不变,酶促
反应最大速率Vm减小,这是因为提取物作为抑制剂
可以独立与酶结合,并不影响酶和底物的结合,即通过
结合在酶底物结合部位以外的的必需基团上阻止酶的
催化作用,使Vm降低。其作用与羽藻石油醚组分、羽
藻乙酸乙酯组分、缘管浒苔乙酸乙酯组分对酪氨酸酶
活性的抑制机制相似[35]。化学分析表明铁钉菜甲醇提
取物具有较高含量的多酚、多糖与总黄酮,含量分别为
(51.37±2.77)、(35.92±5.27)、(43.16±0.33) mg/g。这些成
分有可能在酪氨酸酶抑制中发挥着不同的作用,因而
后续的研究有必要分离出相应的组分,从而探明其有
效成分与揭示其作用机制。
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