全 文 ：第 45 卷第 5 期
2015 年 5 月
日 用 化 学 工 业
China Surfactant Detergent ＆ Cosmetics
Vol． 45 No． 5
May 2015
收稿日期:2015 － 01 － 08;修回日期:2015 － 05 － 06
基金项目:国家自然科学基金资助项目(21401028);揭阳市产学研结合项目(201429)
作者简介:梁 青(1989 －)，女，安徽人，硕士研究生，电话:15622103596，E － mail:farewellqing@ 163． com。
通讯联系人:施庆珊，研究员，电话:(020)87136652，E － mail:shiqingshan@ hotmail． com。
山苍子油成分分析及其对日化产品腐败菌的
抑制效果研究
梁 青，李文茹，施庆珊，章卫民
(广东省微生物研究所 广东省微生物分析检测中心 华南应用微生物国家重点实验室
广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东 广州 510070)
摘要:通过水蒸气蒸馏法提取山苍子油，采用气相色谱 －质谱联用仪(GC － MS)分析其化学成分，并用琼脂平板法测定
最低抑制浓度(MIC)以研究山苍子油对 3 株从日化产品中分离的腐败细菌的抑菌效果，同时根据 16S rＲNA序列的系统
进化树对 3 株菌进行菌株鉴定。结果表明:山苍子油主要成分是 D －柠檬烯(w = 26. 51%)、柠檬醛(w = 11. 94%)和马
鞭烯醇(w = 11. 84%);3 株菌均为革兰氏阳性菌，分别命名为解淀粉芽孢杆菌 GLM 50、萎缩芽孢杆菌 GLM 56 和溶血葡
萄球菌 GLM 57;琼脂平板法表明山苍子油对 3 株菌的最低抑制浓度分别为 0. 045，0. 09 和 0. 18 g /L。
关键词:山苍子油;气质联用;菌株鉴定;腐败菌抑制
中图分类号:TQ047. 6 文献标识码:A 文章编号:1001 － 1803(2015)05 － 0260 － 05
DOI:10． 13218 / j． cnki． csdc． 2015． 05． 005
Analysis of components in Litsea cubeba oil and their effect for
inhibition of putrilage bacteria in daily chemical products
LIANG Qing，LI Wen － ru，SHI Qing － shan，ZHANG Wei － min
(Guangdong Institute of Microbiology，Guangdong Detection Center of Microbiology，State Key Laboratory of
Applied Microbiology Southern China，Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial
Culture Collection and Application，Guangzhou，Guangdong 510070，China)
Abstract:Litsea cubeba oil was obtained by steam distillation of fruit of Litsea cubeba (Lour．)Pers． and their
components were identified by gas chromatography /mass spectrometry (GC － MS)． Examination of inhibition
effect of Litsea cubeba oil against three strains of bacterium isolated from daily chemical products was based on
data of minimum inhibitory concentrations (MICs)determined by agar plane dish test． Meanwhile，the three
strains of bacterium were appraised in accordance with 16S rＲNA sequence analyses to determine their
phylogenetic positions． Ｒesults showed that the main constituents of Litsea cubeba oil are D － limonene (w =
26. 51%)，citral (w = 11. 94%)and verbenol (w = 11. 84%)． All the three strains belong to gram － positive
bacteria and are classified as Bacillus amyloliquefaciens subsp． plantarum GLM 50，Bacillus atrophaeus GLM 56
and Staphyococcus haemolyticus GLM 57 respectively． The MICs of Litsea cubeba oil against GLM 50，GLM 56
and GLM 57 are 0. 045，0. 09 and 0. 18 g /L respectively．
Key words:Litsea cubeba oil;GC － MS;strain appraisal;antibacterial activity
近年来，随着人们生活水平的不断提高，人们的健
康与安全意识日益增强［1］。植物提取物作为天然活
性物质，在农业、医药、日用化学工业及食品工业等领
域的应用日渐广泛［2］。现已发现许多木本植物中含
有多种活性物质，其潜在的应用价值亟待开发［3 － 12］。
山苍子(Litsea cubeba (Lour．)Pers．)为樟科木姜
子属，分布于我国长江以南的广西、广东、福建、江西、
江苏、浙江、湖南、云南、贵州以及四川等省［13］。在我
国山苍子属乔木类中草药，用于治疗胃病、关节炎和溃
疡症［14］。山苍子的药理作用包括镇痛、治疗风湿、抗
·062·
第 5 期 梁 青，等:山苍子油成分分析及其对日化产品腐败菌的抑制效果研究 开发与应用
哮喘和抗氧化。山苍子油是良好的增稠剂，精制的山
苍子油具有新鲜柠檬果香味，可直接用于糖果糕点、口
香糖、冰淇淋、饮料、酱类调味品、调味油及焙烤食品等
中。此外，山苍子油还可用作香料的原材料、食品的增
香剂及天然防腐保鲜剂［15，16］。研究发现山苍子油对
多种霉菌具有较强的抗菌效力［17 － 20］，且其对细菌也有
较好的抗菌活力［6］，作为潜在新型天然防霉抗菌剂，
未来可应用于各大工业领域。笔者从日化企业腐败物
中分离菌株，通过水蒸气蒸馏法提取山苍子油并研究
其抗菌效应，以期为工业生产提供一种可备选的天然
芳香型防霉抗菌剂。
1 实验部分
1. 1 主要试剂与仪器
山苍子果实，安徽亳州新源堂药材店;菌株分离自
佛山市南荘化南粘胶厂污染淀粉水及胶粘剂样品;16S
rＲNA通用引物，Takara 公司，上游引物 16S rＲNA F:
5 － AGAGTTTGATCATGGCTCAG － 3;下游引物 16S
rＲNA Ｒ:5 － TAGGGTTACCTTGTTACGACTT －3。
Ultrospec 6300 pro 紫外分光光度计，General
Electric公司;5415 台式微量离心机、Mastercycler
5333PCＲ 仪，Eppendorf 公司;BX53 光学显微镜，
Olympus公司;SHP －250 恒温培养箱、OLS 200 水浴培
养箱，广东环凯生物科技有限公司;Trace GC － DSQ气
质联用仪，Thermo Finnigan公司;TC － 15 套式恒温器，
新华医疗器械厂;CD97 － 308 食物搅拌机，顺德市肯德
立电器实业有限公司。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 琼脂糖凝胶的配制
取 1 g西班牙琼脂糖，用超纯水定容至 100 mL，微
波加热至沸腾使琼脂糖完全溶解，并于室温降温 5 min
后加入 1 μL新型核酸燃料 Goldview，充分摇匀即可。
1. 2. 2 培养基配方
菌株分离使用胰蛋白胨大豆(TSA)培养基，细菌
分离纯化后，用营养肉汤 (MHB)培养基进行液体培
养，精油抑菌实验使用吐温 80 － 营养肉汤琼脂
(MHA)培养基。3 种培养基配方列于表 1，调节 pH =
7. 3 ± 0. 2。
表 1 实验用 3 种培养基配方
Tab. 1 Composition of three kinds of culture medium
TSA培养基
成分 ρ /(g·L －1)
MHB培养基
成分 ρ /(g·L －1)
吐温 80 － MHA培养基
成分 ρ /(g·L －1)
胰蛋白胨 15 牛肉浸出粉 3 牛肉浸出粉 3
大豆蛋白胨 5 可溶性淀粉 1. 5 可溶性淀粉 1. 5
氯化钠 5 酪蛋白酸水解物 17. 5 酪蛋白酸水解物 17. 5
琼脂 15 吐温 80 0. 00054
琼脂 15
1. 2. 3 山苍子油的提取及 GC －MS分析
山苍子油的提取:采用传统的水蒸馏装置，取山苍
子 90 g粉碎至粉末状，加入 450 mL蒸馏水混合摇匀，
在电加热装置中于 120 ℃蒸馏 4 h，用接收管收集山苍
子油。
山苍子油成分分析(GC － MS):色谱柱为 DB －
5 ms;色谱条件:初始温度 60 ℃ 保持 2 min，再以
10 ℃ /min的速度上升至 220 ℃，保持 15 min，载气为
He，流速为 1. 0 mL /min;分流进样，分流比为 1∶ 50;进
样口温度从 70 ℃升温至 250 ℃;电离方式为 EI，离子
源温度 200 ℃，四级杆扫描范围为 m/z = 30 ～ 450，传
输线温度 250 ℃。将样品的质谱与 National Institute of
Standards and Technology (NIST)质谱中的标样进行
比对。
1. 2. 4 腐败菌的分离纯化
从佛山市南荘化南粘胶厂取污染淀粉水及胶粘剂
样品进行无菌水梯度稀释，稀释梯度为 1 × 10 －1 ～ 1 ×
10 －7，将不同稀释度的菌液分别涂布在 TSA 培养基
上，在 37 ℃下培养 2 d，挑选不同形态的单菌落进行平
板划线再次分离，直至显微镜下观察的菌体形态一致，
用体积分数为 30%的甘油保存菌种。
1. 2. 5 菌株分子生物学鉴定
分离筛选的 3 株供试菌分别培养于 MHB 培养基
中，37 ℃摇床培养 12 h 后离心收集菌体，在沸水浴中
煮沸 15 min，速冻到 － 20 ℃保持 20 min。离心取上清
液，即为 DNA提取液，采用 16S rＲNA通用引物 50 μL
反应体系进行 PCＲ反应扩增，具体体系和参数见表 2
与表 3。
将扩增样品送至深圳华大基因科技有限公司测
序。测序结果拼接后与基因库(GenBank)核酸序列数
据库中的序列进行同源性比对，用 MEGA5. 0 软件构
建系统进化树。
·162·
开发与应用 日 用 化 学 工 业 第 45 卷
表 2 PCＲ反应体系
Tab. 2 PCＲ reaction system
PCＲ体系 体积 /μL
10 × PCＲ 缓冲体系 5
dNTP混合体系(2. 5 mmol) 各 4
上下游引物 各 1
DNA模板 各 2
双蒸水 补足至 50
表 3 PCＲ参数设置
Tab. 3 PCＲ parameter settings
参数 /℃ 时间
95 4 min
94 50 s
94 40 s
72 1. 5 min循环 30 次
72 10 min
1. 2. 6 琼脂平板法测定最低抑制浓度
菌悬液制备:将分离菌株分别接种在吐温 80 －
MHA斜面培养基上，37 ℃下培养 24 h，分别挑取一环
接种在 MHB液体培养基上，37 ℃水浴，100 r /min 培
养4 ～ 8 h，离心，菌体用已灭菌的磷酸盐缓冲液洗 2 遍
并稀释至 1 × 106 CFU /mL，待用。
琼脂平板法:微波加热已灭菌的吐温 80 － MHA
培养基，在无菌条件加入一定体积的山苍子油使其终
质量浓度分别为 0，0. 045，0. 09，0. 18 和 0. 36 g /L。并
将配制好的菌悬液混匀各取100μL加入一次性平皿中。
待吐温 80 － MHA培养基冷却到 45 ℃，倒入已加好菌
液的平皿中轻摇混匀，凝固后置于 37 ℃恒温培养箱中
观察 7 d，选择每米平均菌落数不大于 10 个的平皿作
为标准，测定最低抑制浓度，每组实验重复 3 次。
2 结果与讨论
2. 1 山苍子油主要化学成分分析
利用水蒸馏提取法提取山苍子油，并利用 GC －
MS进行成分分析，得到分析谱图如图 1 所示，与 NIST
质谱标样比对后结果列于表 4。
图 1 水蒸气蒸馏法提取山苍子油的 GC － MS谱图
Fig. 1 GC － MS result of Litsea cubeba oil obtained by
steam distillation method
表 4 山苍子油成分分析
Tab. 4 Analysis of main chemical constituents of Litsea cubeba oil by GC － MS
序号 t(保留)/min 化合物 分子式 w /%
1 3. 79 香叶烯 C9H16 0. 02
2 4. 09 蒈烯 C10H16 0. 74
3 4. 32 萜品烯 C10H16 5. 75
4 4. 94 2 －莰烯 C10H16 1. 35
5 5. 58 皮蝇磷 C10H16 4. 03
6 5. 73 3 －亚甲基 － 6 －(1 －甲基乙基)环己烯 C10H16 2. 47
7 6. 28 β －蒎烯 C10H16 2. 35
8 7. 11 D －柠檬烯 C10H16 26. 51
9 7. 19 桉叶油醇 C10H18O 2. 12
10 8. 01 邻异丙基甲苯 C10H14 1. 27
11 8. 94 甲基庚烯酮 C8H14O 2. 80
12 9. 78 3 －甲基 － 5 －异丙基苯基 － N －甲基氨基甲酸酯 C12H17NO2 0. 72
13 11. 21 α －蒎烯 C15H24 1. 71
14 11. 62 芳樟醇 C10H18O 5. 55
15 12. 54 4 －萜烯醇 C10H18O 1. 85
16 12. 70 长叶烯 C15H24 4. 17
17 13. 65 马鞭烯醇 C10H16O 11. 84
18 14. 26 柠檬醛 C10H16O 11. 94
19 15. 22 D －香芹醇 C10H16O 1. 15
20 17. 20 2，2，7，7 －四甲基 － 5，6 －环氧三环［2. 2. 1. 01，6］十一烷 C15H24O 3. 47
21 18. 39 桉油烯醇 C15H24O 0. 76
22 19. 83 正癸酸 C10H20O2 2. 38
23 20. 86 (E)－ 3，7 －二甲基 － 2，6 －辛二烯酸乙酯 C12H20O2 1. 34
24 23. 51 月桂酸 C12H24O2 3. 64
其他 0. 07
·262·
第 5 期 梁 青，等:山苍子油成分分析及其对日化产品腐败菌的抑制效果研究 开发与应用
由图 1 可以看出，出峰面积与峰值和出峰的停留
时间有关，在 4. 32，7. 11，11. 62，13. 65 和 14. 26 min时
其峰面积相对较大，对应的物质含量较高。含量从高
到低分别为 D －柠檬烯(w = 26. 51%)、柠檬醛(w =
11. 94%)、马鞭烯醇(w = 11. 84%)、萜品烯(w =
5. 75%)和芳樟醇(w = 5. 55%)。整理后的结果见表
4，所得到的化合物中有 23 种的含量相对较高。
成分分析结果表明，山苍子油主要成分为 D －柠
檬烯、柠檬醛和马鞭烯醇，3 种成分的总质量分数为
50. 29%。其他成分如萜品烯、2 －莰烯、皮蝇磷、3 －亚
甲基 － 6 －(1 －甲基乙基)环己烯、β －蒎烯、α －蒎烯、
长叶烯等烯类总质量分数为 21. 83%;芳樟醇、4 －萜
烯醇、D － 香芹醇、桉油烯醇等醇类总质量分数为
9. 31%;甲基庚烯酮、正癸酸和月桂酸分别为 2. 80%，
2. 38%和 3. 64%。有研究表明柠檬醛、柠檬烯、芳樟
醇等具有很强的抑菌杀菌活性［23］，其他烯类和醇类等
成分常作为合成香料、除臭剂或食用香精香料的原料。
2. 2 菌株的形态学特征
对 3 株菌分别进行革兰氏染色观察，结果如图 2
所示，通过革兰氏染色发现分离的 3 株菌株均为革兰
氏阳性菌，分别命名为 GLM 50，GLM 56 和 GLM 57。
由革兰氏染色结果可以看出，GLM 50 和 GLM 56 为杆
菌，GLM 57 为球菌。在 MHA 培养基中生长 1 d 后发
现，GLM 50 在培养基上呈乳白色，菌落光滑，透明，正
反面一致;GLM 56 在培养基上呈米白色，半透明，菌落
边缘呈绒毛状，正反面一致;GLM 56 在培养基上呈淡
黄色，半透明，菌落边缘呈细齿状，正反面一致。
图 2 3 株分离自日化企业污染物的菌株革兰氏染色图
Fig. 2 Gram stain of three selected strains isolated from contaminated daily chemical products
2. 3 菌株的分子生物学鉴定
扩增产物经琼脂糖电泳检测，条带清晰单一，DNA
提取成功。3 株分离菌所扩增的 16S rＲNA 基因序列
长度分别为:GLM 50，1 455 bp;GLM 56，1 454 bp;GLM
57，1 454 bp。通过 BLASTn 进行序列同源性分析，结
果如图 3，4 和 5 所示。
由图 3 可知，GLM 50 与解淀粉枯草芽孢杆菌属
16S rＲNA 序列最相似，与 Bacillus amyloliquefaciens
subsp． plantarum FZB42T /CP000560 碱基相似性达
100%。由图 4 可知，GLM 56 与萎缩芽孢杆菌属 16S
rＲNA 序列相似性最高，与 Bacillus atrophaeus JCM
9070T /AB02118 碱基相似性达 99%。由图 5 可知，
GLM 57 与溶血葡萄球菌属 16S rＲNA 序列相似性最
高，与 Staphyococcus haemolyticus ATCC 29970T /L37600
碱基相似性高达 100%。综合分子生物学鉴定结果，
将分离菌分别命名为 Bacillus amyloliquefaciens subsp．
plantarum FZB42T /GLM 50，Bacillus atrophaeus JCM
9070T /GLM 56 和 Staphyococcus haemolyticus ATCC
29970T /GLM 57。解淀粉芽孢杆菌属可污染酒精消毒
液、潮湿的房屋、食品等，还可引起婴幼儿等免疫低下
的人群感染［24］。致病性溶血葡萄球菌含杀白细胞素、
葡萄球菌溶血素、肠毒素和表皮溶解毒素等，对人类健
康有很大的威胁［25］。
图 3 依据 16S rＲNA基因序列构建 GLM 50 相关菌种的系统发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree of GLM 50 and related bacterial species
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开发与应用 日 用 化 学 工 业 第 45 卷
图 4 依据 16S rＲNA基因序列构建 GLM 56 相关菌种的系统发育树
Fig. 4 Phylogenetic tree of GLM 56 and related bacterial species
图 5 依据 16S rＲNA基因序列构建 GLM 57 相关菌种的系统发育树
Fig. 5 Phylogenetic tree of GLM 57 and related bacterial species
2. 4 山苍子油对菌株的最低抑制浓度
采用琼脂平板法对 3 株菌株培养 7 d 后观察发
现，山苍子油对 3 株不同腐败菌均表现出优良的抗菌
活性，其中 GLM 50 对山苍子油最为敏感，当山苍子油
质量浓度达到 0. 045 g /L 时，平板上没有任何菌落生
长;当山苍子油质量浓度达到 0. 045 g /L 时，GLM 56
菌落数较不加精油组降低了 2 个数量级，在山苍子油
质量浓度达到 0. 09 g /L 时平板上菌落的生长被完全
抑制;而 GLM 57 属于球菌，对山苍子油的耐受性比前
2 个杆菌要强一些，在精油质量浓度达到 0. 18 g /L时，
平板上的菌落才彻底停止生长，结果如表 5 所示。
表 5 山苍子油对 3 株分离菌的最低抑制浓度
Tab. 5 Minimum inhibitory concentrations (MICs)of Litsea
cubeba oil against GLM 50，GLM 56 and GLM 57
实验
菌株
ρ /(g·L －1)
0 0. 045 0. 09 0. 18 0. 36
MIC /
(g·L －1)
GLM 50 + － － － － 0. 045
GLM 56 + + － － － 0. 09
GLM 57 + + + － － 0. 18
注:“ +”表示 MHA培养基中有菌落生长;“ －”表示 MHA培养基
中未出现菌落。
山苍子油对 GLM50，GLM56 和 GLM57 的最低抑
制浓度分别为 0. 045，0. 09 和 0. 18 g /L，对 3 株分离菌
均表现出较强的抗菌活性。虽然山苍子油对 3 株菌的
抑菌机理还不清楚，但笔者与文献［25］中做过的山苍
子油对大肠杆菌标准株 ATCC 8739 抗菌实验相比，相
对大肠杆菌等细菌表现出更强的抗菌活性［26］。
3 结论
山苍子油中主要成分是 D －柠檬烯、柠檬醛和马
鞭烯醇，总质量分数为 50. 29%。抗菌实验表明，山苍
子油具有优良的抗菌活性，其对 3 株菌的最低抑菌浓
度分别为 0. 045，0. 09 和 0. 18 g /L。因此，山苍子油可
作为天然抗菌剂用于未来的日化产品中。
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(下转第 268 页)
·462·
开发与应用 日 用 化 学 工 业 第 45 卷
能力［12］。从表 3 可以看出，配方 1，3 和 4 的弹性显著
高于配方 2 和市售产品 (P ＜ 0. 05)，即配方 1，3 和 4
在长时间洗涤方面比配方 2 更具优势。
表 3 椰油基餐具洗涤剂的物性分析
Tab. 3 Product performance of coconut oil type dish
washing detergent
类别 黏附性 /mJ 内聚性 弹性
配方 1 1. 49 ± 0. 02a 0. 83 ± 0. 05b 0. 71 ± 0. 01a
配方 2 0. 95 ± 0. 06b 0. 96 ± 0. 03a 0. 47 ± 0. 02b
配方 3 0. 79 ± 0. 02c 0. 80 ± 0. 02b 0. 68 ± 0. 03a
配方 4 0. 68 ± 0. 03c 0. 91 ± 0. 02a 0. 64 ± 0. 02a
市售产品 0. 74 ± 0. 01c 0. 94 ± 0. 05a 0. 49 ± 0. 04b
注:不同的字母之间表示差异显著(P ＜ 0. 05)。
3 结论
制备了 4 种椰油型餐具洗涤剂，4 种产品在感官
指标(气味、外观和稳定性)和去污力方面均符合国标
要求。配方 4 产品无论是在去污能力，还是在内部质
地、组织结构和使用时间(弹性)上均与市售餐具洗涤
剂最为接近。
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