全 文 ：第 28卷 ,第 4期 光　谱　实　验　室 Vol . 2 8 , No . 4
2 0 1 1年 7月 Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory July , 2 0 1 1
杏香兔耳风高效液相色谱指纹图谱研究①
① 江西省天然药物活性成分研究重点实验室开放基金资助项目 ( 2009-05)
② 联系人 ,手机: ( 0) 13507058127; E-mail: zsqycxy@ 163. com
作者简介:吴正平 ( 1971— ) ,男 ,江西省奉新县人 ,副教授 ,主要从事药物分析及药理研究工作。
收稿日期: 2010-10-31;接受日期: 2010-12-04
吴正平　冷桂华a　邹盛勤② a
(宜春学院美容医学院　江西省宜春市　 336000)
a (宜春学院化学与生物工程学院　江西省天然药物活性成分研究重点实验室　江西省宜春市学府路 576号　 336000)
摘　要　建立了杏香兔耳风高效液相色谱指纹图谱 ,为科学评价及有效控制其质量提供可靠方法。采
用 Kromasil C18柱 ( 4. 6mm× 250mm, 5μm) ,以甲醇 -0. 5%磷酸的水溶液为流动相 ,梯度洗脱程序为 0min
( 30∶ 70) -15min( 30∶ 70) -20min( 50∶ 50) -40min( 50∶ 50) ;流速 0. 8m L· min- 1;检测波长 350nm;柱温
25℃。 建立的杏香兔耳风指纹图谱中共确定了 10个共有峰 ,各样品指纹图谱与对照指纹图谱相似度均在
0. 9以上 ,建立的 HPLC指纹图谱具有良好的精密度、重现性和稳定性 ,可以作为杏香兔耳风质量评价的
主要依据 ,也为深入研究中药杏香兔耳风的质量标准提供了实验基础。
关键词　杏香兔耳风 ;高效液相色谱 ;指纹图谱 ;绿原酸 ;芦丁
中图分类号: O657. 7+ 2　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1004-8138( 2011) 04-2031-04
1　引言
杏香兔耳风 ( Ainsl iaea f ragrans Champ. )是菊科兔耳风属植物 ,别名白走马胎、金边兔耳草、一
枝香等 ,自然分布于长江以南各省区 ,《江西省中药材标准》和《卫生部药品标准》均有收载 ,具有清
热补虚、凉血止血、利湿解毒等功效 ,民间全草入药 ,用于治疗肺结核咳血、跌打损伤、无名肿毒、慢
性宫颈炎等 [1 ]。主要含有倍半萜内酯、倍半萜苷、甾体、黄酮、三萜类等化学成分 [ 2]。药理实验证明对
金黄色葡萄球菌、乙型链球菌等有抑制作用 ,其药用价值较高 ,属抗广谱菌中草药 [3 ]。目前杏香兔耳
风的 HPLC指纹图谱的研究未见文献报道。为了制订杏香兔耳风的质量标准 ,以提高药材质量的
可控性及其植物资源的开发利用程度 ,本研究首次采用反相高效液相色谱法建立了杏香兔耳风指
纹图谱的分析方法 ,旨在为杏香兔耳风的质量控制和合理开发利用提供科学依据。
2　实验部分
2. 1　仪器与试剂
Waters高效液相色谱仪 [515泵 , 2996光电二极管矩阵检测器 ( PAD) , 7725i手动进样器 ,柱温
箱 , Empower中文色谱工作站 ,美国 Waters公司 ]; SK-2510HP超声提取仪 (上海汉克科学仪器有
限公司 ) ;指纹图谱计算机辅助相似性评价系统软件 (国家药典委员会 )。
杏香兔耳风药材分别采自江西宜春、上饶、九江、新余、萍乡 (见表 1) ,经宜春市林业科学研究
所徐光辉研究员鉴定为杏香兔耳风 ( Ainsliaea fragrans Champ. )的全草 ;绿原酸和芦丁对照品 (中
国药品生物制品检定所 ,批号: 110753-200212、 100081-200406) ;甲醇 (色谱纯 ,上海陆忠试剂厂 ) ;
其他试剂均为分析纯。 实验用水为超纯水。
表 1　杏香兔耳风药材样品产地与来源
样品编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14
产地 宜春 宜春 宜春 宜春 宜春 宜春 上饶 上饶 上饶 九江 新余 新余 萍乡 萍乡
来源 野生 野生 野生 种植 种植 种植 野生 种植 种植 野生 野生 野生 野生 野生
2. 2　溶液的制备
2. 2. 1　对照品溶液的制备
准确称取减压干燥至恒重的绿原酸对照品 3. 27mg和芦丁对照品 1. 09mg ,用甲醇溶解后定容
于 10mL容量瓶中 ,配制成含芦丁 0. 109mg· mL- 1和含绿原酸 0. 327mg· mL- 1的对照品混合溶
液 ,用 0. 45μm微孔滤膜过滤 ,即得。
2. 2. 2　供试品溶液的制备
杏香兔耳风干燥后粉碎 ,过 20目筛 ,准确称取约 2g ,置具塞三角烧瓶中 ,加 90%乙醇 40mL,超
声提取 30min,过滤 ,滤渣用乙醇洗涤 2次 ,合并滤液 ,转移至 50mL容量瓶中 ,用乙醇稀释至刻度 ,
摇匀 , 0. 45μm滤膜过滤 ,即得。
图 1　对照品 HPLC图谱
1——绿原酸 ; 2—— 芦丁。
2. 3　色谱条件
流动相为甲醇 -0. 5%磷酸的水溶
液 ,梯度洗脱程序为 0min ( 30∶ 70) -
15min( 30∶ 70) -20min( 50∶ 50)-40min
( 50∶ 50) ;流速 0. 8m L· min- 1 ;检测波
长 350nm;柱温 25℃ ;光电二极管阵列
检测器。对照品的 HPLC色谱图见图
1。
3　结果与讨论
3. 1　精密度实验
准确吸取对照品溶液 10μL进样分析 ,重复进样 5次 ,绿原酸和芦丁保留时间、峰面积的 RSD
分别为 0. 26% 、 0. 31%和 0. 21% 、 0. 17% ,表明仪器精密度良好。
3. 2　溶剂及提取方法考察
比较了以乙醇为溶剂的冷浸、索氏、回流、超声提取等不同方法的提取效果 ,以 90%乙醇超声
提取 30min的总体效果为佳 ,杏香兔耳风中酚酸类和黄酮类成分等主要成分的提取率高 ,所得图谱
峰较多且分离良好。
3. 3　稳定性实验
取同一供试品溶液 ,在样品制备完成后第 0, 1, 2, 4, 8, 24h分别进样 10μL,结果色谱图中各共
有峰保留时间和峰面积的 RSD分别为 1. 32%— 2. 30%和 0. 87%— 2. 32% ,表明供试品溶液在 24h
内稳定。
3. 4　重现性实验
取同一批次杏香兔耳风药材样品 5份制备供试品溶液 ,分别准确吸取 10μL进样分析 ,各共有
2032 光谱实验室 第 28卷
峰保留时间和峰面积的 RSD分别为 0. 63%— 1. 35%和 1. 54%— 2. 33% ,表明该测定方法的重复
性良好。
3. 5　杏香兔耳风指纹图谱的建立及相似度分析
3. 5. 1　检测结果
按“ 2. 2. 2”项下方法制备 14批次杏香兔耳风药材的供试品溶液 ,在“ 2. 3”项的色谱条件下 ,依
次进样检测 ,获得 14批次杏香兔耳风高效液相色谱叠加图。
3. 5. 2　共有特征峰的标定
根据 14批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值 (积分值 )和峰位 (相对保留时间 )等相关参数
进行分析、比较 ,杏香兔耳风高效液相色谱可分离出 10多个色谱峰 ,通过对照品 (绿原酸和芦丁 )保
留时间和紫外光谱检测结果的对照 ,并比较所测定和记录的色谱图 ,选取 10个共有峰作为指纹图
谱的特征峰 ,其中 2号峰为绿原酸色谱峰 , 9号峰为芦丁色谱峰 (见图 2)。
图 2　杏香兔耳风样品 HPLC指纹图谱
R——对照指纹图谱 (平均值 ) ; S1— S14—— 杏香兔耳风样品 ;2—— 绿原酸 ;9——芦丁 ; S——对照品峰。
3. 5. 3　共有图谱模式的建立
将各批次样品的测试数据导入计算机辅助相似性评价系统软件 ( 2004年版 A) ,经选峰 ,设定
匹配模板 ,将谱峰自动匹配 ,建立其共有图谱标准模板 ,然后进行各样品的相似度评价 [4 ]。
3. 5. 4　图谱相似度分析
采用计算机辅助相似性评价系统软件分析各批次样品指纹图谱的相似度 ,结果见表 2。 经分
析 , 14批次不同产地的杏香兔耳风样本中 10个共有峰保留时间的 RSD均小于 1. 66% , HPLC色
谱图相似度值均大于 0. 9。
表 2　杏香兔耳风高效液相色谱指纹图谱相似度
样品编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14
相似度 0. 96 0. 94 0. 98 0. 94 0. 91 0. 95 0. 96 0. 98 0. 94 0. 95 0. 96 0. 94 0. 97 0. 95
2033第 4期 吴正平等:杏香兔耳风高效液相色谱指纹图谱研究
4　结论
( 1)实验比较了等度洗脱和梯度洗脱对杏香兔耳风指纹图谱的影响 ,结果发现等度洗脱时 ,改
变流动相的组成或比例只能得到较少的色谱峰。改用梯度洗脱 ,样品中不同极性组分均获得了合适
的保留值。实验证明 ,该方法梯度简单 ,可操作性强 ,重现性好 ,分离度和柱效均令人满意。 实验记
录了 60min色谱图 ,发现 40min后无色谱峰出现 ,故确定采集时间为 40min。
( 2)综合杏香兔耳风药材 HPLC指纹图谱的相对保留时间、相对峰面积以及相似度可以看出 ,
不同来源杏香兔耳风药材样品的指纹图谱整体面貌基本一致 ,反映了不同批次杏香兔耳风药材的
同源性及其群体化学组分的相似性 ,揭示出杏香兔耳风指纹图谱具有自身化学条码特征 ,是其内在
化学成分种类的反映。但同时其共有成分的含量存在较大差异 ,说明不同来源的杏香兔耳风药材内
在质量与产地等因素密切相关。 通过对 14批不同来源杏香兔耳风药材样品的高效液相色谱检测 ,
初步构建了杏香兔耳风 HPLC指纹图谱分析方法 ,杏香兔耳风中有效活性成分能在色谱图中得到
宏观、综合地体现 ,能充分反映杏香兔耳风各化学成分特征。
参考文献
[1 ] 《中华本草》编委会 .中华本草 [M ] .上海:科学技术出版社 , 1999. 6682.
[2 ]张锐 ,曾宪仪 ,张正行 .杏香兔耳风的化学成分研究 [ J ].中草药 , 2006, 37( 3): 347— 348.
[3 ]胡昌奇 ,王朴 ,姚辉农 .杏香兔耳风的化学成分研究 ( I) [ J] .中草药 , 1983, 14( 11): 6— 7.
[4 ]蒋轶伦 ,韩超 ,邱招钗等 .液相色谱指纹图谱在泽泻动态研究中的应用 [ J] .分析试验室 , 2006, 25( 3): 70— 74.
Chromatographic Fingerprint of Ainsliaea Fragrans Champ. by HPLC
WU Zheng-Ping　 LENG Gui-Huaa　 ZOU Sheng-Qina
(Beauty Medical College,Yichun University ,Yichun, Jiang xi 336000,P. R.China)
a (Key Laborator y of J iangx i Province for Research on Active Ingred ients in N atural Med icines ,
College of Chemist ry and B ioen gineer ing of Yichun University ,Yichun , J iang xi 336000, P. R. China )
Abstract　 The chromatog raphic fingerprint of Ainsliaea f ragrans Champ. was established by
HPLC, w hich can be applied for science assessment and control of quality of Ainsliaea fragrans
Champ. . A Kromasil C18 column( 4. 6mm× 250mm, 5μm) w as used with methanol-0. 5% phosphoric
acid w ater solution as the mobile phase in g radient elution 0min( 30∶ 70) -15min ( 30∶ 70) -20min
( 50∶ 50) -40min( 50∶ 50) wi th flow rate of 0. 8mL· min- 1 , and the detection waveleng th was at
350nm with the column temperature of 25℃ . The 10 common peaks were found in the established
ch romatog raphic fingerprint of Ainsliaea f ragrans Champ. , and good similari ties of the
ch romatog raphic fingerprint betw een the various samples and standard fingerprint w as over 0. 9. The
established HPLC chromatog raphic fingerprint has good precision, repeatability and stability , that can
be used for the main quality cont rol of Ainsliaea f ragrans Champ. , meanwhile, provides an
experimental basis for further investigation of quality cont rol of Ainsl iaea f ragrans Champ. .
Key words　 Ainsliaea Fragrans Champ. ; HPLC; Chromatographic Fingerprint; Chlorog enic
Acid; Rutin
2034 光谱实验室 第 28卷