全 文 ：收稿日期:2014-07-18
基金项目:国家中医药公共卫生专项(201207002) ;陕西省教育厅专项基金(12JS026) ;汉中市科技计划发展项目(2012-46-1)
作者简介:史红艳(1985-) ，女，在读硕士研究生，专业方向:植物天然产物研究;Tel:18292664361，E-mail:shtying@ 126. com。
* 通讯作者:杨培君，Tel:0916-2641661，E-mail:yang@ snut. edu. cn。
流动注射-化学发光法分析苏铁叶黄酮类化合物的研究
史红艳，朱海萍，屈亚娟，杨培君*
(陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001)
摘要 目的:研究苏铁叶黄酮类化合物的流动注射-化学发光分析检测方法。方法:基于碱性条件下，黄酮类化
合物对 Luminol-H2O2-Cu
2 +化学发光体系的抑制作用，结合反相流动注射技术，建立苏铁叶黄酮类化合物的流动注
射-化学发光分析检测方法。结果:发光信号的降低值 ΔI 与黄酮类化合物的质量浓度在 2. 0 × 10 －6 ～ 1. 0 × 10 －3
mg /mL范围内呈线性关系，检出限为 0. 0265 μg /mL。在优化条件下，检测苏铁叶中黄酮类化合物的平均得率为
1. 61%，ＲSD = 1. 32%。结论:通过干扰试验，并与 UV法检测结果比较，表明该方法可用于苏铁叶黄酮类化合物的
分析检测。
关键词 苏铁叶;黄酮类化合物;流动注射-化学发光法
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)03-0481-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 03. 013
Determination of Flavonoids in Cycas revoluta Leaves by Chemiluminescence-Flow
Injection Analysis Method
SHI Hong-yan，ZHU Hai-ping，QU Ya-juan，YANG Pei-jun
(School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，China)
Abstract Objective:To detect flavonoids from Cycas revoluta leaves by means of Chemiluminescence-Flow Injection Analysis
(CL-FIA). Methods:Under alkaline condition，a CL-FIA method was established to determine flavonoids from leaves of Cycas revoluta
on the basis of inhibiting effect of flavonoids to the Luminol-H2O2-Cu
2 + chemiluminescence system and the reversed flow injection tech-
nique. Ｒesults:In the range of 2. 0 × 10 －6 ～ 1. 0 × 10 －3 mg /mL，the decrease of CL intensity was correlated with flavonoids concentra-
tion while the detection limit was 0. 0265 μg /mL. Under the optimized conditions，the flavonoids of Cycas revoluta leaves were detected
with its average rate reaching 1. 61% and ＲSD 1. 32%. Conclusion:Through the interference test and compared with the data of CL-FIA
and UV，it is concluded that CL-FIA can be used in the analysis and detection of flavonoids from Cycas revoluta leaves.
Key words Cycas revoluta Thunb. leaves;Flavonoids;Chemiluminescence-Flow Injection Analysis
苏铁 Cycas revoluta Thunb. 为苏铁科苏铁属常
绿乔木，又名铁树〔1〕。苏铁叶可治疗肺癌〔2〕，具有
潜在的药用开发前景。苏铁叶主要含黄酮类化合
物，目前，分析检测黄酮类化合物的方法主要有 UV
法、荧光法、极谱法、HPLC 法等。流动注射-化学发
光(CL-FIA)法是近年来兴起的一种分析方法，广泛
应用于药品成分检测〔3〕，植物活性成分的检测也有
报道〔4〕。本研究基于 Cu2 +对 Luminol-H2 O2化学发
光体系的增敏作用，建立了苏铁叶黄酮类化合物的
CL-FIA方法。
1 材料与方法
1. 1 材料 实验用苏铁叶于 2014 年 1 月采自陕西
汉中，为栽培植株，经笔者杨培君教授鉴定为苏铁科
植物苏铁 Cycas revoluta Thunb. 的叶。清洗，烘干，
粉碎，过 0. 45 mm孔径筛，备用。
1. 2 试剂与仪器 芦丁对照品溶液(0. 1 mg /mL) :
精密称取芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，
批号:100080-00707)5. 0 mg，用 60%乙醇溶解并定
容至 50 mL，置 4 ℃保存，备用;Na2 CO3溶液(1. 0
mol /L):称取 53. 00 g Na2 CO3用超纯水定容至 500
mL。Luminol储备液(0. 1 mg /mL) :称取 0. 0108 g
Luminol，用 1. 0 mol /L Na2 CO3溶液定容至 100 mL，
置于暗处保存，备用;Cu2 + 储备液(2 × 10 －2 mg /
mL) :移取 1. 0 mL铜标准溶液(天津傲然精细化工
研究所，批号:20110519)用超纯水定容至 50 mL，备
用;H2O2溶液(1. 0 mol /L) :由 H2O2(10. 0 mol /L)以
超纯水稀释而成，现配现用。其他试剂均为分析纯，
水为自制超纯水。
IFFM-E流动注射-化学发光分析仪(西安瑞迈
分析仪器有限公司);IFFM-A 多功能化学发光检测
器(西安瑞迈分析仪器有限公司) ;UV-2550 紫外可
见分光光度计(日本岛津公司);AL204 电子天平
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［梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，精密度
0. 0001 g］;UPH-Ⅱ-40 优普超纯水机(成都超纯科
技有限公司) ;BOMEX GG-17 型索氏提取器。
1. 3 方法
1. 3. 1 供试品溶液的制备:准确称取苏铁叶干燥
粉末 2. 0 g，加入 70%乙醇 50 mL，在 80 ℃热水中回
流提取 1. 5 h，重复提取 3 次，抽滤，合并滤液，浓缩，
用 60%的乙醇定容至 100 mL，备用。
1. 3. 2 CL-FIA法检测分析设计:依次取一定量芦
丁对照品溶液(0. 1 mg /mL)分别稀释至 2. 0 × 10 －6、
2. 0 × 10 －4、6. 0 × 10 －4、8. 0 × 10 －4、1. 0 × 10 －3 mg /
mL。打开蠕动泵，使仪器预热 30 min，分别将 Lumi-
nol溶液、H2O2 溶液、金属离子溶液泵入流通池中，
待基线稳定后进样，产生的化学发光信号由 IFFM-E
型流动注射-化学发光分析仪检测，电脑记录实验数
据。
准确移取供试品溶液 5. 0 mL，用超纯水定容至
50 mL。按上述 CL-FIA法进行检测，根据公式计算
供试品溶液中黄酮类化合物的得率。
黄酮类化合物得率(%)= C × Vw × ρ × 100
式中:C为供试品溶液浓度，μg /mL;V 为供试品溶液体
积，mL;w为供试材料重量，μg;ρ为供试品溶液的稀释倍数。
1. 3. 3 UV法检测分析设计:精密吸取一定浓度的
芦丁对照品溶液 0. 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 mL 分
别置 10 mL量瓶中，加入 0. 5 mol /L NaNO2溶液 0. 3
mL，摇匀，放置 6 min;然后加入 0. 3 mol /L Al
(NO3)3溶液 0. 3 mL，摇匀，放置 6 min;再加入 1. 0
mol /L NaOH溶液 4. 0 mL，用 60%乙醇稀释至 10. 0
mL，放置 15 min。用试剂做空白，UV 法检测吸光
度。
准确移取供试品溶液 1. 0 mL于 10 mL量瓶中，
按上述 NaNO2-Al(NO3)3显色方法显色后测定吸光
度，根据回归方程计算供试品溶液浓度，并计算黄酮
类化合物的得率。
2 结果与分析
2. 1 CL-FIA法检测结果及分析
2. 1. 1 化学发光动力学性质:本试验所建立的 Lu-
minol-H2O2-Cu
2 +体系中，化学发光动力学曲线表明，
Cu2 +对 Luminol-H2O2体系的化学发光有增敏作用，约
3. 8 s后达到最大值，又经 11. 6 s衰减到极限(图 1)，
加入芦丁后体系化学发光强度明显减弱(图 2)。
2. 1. 2 流路及参数选择:参照方肇伦等〔5〕的基本
FIA流路，比较不同流路对化学发光强度的影响。
试验发现，当主蠕动泵注入 Luminol溶液和超纯水，
图 1 Luminol-H2O2-Cu
2 +体系的发光动力学曲线
图 2 芦丁对 Luminol-H2O2-Cu
2 +体系的抑制作用
副蠕动泵注入 H2O2 溶液和金属离子时体系的发光
强度最大，且信号稳定。
此外，考察了泵速和负高压对发光强度的影响，
经过多次测试及比较，确定适宜的泵速条件为主泵
1. 34 mL /min，副泵 2. 68 mL /min，泵运行时间 20 s;
最佳负高压为 600 V，增益为 1。
2. 1. 3 介质选择:分别以 0. 1 mol /L 的 Na2 CO3，
NaHCO3和 NaOH及超纯水为反应介质，考察各介质
对化学发光强度的影响。结果表明，在超纯水介质
中化学发光强度最大，且信号稳定，故选超纯水为反
应介质。
2. 1. 4 Luminol 浓度的选择:固定其他条件，考察
Luminol浓度(1. 2 × 10 －5 ～ 4. 8 × 10 －5 mg /mL)对发
光强度的影响，发光强度随 Luminol 浓度增加而增
强，当 Luminol 浓度为 3. 6 × 10 －5 mg /mL 时发光强
度不再增强，继续增加其浓度发光强度反而减弱
(图 3)。所以，选取 Luminol 的最佳浓度为 3. 6 ×
10 －5 mg /mL。
图 3 Luminol浓度对体系发光强度的影响
·284· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 3 期 2015 年 3 月
2. 1. 5 H2 O2浓度的选择:固定其他条件，改变
H2O2 的浓度(1. 0 × 10
－2 ～ 10 × 10 －2 mol /L) ，测试
结果表明，随 H2O2 浓度的增加，发光强度先增强，
后趋于平稳，最后减弱(图 4)，所以选取 3. 0 × 10 －2
mol /L为 H2O2 的最佳浓度。
图 4 H2O2浓度对体系发光强度的影响
2. 1. 6 金属离子及其浓度的选择:体系中分别加
入等量同浓度的 Mg2 +、Mn2 +和 Cu2 +溶液，研究不同
金属离子对化学发光强度的影响。结果表明 Cu2 +
对发光强度影响最大，故选取 Cu2 +作为该体系的增
敏剂。
固定其他条件不变，改变 Cu2 + 的浓度(2. 0 ×
10 －4 ～ 100 × 10 －2 mg /mL) ，测试结果表明，随着
Cu2 +浓度增大，发光强度逐渐增强，当浓度为 4. 0 ×
10 －3 mg /mL时发光强度最大，继续增大 Cu2 +浓度，
发光强度反而减弱(图 5)。故选取 4. 0 × 10 －3 mg /
mL为 Cu2 +的最佳浓度。
图 5 Cu2 +浓度对体系发光强度的影响
2. 1. 7 标准曲线、精密度和检出限:以芦丁对照品
溶液的浓度 C 为横坐标，空白体系的发光强度和加
入芦丁对照品溶液后的发光强度的差值 ΔI 为纵坐
标，绘制标准曲线。结果表明，芦丁对照品溶液浓度
在 2. 0 × 10 －6 ～ 1. 0 × 10 －3 mg /mL 范围内与发光强
度呈线性关系，回归方程 ΔI = 9. 8498C － 107. 54，r
= 0. 9993。
根据 IUPAC建议，对 1. 0 × 10 －6 mg /mL芦丁对
照品溶液平行测定 11 次，ＲSD 为 3. 57%，表明仪器
的精密度良好;检出限为 0. 0265 μg /mL。
2. 1. 8 干扰试验:为了评价方法的选择性，在最优
条件下，以发光强度相对误差的绝对值≤5%计，对
1. 0 × 10 －6 μg /mL 芦丁对照品溶液进行干扰性考
察。研究结果表明，1 000 倍的 CaCl2和 K2 SO4;800
倍的淀粉、糊精;300 倍的聚乙二醇、山梨醇;100 倍
的甘露醇;1 倍的蔗糖、葡萄糖;0. 5 倍的 VC均不产
生干扰。说明本试验建立的化学发光体系抗干扰能
力强。
2. 1. 9 样品的 CL-FIA 法分析结果及加样回收率
试验:准确移取供试品溶液 5. 0 mL，用超纯水定容
至 50 mL，分别将 3. 6 × 10 －5 mg /mL Luminol 溶液、
3. 0 × 10 －2 mol /L H2O2 溶液、4. 0 × 10
－3 mg /mL
Cu2 +溶液泵入流通池中，待基线稳定后，按“1. 3. 2”
项下方法检测，计算黄酮类化合物的平均得率为
1. 61%，ＲSD为 1. 29%(表 1)。测定 3 组加对照品
的样品，每组平行测定 3 次，得每组测定的平均值，
计算平均加样回收率为 99. 7%，ＲSD 为 0. 48%，表
明该方法的准确度较好。
表 1 化学发光法检测苏铁叶黄酮类化合物的得率
样品批次 浓度 /(μg /mL)得率 /% 平均得率 /% ＲSD /%
1 32. 6 1. 63 1. 61 1. 29
2 32. 4 1. 62
3 31. 8 1. 59
2. 2 UV法检测结果及分析
2. 2. 1 标准曲线、精密度和稳定性:在最佳试验条
件下，相对发光强度与芦丁对照品溶液的浓度在 0
～ 60 μg /mL 范围内呈线性关系，回归方程 Y =
11. 543X + 0. 0677，r = 0. 9998。
对 4. 0 × 10 －5 mg /mL的芦丁对照品溶液平行测
定 6 次，所得 ＲSD 为 2. 0%，表明仪器的精密度良
好。
稳定性试验发现，测试时间在 30 min 内所得试
验结果相对稳定，超过 30 min 对试验结果的稳定性
有一定的影响，故样品的分析测试应在 30 min 内完
成。
2. 2. 2 样品的 UV法分析结果及加样回收率试验:
准确移取供试品溶液 1. 0 mL，按照“1. 3. 3”项下方
法检测样品，计算黄酮类化合物的平均得率为
1. 60%，ＲSD为 2. 20%(表 2)。测定 3 组加对照品
的样品，每组平行测定 3 次，得每组测定的平均值，
计算平均加样回收率为 98. 3%，ＲSD 为 2. 56%，表
明该方法的准确度较好。
3 讨论
不同的药品或植物活性组分需筛选相应的化学
发光体系，而不同的化学发光体系最适合的氧化剂
·384·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 3 期 2015 年 3 月
表 2 UV法检测苏铁叶黄酮类化合物的含量
批次 浓度 /(μg /mL) 得率 /% 平均得率 /% ＲSD /%
1 32. 8 1. 64 1. 61 1. 86
2 32. 1 1. 61
3 31. 5 1. 58
也不同。白瑞霞等〔6〕利用在碱性条件下，KMnO4 能
氧化 Luminol产生化学发光，芦丁对 Luminol-KMnO4
体系有强烈增强作用，建立了 CL-FIA法测定芦丁的
新方法，检出限为 8. 3 × 10 －10 g /mL。KMnO4 是一
种极强的氧化剂，可以氧化许多物质，但由于其发光
强度微弱，常难以采用普通的光电转换装置获得有
分析价值的信号。上官小东等〔7〕基于在碱性条件
下，银杏黄酮对 ClO － -Luminol 体系显著的抑制作
用，建立了流动注射抑制化学发光分析法测定银杏
提取物中的银杏黄酮，检出限为 0. 06 μg /mL，该体
系的氧化剂是 NaClO。Cai 等〔8〕基于在强碱性介质
中，硫酸链霉素能增强铁氰化钾氧化 Luminol 产生
化学发光，建立了一种快速测定硫酸链霉素的流动
注射-化学发光法，检出限为 0. 6 μg /mL，该体系的
氧化剂是 K3Fe(CN)6。
Luminol可与多种氧化剂反应，产生化学发光现
象。本研究采用 Luminol化学发光体系检测苏铁叶
黄酮所选氧化剂是 H2O2，因为 H2O2 作氧化剂化学
发光强度大且体系信号稳定。邵晓东等〔9〕认为，
H2O2 反应产物没有污染，价格低廉，是 Luminol 化
学发光反应中最理想的氧化剂。目前，Luminol-
H2O2 化学发光体系应用最为广泛，但 Luminol-H2O2
化学发光体系反应相当缓慢，需加入适合的催化剂
来提高反应速率;过渡金属离子对 Luminol-H2O2 化
学发光体系反应有很好的催化作用。经研究发现，
检测苏铁叶黄酮的 Luminol-H2O2 化学发光体系选
用 Cu2 +作为增敏剂效果最好。
本研究基于 H2O2 可以氧化 Luminol 产生弱化
学发光，Cu2 +对该发光信号有增敏作用，据此建立
了 Luminol-H2O2-Cu
2 +体系检测苏铁叶黄酮的 CL-
FIA方法。在最佳试验条件下，体系的化学发光强
度最大，其质量浓度在 2. 0 × 10 －6 ～ 1. 0 × 10 －3 mg /
mL范围内与发光强度呈线性关系，检出限为
0. 0265 μg /mL。与文献〔7，8〕报道的化学发光体系相
比较，检出限相对较低，表明方法的灵敏度高。样品
的平均得率为 1. 61%，ＲSD 为 1. 32%。与 UV 法相
比较，CL-FIA法检测准确度一致。
参 考 文 献
［1］郑万钧，傅立国 . 中国植物志［M］．第 7 卷 . 北京:科学
出版社，1978:7.
［2］孔繁翠，顾昊，王鹤尧，等 . 铁树提取物对人肺腺癌细胞
凋亡的诱导及相关机制的初步研究［J］． 中国新药杂
志，2008，17(8):667-672.
［3］薛冰纯，王滔，刘二保 . 流动注射化学发光法在药物分
析中的应用［J］．光谱学与光谱分析，2006，26(5):816-
820.
［4］邱化敏，李彦霖，卢福广，等 . 流动注射化学发光法测定
槐米中槲皮素［J］．理化检验(化学分册)，2012，48(3) :
287-289，292.
［5］方肇伦 . 流动注射分析方法［M］． 北京:科学出版社，
1999:45-49.
［6］白瑞霞，宋素异 . 鲁米诺-高锰酸钾化学发光法测定芦
丁片中芦丁的含量［J］． 中国药房，2013，24(5):460-
462.
［7］上官小东，王福生，郎惠云 . ClO － -鲁米诺流动注射-抑
制化学发光法测定银杏黄酮［J］．分析试验室，2005，24
(3) :23-26.
［8］ Cai FC，Huang YM，Zhang ZJ. Chemiluminescent determi-
nation on a luminol reaction of streptomycin sulfate by flow
injection analysis［J］． Journal of Southwest China Normal
University(Natural Science) ，2004，29(1) :79-83.
［9］邵晓东，李瑛 . 鲁米诺化学发光分析法研究进展［J］．
化学研究，2010，21(1):102-112.
·484· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 3 期 2015 年 3 月