全 文 ：·论著·
三叶青提取物对肝癌细胞HepG2 及原代
大鼠肝细胞的体外毒作用研究
丁钢强1＊　郑军献2 　魏克民2　浦锦宝2
　　【摘要】目的　探讨三叶青提取物对肝癌细胞 Hep G2 及原代大鼠肝细胞的体外毒作用。方法　采用体外
细胞培养技术 , 以细胞活性、 细胞乳酸脱氢酶 (LDH)活力的改变为指标 , 观察三叶青提取物对肝癌细胞
Hep G2 , 体外毒作用的时效 、 量效关系 , 共观察其对正常原代培养大鼠肝细胞的影响。结果　三叶青提取物
以 1×10-4g/ L的浓度与Hep G2 共同培养 , 在 24h较空白对照组的细胞活性有显著降低;不同浓度的提取物和
Hep G2 共同培养 , 乙酸乙酯提取部位对细胞活性及酶学改变有显著性影响;对原代培养大鼠肝细胞活性及
LDH 也有一定的影响。结论　三叶青提取物对Hep G2 细胞具有明显的体外细胞毒作用 , 其毒性作用与药物的
浓度和作用时间呈明显正相关 , 但对正常原代大鼠细胞毒性较小。
【关键词】Hep G 2;原代大鼠肝细胞;三叶青
中图分类号:R-332　　文献标识码:A　　文章编号:1007-0931 (2005) 09-0001-03
Toxicological Effects of the Extract of Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg on Hepatocellular
Carcinoma Cell Line HepG2 and Primary Rat Hepatocytes in vitro
DINGGang-qiang , ZHENG Jun-Xian , WEI Ke-min , et al.(The Center for Disease Prevention and Control of Zhejiang
Province , Hangzhou , Zhejiang , 310009 , China.)
【Abstract】 Objective 　To study toxicological effects of the extract of Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg on
hepatocellular carcinoma cell line HepG 2 and primary rat hepatocytes in vit ro.Methods　The time-effect and quality-effect of
the extract of Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg on hepatocellular carcinoma cell line HepG 2were observed by cell culture
in vitro , using the activity changes of HepG2 and latic dehydrogenase(LDH)as observational indexes.Its toxicological effect
on primary rat hepatocytes was also investigated.Results　24 hours after co-culturing HepG2 and Tetrastigma hemsleyanum
Diels et.Gilg with a concentration of 1×104g L , the cel l activity decreased significantly compared to blank control.When
culturing HepG2 and the extract with diff erent concentrations , it had a significant influence on cell activity and enzyme
changes.Moreover , the extract also inf luenced the activity of primary rat hepatocytes in some extent.Conclusions　 The
extract of Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg has a significant toxicological effect on hepatocellular carcinoma cell line
HepG2 , which positively relates with its concentration and effect-t ime.However , its effect on primary rat hepatocytes is
comparatively lower.
【Key words】Hep G 2;Primary rat hepatocytes;Tet rastigma hemsleyanum diels et.gi lg
基金项目:浙江省中医药管理局 “中药保健食品功能
学” 重点学科
作者单位:1.浙江省疾病预防控制中心 , 浙江　杭州
　310009;2.浙江省中医药研究院　
＊浙江中医学院 2002 级博士研究生
　　三叶青以块根或全草入药 , 具有清热解毒 、 祛风化痰 、
活血止痛的功能 , 用于治疗高热惊撅 、 肺炎 、 哮喘 、 肝炎 、
风湿 、 月经不调 、 咽痛 、 痪病等症 , 具有很好的疗效[ 1] 。
在民间三叶青还被用于肿瘤的治疗 , 被许多民间验方收载 ,
并认为具有很好的治疗作用。有的地方作为药食二用物品 ,
并被开发为保健食品。虽然已有人对三叶青的化学成分进
行了较为详细的研究[ 2 、3] , 但有关三叶青抗肿瘤作用还没有
做过深入的研究 , 本研究主要探讨三叶青提取物对 Hep G2
肿瘤细胞的体外细胞毒作用 , 为临床应用提供科学依据。
材料与方法
1　材料
1.1　细胞株　人肝癌细胞株 Hep G2 购自上海中科院细胞
生化所;原代大鼠肝细胞由本实验室自备 , 所用动物为
Sprague-Dawley 雄性大鼠 , 体重 150 ～ 180g , 由浙江省实验
动物中心提供 (清洁二级 , 动物合格证号:医动字第
2001001号)。实验前 16h 断食 , 并自由饮水。
1.2　试剂与仪器　MTT [ 3- (4 , 5-Dimethylthiazol-2-y1)-2 ,
5-diphenyltetrazolium bromide] , sigma公司产品;HEPES , Ⅳ型
·1·浙江预防医学 2005年第 17卷第 9期　Zhejiang Prev Med , September 2005 , Vol 17 , No.9　　　　　　　　
胶原酶 , F12培养液 , DMEM 培养液 , GIBCO 公司产品;胰
岛素 , 南京新天生物化学制药有限公司;重蒸水自制;乳
酸脱氢酶测定试剂盒 , 南京建成生物工程研究所;小牛血
清 , 杭州四季青牧场;重蒸水自制;实验样品用培养液配
制成适宜浓度后用 0.22μm (Millipore)微孔滤膜过滤后使
用。Forma scientific CO2 培养箱;HTS 7000+酶标仪 (Perkin
Elmer);LGJ-10冷冻干燥机 , 宁波新芝生物科技股份有限公
司。
1.3　三叶青原料　三叶青采自云南 , 由华东医药公司中药
分公司提供 , 经鉴定为 Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg。
2　方法
2.1　三叶青提取物制备　自然干燥三叶青 935g , 8 倍量
70%乙醇回流提取两次 , 每次 1.5 小时。提取液减压浓缩 ,
挥去酒精 , 趁热离心 , 弃去沉淀。 上清液分别用石油醚 、
乙酸乙酯 、 正丁醇依次萃取 , 将提取物分成醚溶 、 脂溶 、
醇溶 、 水溶四个部分 , 各部分冷冻干燥后备用。得到按极
性不同的三叶青提取物。
2.2　提取物的时效关系　Hep G2 细胞以 5×104/孔密度接
种于24孔细胞培养板 , 用含 10%小牛血清的 DMEM 培养液
置于 37℃、 5%CO2 环境中培养 24h 后 , 弃去原有细胞培养
液 , 加入用 DMEM培养液稀释成 1×10-4 g/ L浓度的不同极
性提取物 , 每个提取物重复 3 孔 , 对照孔只加含 10%小牛
血清的 DMEM 培养液 , 分别在 4、 8、 16、 24、 48h 测定细胞
活性。
2.3　提取物的量效关系　Hep G2 细胞以 1×104/孔密度接
种于96孔细胞培养板 , 用含 10%小牛血清的 DMEM 培养液
置于 37℃、 5%CO2 环境中培养 24h 后 , 弃去原有细胞培养
液 , 加入用 DMEM 培养液稀释成 1×10-3 、 1×10-4 、 1 ×
10 -5 、 1×10-6 、 1×10-7 、 g L 浓度的不同极性提取物 , 每
个提取物重复 3 孔。对照孔只加含 10%小牛血清的 DMEM
培养液 , 在培养 24h 后测定细胞活性和细胞培养液中 LDH
活力。
2.4　提取物对原代培养大鼠肝细胞毒性作用　取正常 SD
大鼠 , 乙醚麻醉后用两步灌流法[ 4] 分离原代肝细胞 , 所得
细胞经台盼兰染色 , 拒染率为 90%以上者供用。肝细胞用
含有 10%小牛血清 , 103U/mL 青霉素 G-K、 100mg/mL链霉
素 、 5μg/ml胰岛素的 F12制成细胞悬液 , 计数细胞后 , 按 5
×104 个/孔种入 96 孔细胞培养板。 37℃、 5%CO2 培养。 细
胞贴壁 24 小时后用培养液稀释提取物浓度为 1 ×10-3 、
10 -4 、 10-5 、 10-6 、 10-7 g L 5个不同浓度剂量 , 每个提取物
重复3 孔 , 对照孔只加培养液。在培养24h后测定细胞活性
和细胞培养液中 LDH 活力。
2.5　细胞活性测定　在 24 孔培养板中 , 每孔加入 200μl
(5mg/mL)MTT 溶液 , 在 96孔培养板中加入 50μl (5mg/mL)
MTT溶液 , 培养 4 小时 , 孵育完后培养液弃去。在 24 孔板
中加500μl DMSO , 在 96 孔板中加 100μ1 DMSO 溶解 , 荡匀
后在 570nm 下测量吸光值。
2.6　LDH 活力测定　培养液上清液 LDH 活力用乳酸脱氢
酶测定试剂盒测定 , 方法按试剂盒说明书。
3　统计方法　每组实验在相同条件下重复 3 次 , 结果均用
x±SD表示 , 用 ANOVA 方差分析法对结果进行统计分析 ,
当 P<0.05时 , 认为两组间有显著性差异。
结　果
1　提取物的时效关系　Hep G2 细胞贴壁培养 24h 后 , 用
MTT法检测发现 , 正常组细胞活性逐步提高 , 24h 后活性达
到最高 , 以后因细胞过度增殖而导致活性急剧下降;加入
三叶青提取物后 , 细胞增殖受到抑制 , 特别是乙酸乙酯提
取物 , 在 16h 和 24h , 和空白组比较有显著性差异 (P<
0.05);正丁醇组在 24h 时细胞活性受到显著抑制 (P <
0.05)。因此在量效关系研究采用 24h作为时间观察点。
2　提取物的量效关系
2.1　不同浓度三叶青提取物对人肝癌细胞 Hep G2 活性的
影响　Hep G2 细胞与三叶青提取物共培养 24h 后 , 用 MTT
法测定 , 发现 1×10-3 、 1×10-4 g/ L浓度的乙酸乙酯提取物
对Hep G2 细胞活性有显著性抑制 (P<0.05), 较空白对照
组细胞活性下降了 48.9%和 44.9%{(空白组吸光度 A0-提
取物添加组吸光度 AX)/空白组吸光度 A0×100%};正丁
醇提取物也在 1×10-3g L浓度下显著抑制了 Hep G2 细胞活
性;石油醚组和水溶物各浓度组对细胞活性影响不大 (P>
0.05)。
2.2　不同浓度三叶青提取物对人肝癌细胞 Hep G2 培养液
中 LDH 活力的影响　三叶青提取物和 Hep G2 细胞共培养
24h后 , 乳酸脱氢酶在培养液中活力增加 , 其中乙酸乙酯提
取物高浓度 (1×10-3 、 1×10 -5 g/ L)较空白对照组能明显
增加 LDH 活力 (P<0.05), 正丁醇提取物也具有一定的作
用 (1×10-3 、 1×10-5 g L 浓度时 , P<0.05);其他提取物
作用效果不明显 (P>0.05), 但有一定的趋势 。结果见图
1。
图 1　三叶青提取物对人肝癌细胸Hep G2 体外
毒作用的量效观察
＊＊和空白对照组比较 , P<0.01;＊和空白对照组比较 P<0.05。
2.3　三叶青提取物对原代培养大鼠肝细胞毒性作用　三叶
青提取物和原代培养大鼠肝细胞共培养 24h 后 , 发现细胞
活性未受显著影响 , 各提取物组处理的细胞活性较空白对
照组未见明显的差异 (P>0.05);细胞经乙酸乙酯组和正
丁醇组提取物高浓度 (1×10-3 g/ L)处理后 , 可显著增加
LDH 在培养液中的活力 (P<0.05), 其他组别和浓度较空
白对照都没有显著性差异。结果见图 2。 (下转第 5页)
·2·　　　　　　　　浙江预防医学 2005年第 17卷第 9期　Zhejiang Prev Med , September 2005 , Vol 17 , No.9
讨　论
神经干细胞在神经系统损伤修复和神经退行性疾病的
细胞替代治疗和基因治疗中有巨大的应用价值。本实验以
SD孕鼠为研究对象 , 探索了 SD 大鼠神经干细胞的分离 、
培养 、 传代及其鉴定。 从胚胎大鼠大脑中分离培养的细胞
团 , 在特定的培养条件下 , 具有很强的分裂 、 增殖及自我
更新能力。传代 (最多 10 代以上), 以及冻存复苏 (最长
达6 个月)后神经干细胞基本特征与原代相似。免疫组化
表明培养的细胞团表达神经干细胞特异性抗原 Nestin。成功
分离 、 培养的神经干细胞 , 为神经干细胞的进一步研究提
供了基本条件。
对中枢神经系统的损伤或病变部位实行细胞替代或基
因治疗在目前极具发展前景 , 是神经病学上的重大治疗战
略。对发育中或成年中枢神经系统内植入胚胎神经组织的
一些实验已经证明 , 某些部位的神经母细胞或分裂后的年
幼神经元能够部分重建神经环路和功能[ 5] 。将神经干细胞
移植入受损脑组织不仅可以补充 、 替代受损的神经组织 ,
而且还能将外源性基因导入 , 使其在体内病变部位有效表
达。本实验用逆转录病毒介导 , 成功在神经干细胞中导入
EGFP , 并且在感染的神经干细胞及其传代细胞中均有 EGFP
编码蛋白的有效表达。这说明 , 神经干细胞可以成为载体
细胞为中枢神经系统某些疾病 , 尤其是退行性疾病 (如帕
金森病), 导入治疗基因 (如帕金森病导入 TH 基因)或者
是一些营养成分 (如 NGF 、 GDNF 等), 提供一种有效手段。
本实验从细胞标记的角度选用逆转录病毒包装绿色荧
光蛋白标记神经干细胞 , 发现转染了 EGFP的神经干细胞在
体外经多次传代不影响 EGFP 的表达 , NSCs 本身仍能分化
为神经元和神经胶质细胞。因此 EGFP可作为基因转染后的
良好细胞标记 , 为进一步行标记细胞移植治疗实验奠定了
基础。
参考文献
[ 1] Mckay R.Stem cells in the central nervous system [ J] .Science , 1997 ,
276 (5309):66.
[ 2] Jannotti C , Lu XB, Lu PH , et al.Neural stem cell transplantat ion in
the repair of spinal cord injury [ J] .Progress in Natural Science ,
2001 , 11(7):490～ 503.
[ 3] Naylor LH.Reporter gene technology:the future looks bright [ J] .
Biochem Pharmacol , 1999 , 58:749～ 757.
[ 4] Miller A D , Rosman G J.Improved ret roviral vector for gene transfer and
expression [ J] .Bio Techniques , 1989;7 (9):980.
[ 5] Kalb R G , St rittmatter S M.Neurobiology of spinal cord injury [ M] .
Totowa:New Jersey Humana Press INC , 2000.80～ 94.
(收稿日期:2004-11-23)
(上接第 2页)
图 2　三叶青提取物对原代培养大鼠肝细胞毒性作用
＊和空白对照组比较 P<0.05。
讨　论
肿瘤治疗一直是困扰医学界的世界性难题 , 特别是对
肝癌 、 肺癌等发病率较高的癌症[ 5] , 至今尚无比较满意的
治疗方法和治疗药物。在放化疗药物耐受性日益严重的同
时 , 中医中药及有关营养的支持为治疗肿瘤开辟了一条崭
新的道路。为此 , 我们试图利用我国特有的三叶青进行抗
肿瘤试验研究。
实验结果发现 , 三叶青提取物中乙酸乙酯溶部分对人
肝癌细胞HepG2 活性具有较强的抑制作用 , 正丁醇部分也
有一定的作用。有人对三叶青的主要成分作过初步的研究 ,
发现乙酸乙酯溶部分主要成分为 6 -O-苯甲酰基胡萝卜甙
(6 -O-benzoyldau-costerol)[ 6] , 研究证明具有一定的肿瘤抑
制作用和抗病毒作用。通过本实验研究发现 , 三叶青提取
物中乙酸乙酯溶部分的确具有很好的肿瘤细胞毒作用 , 为
进一步研究及临床用药提供了科学的依据。
实验同时发现 , 对正常原代培养的大鼠肝细胞活性没
有明显的影响 , 对 LDH 活力影响也较对 Hep G2要小 , 提示
三叶青的各部分提取物对正常细胞影响较肿瘤细胞要小。
但对三叶青中的有效成分究竟通过何种途径发挥作用 , 需
要作进一步的研究和探索。
参考文献
[ 1] 中国医学科学院药物研究所.中药志 [ M] .第二册 , 北京:人
民卫生出版社 , 1984.219.
[ 2] 刘东 , 杨峻山.中国特有植物三叶青化学成分的研究 [ J] .中
国中药杂志 , 1999 , 24(10):611～ 612.
[ 3] 李瑛琦 , 陆文超 , 于治国.三叶青的化学成分研究 [ J] .中草
药 , 2003, 34 (11):982～ 983.
[ 4] Seglen PO.Preperation of i solated rat liver cells [ J] , Methods in cell
Biology.1976 , 13:29.
[ 5] Ding Gangqiang , Yu Ming , Gong Weiwei , et al.Nutrition-related
disease and death in Zhejiang province [ J] .Asia Pacifi c J of Clin
Nut r , 2004, 13 (12):162～ 165.
[ 6] 杨大坚 , 刘红亚 , 李新中 , 等.破石珠化学成分研究 [ J] .中
国中药杂志 , 1998 , 23(7):419～ 421.
(收稿日期:2005-02-17)
·5·浙江预防医学 2005年第 17卷第 9期　Zhejiang Prev Med , September 2005 , Vol 17 , No.9