全 文 ：FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
食 品 科 技
2010年 第 35卷 第 10期
Study on extraction and antioxidantive activity of total flavones from
Viola tianshanica Maxim
WU Jian-fang1, XUE Mei2, LI Bing-qi2*, WANG Xin-bing3
(1.College of Life Science, Shihezi University, Shihezi 832000; 2.College of Chemistry and
Chemical Engineering, Shihezi University, Shihezi 832000; 3.College of Pharmacy, Shihezi
University, Shihezi 832000)
Abstract: To determine the best extracting process of total flavonoids from Viola tianshanica Maxim. The
extract conditions for extracting on the total flavonoids of Viola tianshanica Maxim were studied by orthogonal
experimental design guided by the extraction rate. In addition, results shows that the optimum technology was:
50% alcohol as extracting solvent, the temperature was 60 ℃, extracting time was 30 min and extracting three
times. The total flavonoids of Viola tianshanica Maxim have scavenging efficiency to 1,1-diphenyl-2-picryl-
hydrazyl radical(DPPH·) and hydroxyl radical(·OH) and in a certain scope, the effect grew stronger as mass
concentration increased.
Key words: Viola tianshanica Maxim; total flavonoid; antioxidantive activity
吴建芳 1， 薛 梅 2， 李炳奇 2*， 王新兵 3
(1.石河子大学化学化工学院，石河子 832003；2.石河子大学生命科学学院，
石河子 832003；3.石河子大学药学院，石河子 832003)
摘要： 探讨天山堇菜中总黄酮提取的最佳工艺条件。采用正交实验，对影响天山堇菜中总黄酮
的提取因素进行研究。同时，本实验还研究了天山堇菜总黄酮对羟自由基(·OH)、二苯代苦味肼基
自由基(DPPH·)的清除能力。结果表明，天山堇菜总黄酮提取的最佳工艺条件为：以 50%乙醇为
提取溶剂，提取时间为 30 min，提取温度为 60 ℃，提取 3次，此时总黄酮的含量为 2.233%。天
山堇菜中的总黄酮对·OH和 DPPH·均有清除作用，浓度增大其抗氧化能力也随之增强。
关键词： 天山堇菜；总黄酮；抗氧化活性
中图分类号： R 284.2 文献标志码： A 文章编号： 1005-9989(2010)10-0214-04
天山堇菜总黄酮的提取工艺及
抗氧化活性研究
收稿日期： 2010-01-21 *通讯作者
基金项目： 教育部“春晖计划”项目(Z2006-1-83015)。
作者简介： 吴建芳(1985—)，女，山东潍坊人，硕士研究生，研究方向为植物化学。
天山堇菜(Viola tianshanica Maxim)为堇菜科堇
菜属植物，以全草入药。全草主要用于各种发热、
受寒、感冒、胸膜炎、肺炎、咽炎、疔疮肿痈等[1]。
天山堇菜全草经预实验检出含有挥发油、黄酮类、
生物碱、氨基酸、黏液质皂苷、鞣质等物质[2-3]。
黄酮类有效成分对治疗冠心病、老年痴呆、脑血
提取物与应用
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栓和消除自由基、抑菌、抗癌等方面有显著效果，
无副作用，可以开发出多种药品和保健食品[4]。目
前对天山堇菜黄酮类化合物的研究较少，曾有学
者对天山堇菜提取物的抑菌特性以及其对油脂的
抗氧化作用进行了研究[5-6]，但天山堇菜总黄酮对
DPPH·和·OH的清除能力未见报道。随着对自由
基研究的逐渐深入，许多学者意识到许多合成抗
氧化剂存在一定毒性，长期使用会对人类的身体
造成一定的损害，因此寻找具有清除自由基能力
的健康抗氧化剂成为现今研究的热点。
本实验首次采用超声波提取天山堇菜中的总
黄酮，以芦丁为对照品测定天山堇菜中总黄酮含
量，加入铝离子试剂，同时控制适宜pH值，使黄
酮化合物与铝盐形成配合物在可见光区能获得稳
定的特征吸收峰。以总黄酮的含量为考察指标，
通过正交实验，对天山堇菜中总黄酮的提取工艺
进行优选。同时本文通过测定天山堇菜总黄酮清
除DPPH·和·OH作用活性来评价其抗氧化能力的
强弱，为该植物在天然产物方面的开发利用提供
依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器
天山堇菜：市售；KQ-250DE型数控超声波清
洗器：昆山市超声仪器有限公司；R-205 型旋转
蒸发仪：上海申生科技有限公司；SHB-B95型循
环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；
S54 紫外分光光度计：上海棱光技术有限公司；
DPPH：美国Sigma公司；对照品芦丁：中国药品
生物制品检定所；对照品芦丁：中国药品生物制
品检定所；其余试剂均为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 天山堇菜中总黄酮的含量测定 精密称取芦
丁对照品10mg，置25mL容量瓶中，加80%乙醇
溶解，定容，精密吸取 0.0、 .2、0.4、0.6、0.8、
1.0 mL，分置于 10 mL 容量瓶中，加 5%亚硝酸
钠 0.3 mL，放置 6 min，再加 10%硝酸铝 0.3
mL，放置 6 min，加 4%氢氧化钠 4 mL，加水至
刻度，摇匀。进行全波长扫描在 510 nm 均有最
大吸收。以 510 nm 处测得的吸收度 A 对浓度 C
回归，得回归方程：A=11.225C+0.0027，r=0.
99913，在8～40μg/mL的范围内，浓度与吸收度
有良好的线性关系。
分别将测总黄酮的样品液定量稀释后，再精
密吸取各稀释液适量于 10mL容量瓶中，照标准
曲线制定项下方法操作，测定吸收度，由回归方
程求出稀释液中总黄酮浓度，然后计算百分含量。
1.2.2 天山堇菜中总黄酮的提取 单因素实验：准
确称取 2 g天山堇菜样品，在料液比为1∶20条件
下，改变提取时间、提取温度、乙醇浓度和提取
次数等因素进行单因素实验。乙醇浓度选取
40%、50%、60%、70%、80% 5个水平，提取时
间选取 10、20、30、40、50min5个水平，提取
温度选取30、40、50、60、70℃5个水平，提取
次数选取 1、2、3、4、5次5个水平，分别进行
单因素实验。
正交实验：根据单因素实验结果，选取乙醇
浓度、提取时间、提取温度和提取次数为主要考
察因素，以总黄酮含量作为考察指标，采用L9(34)
正交表进行实验。
1.2.3 天山堇菜总黄酮提取物抗氧化活性的测定
天山堇菜总黄酮对羟自由基的清除能力的测
定[7]：精密量取 2.0 mL 磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.
4)，蒸馏水 4.0 mL 于试管中，作为空白参比管；
精密量取 2.0 mL PBS 1.0 mL、邻二氮菲(1.5
mmol/L)、1.0mLFeSO4(1.5mmol/L)和2mL蒸馏水，
作为未损伤管；精密量取 2.0 mL PBS、1.0 mL 邻
二氮菲(1.5mmol/L)、1.0mLFeSO4(1.5mmol/L)、1.0
mL水和1.0mLH2O2(0.02%)，作为损伤管；精密量
取 2.0mLPBS、1.0mL待测样和3.0mL蒸馏水作
为样品参比管；精密量取 2.0 mL PBS、1.0 mL 邻
二氮菲(1.5mmol/L)、1.0mLFeSO4(1.5mmol/L)、1.0
mL待测样和1.0mLH2O2作为样品管。
将上述管置恒温水浴锅中，37℃保温60min，
在536nm处测定吸光值。以茶多酚、Vc作对照。
按下式计算清除率：
羟自由基清除率(%)=[(A样品 - 样参)-(A损伤 -A空
参)／(A未损 -A损伤)]×100
天山堇菜总黄酮清除DPPH·自由基能力的测
定[8]：往具塞试管中加入不同浓度的样品提取液2
mL，然后加入0.2mmoL/L 的 DPPH 溶液 2.0 mL。
30 min 后以样品提取溶剂为空白测定其在 517
nm 处的吸光值 Ai；测定 2 mL 不同浓度的样品
提取液与 2 mL 无水乙醇的吸光值 Aj；测定 2
mL 2 mmoL/L 的 DPPH 溶液与2mL无水乙醇的吸
光值AC。
DPPH·自由基清除率(%)＝[1-(Ai-Aj)]/AC×100
式中：Ai为加待测液时DPPH液的吸光值；
提取物与应用
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Aj为不加DPPH，不加试样液的吸光值；
AC为不加待测液，只加DPPH的吸光值；
2 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 乙醇浓度的影响
由图 1 可知，料液比为 1∶20，提取 30 min，
提取温度为40℃提取1次时，乙醇浓度对总黄酮
含量的影响。结果表明，乙醇浓度为50%时，总
黄酮含量为最高，但浓度超过50%后，总黄酮含
量随乙醇浓度增大而减小。因此乙醇浓度选择
40%～60%适宜。
2.1.2 提取时间的影响
由图2可知，料液比为1∶20，提取温度为40
℃，乙醇浓度为50%提取1次时，提取时间对总
黄酮含量的影响。结果表明提取时间为40min时，
总黄酮含量最高，提取时间选择30～50min比较
合适。
2.1.3 提取温度的影响
由图 3 可知，料液比为 1∶20，提取 30 min，
乙醇浓度为50%，提取1次时，提取温度对总黄
酮含量的影响。由图3可知，提取温度为50℃时
总黄酮含量最高，超过50℃后总黄酮含量增长不
大。因此提取温度选择40～60℃。
2.1.4 提取次数的影响
由图 4 可知，料液比为 1∶20，提取 30 min，
提取温度为40℃，乙醇浓度50%时，提取次数对
总黄酮含量的影响。可以看出，总黄酮含量随提
取次数的增大而增加，从提取效果、节省溶剂等
方面综合考虑，提取次数选择1～3次比较合适。
2.2 正交实验
精密称取天山堇菜2g，以L9(34)正交表安排实
验，进行提取。以总黄酮含量为指标，考察不同
因素对总黄酮含量的影响，结果见表2。
对实验结果进行直观分析，比较 4 个因素的
极差R，结果表明影响总黄酮含量因素的大小顺
序为A＞D＞C＞B，因此选择超声提取的最佳工艺
表 1 总黄酮正交实验设计因素水平表
水平
因素
乙醇浓度/
% A
提取时间/
min B
提取温度/
℃ C
提取次数/
次 D
1 40 30 40 1
2 50 40 50 2
3 60 50 60 3
表 2 总黄酮正交实验结果
2 1 2 2 2 1.770
3 1 3 3 3 1.877
4 2 1 2 3 2.068
5 2 2 3 1 1.899
6 2 3 1 2 1.882
7 3 1 3 2 1.962
8 3 2 1 3 1.943
9 3 3 2 1 1.854
K1 5.332 5.715 5.510 5.438
K2 5.849 5.612 5.692 5.614
K3 5.759 5.613 5.738 5.888
k1 1.777 1.905 1.837 1.813
k2 1.950 1.871 1.897 1.871
k3 1.920 1.871 1.913 1.963
R 0.517 0.103 0.228 0.230
1 1 1 1 1 1.685
实验号
A B C D
因素
总黄酮含
量/%
提取物与应用
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条件为 A2B1C3D3，即乙醇浓度 50%，提取时间为
30min，提取温度为60℃，提取3次。
精密称取天山堇菜2g，按A2B1C3D3提取工艺
进行提取，测定总黄酮含量(重复3次)，其含量分
别为 2.261%、2.215%、2.193%，其平均含量为
2.233%，RSD=1.561。
2.3 天山堇菜总黄酮提取物抗氧化活性
2.3.1 天山堇菜总黄酮对羟自由基的清除作用
由图5可知，天山堇菜总黄酮提取液、茶多
酚和Vc对羟自由基的清除能力随着浓度的增加而
逐渐加强。在一定浓度内，天山堇菜黄酮提取物
对羟自由基的清除能力低于茶多酚优于VC。
2.3.2 天山堇菜总黄酮对 DPPH·自由基的清除作
用
由图6 可知，随着浓度的增大，总黄酮提取
液、茶多酚和Vc对DPPH·的清除能力逐渐增强。
在高浓度时，天山堇菜总黄酮提取液对DPPH·的
清除能力优于茶多酚，低于VC。
3 讨论
黄酮类化合物存在于自然植物中，具有多种
多样的药理活性，能防治心脑血管系统的疾病和
呼吸系统的疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧
化、抗辐射、抗癌、抗肿瘤以及增强免疫能力等
药理作用[9]。黄酮类化合物被广泛用于医药、食品
等行业，具有极广的开发应用前景。本课题对天
山堇菜总黄酮的超声提取工艺进行研究，为其资
源开发利用提供依据。采用超声辅助提取技术不
仅操作过程简单方便,而且提取时间短,提取效果
好,在工业生产中被广泛应用。
本文根据正交设计实验采用超声技术从天山
堇菜中提取总黄酮,其优选的最佳工艺条件为：
50%乙醇为提取溶剂，提取时间为30min，提取温
度为60℃，提取3次。测得天山堇菜中总黄酮平
均含量为2.233%。
实验表明，天山堇菜总黄酮对羟自由基和二
苯代苦味肼基自由基均有一定的清除作用，在一
定范围内，随着浓度的增大，其清除自由基的能
力随之增强。天山堇菜总黄酮具有一定的抗氧化
活性，其药用价值值得关注，其药理作用有待进
一步研究。
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