全 文 ：收稿日期:2008-10-10; 修订日期:2009-03-12
基金项目:江西省卫生厅中医药科研课题(No.2006A26)
作者简介:邱如意(1984-),女(汉族),湖南浏阳人 ,现为江西中医学院 2006
级药物化学在读硕士研究生,学士学位,主要从事天然药物研究工作.
大孔树脂分离纯化杏香兔耳风总黄酮的工艺研究
邱如意 , 许 军 , 徐 伟 , 刘燕华
(江西中医学院药物化学学科组 ,江西 南昌 330004)
摘要:目的 从选取的 7种极性不同的大孔树脂中 , 确定分离纯化杏香兔耳风总黄酮的最佳树脂。方法 以杏香兔耳风中
总黄酮的静态吸附和动态吸附的各种参数为指标 , 确定最佳的大孔吸附树脂。结果 在实验条件下 ,综合各种指标 ,发现
AB-8型树脂对杏香兔耳风总黄酮的分离纯化的效果最好。结论 大孔吸附树脂法能有效地分离纯化杏香兔耳风中的
总黄酮 , 且 AB-8型大孔树脂效果最好。
关键词:杏香兔耳风; 黄酮类化合物; 大孔吸附树脂
中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2009)09-2272-02
StudiesonSeparationandPurificationofTotalFlavonoidsfrom Ainsliaeafragrans
ChampbyMacroreticularAbsorptiveResin
QIURu-yi,XUJun,XUWei,LIUYan-hua
(DepartmentofPharmacochemistry, JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine, Jiangxi, Nanchang,
330004, China)
Abstract:ObjectiveToselectthebestresinfrom7diferentpolarmacroporousresins, forseparationandpurificationofAinsli-
aeafragransChampofthetotalflavonoids.MethodsUsingthestaticanddynamicabsorptionparametersoftotalflavonoidsfrom
Ainsliaeofragranschampastheindicators, thebestmacroporousresinwasdetermined.ResultsAB-8resinhadbesteffectfor
separationandpunficationofAinsliaeafragransChamp.ConclusionMacroporousresincanefectivelyseparateandpunifytheto-
talflavonoidsfromAinsliaeafragransChamp, andtypeAB-8 macroporousresinisthemostefective.
Keywords:AinsliaeafragransChamp; Flavonoids; MacroporousResin
杏香兔耳风又名白走马胎 、金边兔耳草 , 为菊科植物铁灯兔
耳风 AinsliaeamacroclinidioidesHay或杏香兔耳风 Ainsliaeafra-
gransChamp.的干燥全草 [ 1] , 主要分布于长江流域一带及西南各
省。具有清热补虚 、凉血止血 、利湿解毒等功效 , 民间全草入药 ,
用于治疗肺结核咳血 、感冒咳嗽 、咽喉疼痛 、跌打损伤 、无名肿毒 、
泌尿疾病 、慢性宫颈炎等。杏香兔耳风全草的主要有效成分为黄
酮类 、有机酸类等化合物 [ 2] 。
大孔吸附树脂起源于 20世纪 70年代 ,是一种具有多孔立体
结构人工合成的聚合物吸附剂 ,利用它巨大的表面积进行物理吸
附 , 在实际应用中对一些与其骨架结构相近的分子如芳香族环状
化合物具有很强的吸附能力 ,广泛应用于制药及天然植物中活性
成分如皂苷 、黄酮 、内酯 、生物碱等大分子化合物的提取分离 [ 3] 。
本实验通过 D101型 、AB- 8型 、HPD-100型 、HPD-400
型 、HPD-417型 、HPD-450型 、HPD-600型 7种大孔吸附树
脂 , 对杏香兔耳风中黄酮类化合物的静态和动态吸附性能进行了
研究 , 以期寻找到对杏香兔耳风黄酮类化合物进行精制纯化的一
种较合适的方法。
1 材料
树脂:D101型 、AB- 8型 、HPD-100型 、HPD-400型 、HPD
-417型 、HPD-450型 、HPD-600型(沧州宝恩化工有限公
司);SartoriusBS110s电子天平;超声波清洗器 HN1003(广州华
南超声设备厂);UV-2401分光光度计(日本岛津公司);QYC-
200全温空气摇床 (上海福玛实验设备有限公司)。芦丁对照品
(中国药品生物制品检定所提供 , 批号 1115382-200301)。
2 方法
2.1 药液的提取 称取一定量杏香兔耳风干燥药材 , 用 70%乙
醇作为溶剂 ,水浴回流提取 3 ～ 4次 , 合并提取液 , 减压浓缩至无
醇味 , 加蒸馏水溶解 , 即得杏香兔耳风样品液。
2.2 总黄酮含量测定
2.2.1 芦丁标准曲线的制备 精确称取芦丁对照品 0.026 40 g,
用 70%乙醇溶解 , 定容至 100 ml, 摇匀 , 配成 0.26 mg/ml的标准
溶液 , 备用。
精密吸取对照品溶液 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ml, 分别置于 25 ml容
量瓶中 ,分别加 70%乙醇至 10 ml,精密加入 5%亚硝酸钠溶液 1
ml, 混匀 ,静置 6 min。精密加入 10%硝酸铝溶液 1 ml, 摇匀后静
置 6 min, 精密加入 4%氢氧化钠溶液 10 ml, 再加 70%乙醇至刻
度 , 摇匀 ,放置 15min。以第 1管作空白在波长 510 m处用紫外
-可见分光光度计测定吸光度 , 以对照品浓度为横坐标 , 吸光度
为纵坐标绘制标准曲线 , 线性范围为 10.56 ～ 63.36 μg/ml, A=
10.799C+0.015 7, R2 =0.997 7。
2.2.2 供试品总黄酮含量的测定 取待测样品两份 , 减压浓缩至
干 , 用甲醇溶解 , 按 “标准曲线的制备”项下标准 , 测定样品的吸
光度值 ,平行测 3次 , 取平均值 , 然后用标准曲线方程计算样品
中总黄酮的含量。
2.3 树脂的预处理 [ 4] 取上述市售新鲜的 7种大孔树脂 , 分别用
95%酒精浸泡数小时 , 用大量蒸馏水洗净。以湿法在搅拌下将树
脂加入到层析柱中 , 等树脂沉降后再将水放出 , 用 95%的乙醇
3BV/h通过树脂层 ,至流出液加适量蒸馏水无白色浑浊现象 , 再
用蒸馏水以同样的流速洗至中性 ,备用。所用树脂的型号及参数
见表 1。
表 1 吸附树脂的型号及物理参数
型号 粒径l/mm
比表面积
A/m2· g-1 平均孔径 外观 极性
HPD-100 0.3～ 1.2 650 ～ 700 85 ～ 90A° 白色不透明球状颗粒 非极性HPD-400 0.3～ 1.2 500 ～ 550 75 ～ 80A° 白色不透明球状颗粒 中极性
HPD-417 0.3 ～ 1.25 90 ～ 150 25 ～ 30 白色不透明球状颗粒 极性
HPD-450 0.3～ 1.2 500 ～ 550 90～ 110A° 白色不透明球状颗粒 弱极性
HPD-600 0.3～ 1.2 550 ～ 600 80A° 白色不透明球状颗粒 极性AB-8 0.3 ～ 1.25 480 ～ 520 130 ～ 140 白色不透明球状颗粒 弱极性
D-101 0.3 ～ 1.25 400 100 ～ 110A°白色不透明球状颗粒 非极性
2.4 树脂的选择 准确称取处理后的 7种大孔树脂湿树脂各 1 g
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 9期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.9
于具塞磨口三角瓶中 ,加入杏香兔耳风样品液 50 ml, 25℃恒温振
荡 24h,振荡频率 140 r/min。过滤 、保留滤液 , 用蒸馏水洗涤树
脂 , 再将树脂浸泡在 70%乙醇中 , 25℃恒温振荡 24 h解吸 , 测定
滤液即吸附上清液和解吸液中总黄酮的浓度。
2.5 静态吸附实验
2.5.1 吸附等温线的建立 准确称取 1 gAB-8湿树脂于具塞
三角瓶中 , 加一定浓度的料液各 50 ml, 于 18, 25, 32℃下静态吸
附 , 每隔 2h取样 0.5 ml,测定各个时段取样液中总黄酮浓度 ,绘
制吸附等温线。
2.5.2 吸附动力学曲线的建立 准确称取 1 gAB-8湿树脂于
具塞三角瓶中 , 加一定浓度的料液各 50 ml, 于 25℃下静态吸附 ,
每隔 2 h取样 0.5ml, 测定各个时段取样液中总黄酮浓度 , 绘制
吸附等温线。
2.5.3 解吸条件优化 [ 5] 称取 8gAB-8树脂于烧杯中 , 加入一
定浓度的料液 400 ml,静态吸附 24 h, 滤出树脂 , 过滤后按质量
平均分成 8份 , 分别置于 8个锥形瓶中 , 各加入 10%, 30%,
50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%的乙醇溶液 , 静态解吸 24
h。抽滤 , 并用各自的洗脱剂冲洗树脂 , 合并入滤液 , 得到洗脱
液 , 测定各自的总黄酮含量 , 并计算解吸量。
2.6 动态吸附实验
2.6.1 上样液浓度的考察 称取 AB-8型树脂 50 g4份 , 湿法
装入 4根 2cm×50cm色谱柱中。选择 4个浓度药液(1.0, 1.8,
3, 4.5mg/ml), 加入量依次为 450, 250, 150, 100 ml, 以 1.5 ml/
min的上样速度 、70%乙醇洗脱 , 洗脱液定容至 450 ml,测定总黄
酮含量后浓缩 , 烘干 ,并称重洗脱物。
2.6.2 上样液 pH值选择 称取 AB-8型树脂 50 g4份 , 分别装
入 4根 2 cm×50cm色谱柱中 , 分别加入 4份 1.8 mg/ml的药液
250 ml, 调 pH值为 4, 5, 6.2(原液)和 8,分别以 1.5ml/min的上
样速度 、70%乙醇洗脱 ,洗脱液定容至 450 ml, 测定总黄酮含量
后浓缩 , 烘干 ,称重洗脱物。选出上样液的 pH值最佳为 6.0。
3 结果
3.1 树脂对杏香兔耳风总黄酮的选择性 本文研究了 7种树脂
对杏香兔耳风总黄酮的选择吸附性。计算公式如下:
吸附量 =V(C0 -C1)/M
吸附率 =[ (C0 -C1)/C0] ×100%
解吸量 =C2 ×V/M
解吸率 =[ C2 /(C0 -C1)] ×100%
式中 C0为吸附前样液中黄酮浓度 , C1为吸附后上清液中黄
酮浓度 , C2为解吸液中黄酮浓度 , V为样液体积 , M为湿树脂质
量。结果见表 2。
表 2 不同树脂对杏香兔耳风总黄酮的吸附和解吸能力
树脂型号 吸附量C/mg· g-1
吸附率
(%)
解吸量
C/mg· g-1
解吸率
(%)
D-101 51.45 61.03 40.59 78.89
HPD-100 55.20 65.48 42.60 77.17
AB-8 68.05 80.72 61.42 90.26
HPD-400 58.12 68.94 48.22 82.98
HPD-450 62.32 73.92 52.62 84.45
HPD-417 48.63 57.68 33.39 68.67
HPD-600 49.82 59.09 34.50 69.25
从表 2可以看出 , AB-8大孔树脂对杏香兔耳风总黄酮的吸
附和解吸能力都最大 ,所以筛选出 AB-8作为本实验的研究 。
3.2 吸附等温线 根据静态吸附实验 , 24h树脂完全达到吸附平
衡 , 根据下式计算出吸附量 q。
q=V0(C0 -C1)/M
式中 , q为吸附量 , mg/g为湿树脂;C0为初始黄酮溶液浓度mg/ml, C1为黄酮溶液的平衡浓度 mg/ml, M为湿树脂的质量 g。
以吸附时间为横坐标 ,吸附量为纵坐标 , 绘制吸附等温线见图 1。
图 1 AB-8对杏香兔耳风总黄酮的吸附等温线
从图 1可以看出 , 树脂在 25℃时的吸附效果最好 , 温度过高
或过低树脂的平衡吸附量均下降。这可能是由于高温时杏香兔
耳风总黄酮的溶解性增加 , 导致树脂对其的吸附能力下降;低温
时的杏香兔耳风总黄酮水溶性降低 , 容易析出而不易被树脂吸
附。
3.3 吸附动力学曲线 吸附动力学特征反映的是随时间的延长 ,
树脂对样品分子吸附量的变化趋势。经过 i次取样后 , 总黄酮浓
度 C与吸附量 q之间的关系可用下式表示:q=(Ci-1 -Ci)(V0-0.5i)/m(i=1-n)
式中 , q为吸附量 , mg· g-1湿树脂;C为异黄酮浓度 , mg·
g-1;m为湿树脂的质量 , g。以吸附时间 h为横坐标 , 剩余浓度 Ci
为纵坐标绘制动力学曲线 ,见图 2。
图 2 25℃时树脂对杏香兔耳风总黄酮吸附动力学曲线
从图 2可以看出 , AB-8树脂对总黄酮的吸附量在 4h内较
大 , 吸附速度快 , 在 4 ～ 6 h内吸附速度慢 , 在 6 h后速度趋于平
缓 , 在 6 h时达到最大吸附。因此静态吸附 6 h即可达到吸附饱
和。
3.4 解吸条件优化 一般地 , 对于非极性树脂 , 洗脱剂的极性越
小 , 洗脱力越强。本实验选择了与环境友好的乙醇水溶液作为洗
脱剂 , 比较不同浓度的乙醇水溶液的洗脱效果 ,通过考察解吸量
来确定洗脱溶剂。不同浓度的乙醇水溶液的洗脱效果见图 3。
图 3 不同醇度的洗脱剂对解吸量的影响
从图 3可以看出 , 当醇度达到 70%时 , 解吸量达到最大 , 因
此可以选择 70%的乙醇作为洗脱剂。
3.5 动态吸附结果
3.5.1 上样液浓度的考察 结果见表 3。
表 3 最佳上样液浓度考察结果
编号 上样液浓度C/mg· g-1
总黄酮含量
m/g
洗脱物重
m/g
纯度
(%)
1 1.0 0.351 2 0.653 4 53.75
2 1.8 0.388 9 0.672 0 57.87
3 3.0 0.354 1 0.661 4 53.53
4 4.5 0.325 6 0.652 8 49.88
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.9 时珍国医国药 2009年第 20卷第 9期
从表 3可以看出 ,上样液浓度为 1.8 mg· g-1时, 洗脱的总黄酮
量最大 ,纯度最高,浓度过高或过低都对总黄酮的洗脱量有影响。
3.5.2 上样液 pH值的确定 (见表 4)。如表 4所示 ,上样液的
pH值对化合物的吸附和分离有一定的影响。在吸附过程中 ,物
质一般以分子状态被吸附剂吸附。结果显示 ,当上样液为原液即
弱酸性时 , 洗脱的总黄酮含量和纯度都最大 , 可能杏香兔耳风的
黄酮类物质大多呈弱酸性 ,在弱酸性状态下呈分子状态被吸附剂
吸附 , 偏酸或偏碱会使物质呈游离状态 , 不利于吸附 ,可能在上样
的时候泄漏下来。
表 4 最佳上样液pH值的考察结果
编号 上样液 pH值 总黄酮含量m/g
洗脱物重
m/g
纯度
(%)
1 4.0 0.332 5 0.648 9 51.24
2 5.0 0.341 6 0.645 8 52.89
3 6.2 0.384 3 0.673 4 57.06
4 8.0 0.314 5 0.661 5 47.54
4 讨论
本实验用 7种树脂进行筛选 , 结果显示 AB-8树脂对杏香
兔耳风总黄酮具有较好的选择吸附性和解吸能力 , 所以选用 AB
-8树脂进行本实验的工艺研究。
纯化杏香兔耳风中总黄酮的最佳工艺条件为:AB-8型大孔
树脂 , 25℃下 , 上样液浓度为 1.8 mg· g-1 , 上样液 pH值为 6.2
(即原液), 静态吸附 6h,用水冲洗水溶性杂质 ,再用 70%乙醇洗
脱 , 洗脱物总黄酮含量可达 57%以上。
参考文献:
[ 1 ] 国家中医药管理局《中华本草 》编委会.中华本草 [ M] .上海:上海
科学技术出版社 , 1999:6682.
[ 2 ] 邢春秀 ,谢 宁 ,杨念云 ,等.杏香兔耳风的化学成分 [ J] .江苏药学
与临床研究 , 2006, 14(2):107.
[ 3 ] 陈凯云 ,杨武亮 ,龚千峰 ,等.大孔吸附树脂富集大蓟中总黄酮类成
分的工艺研究 [ J] .时珍国医国药 , 2007, 18(10):2362.
[ 4 ] 高荣海 ,李长彪 ,刘长江 ,等.大孔吸附树脂对大豆异黄酮吸附性能
的研究 [ J] .食品工业科技 , 2006, 10:49.
[ 5 ] 薛淑萍 ,张立伟.大孔吸附树脂提取 、分离桑叶总黄酮的条件优化
[ J] .山西中医学院学报, 2006, 8(1):51.
收稿日期:2008-10-24; 修订日期:2009-05-16
基金项目:南通大学自然科学基金资助项目(No.07Z028)
作者简介:顾 婕(1985-),女(汉族),江苏南通人 ,现为南通大学生命科
学学院 2008届本科生 ,主要从事微生物发酵工作.
＊通讯作者简介:叶 辉(1964-), 男(汉族),江苏通州人 , 现任南通大学
生命科学学院教授 ,博士学位 ,主要从事微生物转化与微生物药物研究与
教学工作.
海蓬子总黄酮提取工艺优化研究
顾 婕 1 , 杨莉萍1 , 赵微加 1 , 叶 辉1＊ , 张春银 2
(1.南通大学生命科学学院 ,江苏 南通 226007; 2.江苏省盐城市绿苑海蓬子开发有限公司 224000)
摘要:目的 用单因素和正交实验法优选海蓬子中总黄酮的提取工艺。方法 采用乙醇提取工艺 , 对影响黄酮提取得率的
主要因素进行分析 , 用正交实验法确定海蓬子中总黄酮的提取工艺。结果 最佳提取工艺条件:乙醇浓度 70%, 提取时间
120min,固液比 1∶100(g∶ml),提取温度 80℃。在该条件下 , 海蓬子总黄酮得率为 2.86%。结论 该方法是提取海蓬子
中总黄酮的有效途径。
关键词:海蓬子; 黄酮; 乙醇提取
中图分类号:R284.2 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2009)09-2274-02
海蓬子 SalicorniabigeloviTor属于藜科海蓬子属(又译盐角
草属)植物 [ 1] ,直接用海水灌溉。 海蓬子种子含油量约 30%, 其
中不饱和脂肪酸含量高达 90%[ 2, 3] , 其嫩尖组织中的微量皂角
苷 , 可中和人体血液中的脂肪酸 , 降低血管壁上胆固醇 , 具有降
压 、降脂 、减肥作用。在欧洲 , 海蓬子被称为 “减肥草 ” [ 2] 。除含
有人体必需的氨基酸 、微量元素 、维生素外 ,其中的胡萝卜素含量
超过普通蔬菜的 40倍 [ 4] , 可作为绿色有机蔬菜 、保健食品 、保健
油等的原料。栽培海蓬子还有益于改良生态环境 ,它吸收与利用
海水水产养殖池排污物的营养;构建生态湿地 , 为野生禽类提供
食物和栖息地等 [ 5] 。海蓬子在我国江苏 、辽宁 、河北 、山东等省
都有生长 , 多见于盐沼地 、盐湖旁及海滩。从海蓬子中分离得到
槲皮素(quercetin)、槲皮素 -3-O-β -D-葡萄糖苷(quercetin
-3-O-β -D-glucoside)、芸香苷(rutin)、异鼠李素 -3-O-β
-D-葡萄糖苷(isorhamnetol-3-O-β -D-glucoside)等黄酮
类物质 [ 6～ 8] ,但还未见提取工艺研究的报道。为了提高海蓬子中
总黄酮提取工艺的科学性 ,进一步研究和开发利用海蓬子 , 特以
总黄酮为考察指标 , 采用单因素和正交实验法确定最佳的提取条
件。黄酮类化合物多采用水 、乙醇 、丙酮等溶剂提取 ,总黄酮包括
黄酮苷及其苷元 ,黄酮苷易容易水和乙醇 , 但苷元的水溶性差 , 故
本研究以乙醇为提取溶剂。
1 材料与仪器
新鲜海蓬子由江苏省盐城市绿苑海蓬子开发有限公司提供。
全草淋洗沥干后 70℃鼓风烘干 , 粉碎过 60目筛 , 密封于阴暗干
燥处保存备用。芦丁(生化试剂)购自中国医药集团上海化学试
剂公司 , 95%乙醇 、氢氧化钠 、亚硝酸钠 、硝酸铝等均为分析纯。
UV-1200紫外可见分光光度计(上海美普达仪器有限公司)、DK
-600电热恒温水槽(上海精密实验设备有限公司)、电子天平
(赛多利斯科学仪器有限公司)、FZ102微型植物粉碎机(天津市
泰斯特仪器有限公司)。
2 方法
海蓬子总黄酮含量的测定———NaNO2 -Al(NO3)3 比色
法 [ 9] 。
2.1 芦丁标准曲线的绘制 [ 10] 用分析天平称取芦丁标准品
0.025 0g,用 30%的乙醇溶解 , 定容至 100ml, 摇匀 ,得到 0.25mg/
ml的芦丁标准溶液 , 备用。分别准确吸取芦丁标准溶液 1.0 ,
2.0, 4.0 , 6.0 , 8.0 ml于 25 ml的容量瓶中 , 用 30%乙醇补至约
12.5 ml,加入 5%亚硝酸钠 1.0ml, 摇匀 ,放置 5min,加入 10%硝
酸铝溶液 1.0 ml,摇匀 , 放置 6 min。加入 1.0mol/L氢氧化钠溶
液 5ml, 用 30%乙醇定容至刻度 , 摇匀 ,放置 10min。用空白液作
参比 , 用紫外可见分光光度计测定 510 nm处的吸光度。所得标
准曲线为芦丁浓度 Y和吸光值 X的关系 , 所得回归方程为:Y=
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 9期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.9