全 文 ：中国药房 2008年第 19卷第 21期 China Pharm acy 2008 Vol.19 No.21 · 1603·
Δ教育部高等学校科技创新工程重大项目培育基金资助项目
(706047);广东省医学科学基金资助项目(A 2006361);广州市科技攻
关资助项目(2005Z 2-E4041)
*讲师 ,博士研究生。研究方向:天然药物化学、药物分析。电话:
020-61648595。E-mail:jy 20071030@y ahoo .com
#通讯作者:副教授。研究方向:药物分析、中药抗病毒。电话:
020-61648594。 E-mail:wendyduan@126.com
·中药研究·
青果抗人免疫缺陷病毒活性部位的筛选研究 Δ
杨 洁 *,孙 魏 ,杨旭锐 ,陈伟健 ,吕 琳 ,段文军 #(南方医科大学药学院 ,广州市 510515)
中图分类号 R284.2;R94 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2008)21-1603-03
摘 要 目的:筛选青果中作用于人免疫缺陷病毒(HIV)gp41抑制 HIV -1与靶细胞融合的活性部位 。方法:分别用水蒸气蒸馏
法 、溶剂梯度萃取法获得青果挥发油 、青果 10%水提液的石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯 、正丁醇萃取部位 ,用酶联免疫吸附(ELISA)法检
测以上各部位抑制 H IV -1与靶细胞融合的活性;测定活性部位中鞣质的含量 ,以确定青果中非鞣质成分与活性的关系 。结果:青
果 10%水提液的石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯萃取部位均有较强的抑制 H IV -1与靶细胞融合的活性 ,其半数抑制浓度分别为(3.97±
0.38)、(26.78±0.47)、(6.80±0.10)μg ·mL -1;各部位中鞣质的含量分别为 8.0%、9.6%、32%。结论:青果抑制H IV 与靶细胞
融合的活性部位为水提液的石油醚 、氯仿和乙酸乙酯萃取部位 , 其中石油醚萃取部位活性最强 , 且很可能含有非鞣质类的活性物
质 。
关键词 青果;人免疫缺陷病毒;靶细胞;HIV 融合抑制剂;活性部位;筛选;鞣质
Screening of Inhibitors Targeting HIV from Extracts of Fructus Canarii
YANG Jie ,SUN Wei ,YANG Xu-rui ,CHEN Wei-jian , LV Lin ,DUAN Wen-jun(School of Pharmaceut i-
cal Sciences ,Southern M edical University , Guang zhou 510515 ,China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To screen H IV -1 fusion inhibito rs ta rge ting HIV gp41 fr om ex t rac ts o f C hinese medicinal herb
Fructus Canarii.METHODS:T he essentia l oil of Fructus C anarii w as ex trac ted by steam -stilling.Other solvent ex tracts
were obtained by ex tracting Fructus Canarii s w ate r-soluble par t with pet roleum ether , chlo rofo rm , e thy l acet ate , and n-
but anol in o rder.A sandwich E LISA assay w as applied to screen active H IV fusion inhibito ry par ts.And the polyphenol con-
tent in the active par ts w ere determined to establish the relationship betw een inhibito ry ac tivities and non-polypheno l com-
ponents.RESULTS:The pet roleum ether par t , chlo ro fo rm par t and e thy l acet ate par t had rem arkable inhibito ry activitie s on
H IV gp41 six -helix bundle fo rmation w ith IC50 at(3.97±0.38), (26.78±0.47)and (6.80±0.10)μg ·mL -1 , respec tively.
The content o f polyphenols in t he three part s w as 8.0%, 9.6%and 32%, respectively.CONCLUSION :Among essential oil
and solvent ex t racts o f Fructus Canarii s w ate r-soluble parts , the pe tro leum ether part , chlo rofo rm part and e thy l ace tate par t
have remarkable inhibitory ac tivities on H IV -1 gp41 six -helix bundle formation.The petroleum ether part has the strongest
inhibito ry activitie s and it is most likely that the non-po lyphenol components contribute to the inhibito ry activities on HIV -
1 gp41 six -helix bundle fo rm ation.
KEY WORDS Fructus Canarii;HIV ;Targe t cell;H IV fusion inhibito rs;Active site;Screen;Polypheno ls
无公害中药材准入制度 , 包括加强 、规范无公害中药材的认证
制度、无公害中药材销售准入制度 , 为消费者提供更多信息对
称的机会;加大对不安全中药材生产、销售的处罚力度 ,加强质
量安全中药材的市场示范效应 , 形成以质量安全中药材市场为
导向的生产 、加工机制是保障生产质量安全产品的根本;通过
各种媒体 ,多渠道 、多方式加强对质量安全中药材的宣传 ,真正
实现消费者 、市场 、生产者之间的质量信息基本对称 ,强化消费
者购买质量安全中药材的意愿及购买质量安全中药材的实现
途径 ,增强农户生产质量安全中药材的动机 。
3.2 充分发挥合作组织的优势
加强培育各种农村“中介”组织 ,充分发挥“中介”组织的作
用 ,使他们成为农户与市场 、农户与企业的有效联接 ,保证中药
材质量安全 。“中介”组织虽然并非是中药材质量安全的信号 ,
但他们却能够使市场信号得以强化和具体化;同时 , 由于他们
更贴近农户 , 所以他们可以采取农户更愿接受的方式 、方法对
农户进行监督和管理 , 还可以以组织的形式增强单个农户讨价
还价的能力;他们在长期经营 、管理过程中也会增加经验 ,对契
约的履行及生产质量安全的中药材具有促进作用 。
3.3 加强农户的基础教育
本次调查结果还表明 ,我国农村文盲 、半文盲率还较高 ,这
一现状成为与农户进行沟通 、质量安全知识普及、技术普及和
方法掌握的障碍 。加强农户的基础教育 , 使农户的基本素质得
以提高是保证生产无公害中药材的一个素质条件 。
参考文献
[ 1] 梅全喜 ,曾聪彦.中药饮片质量安全问题的成因及对策[ J].
中国药房 , 2007 , 18(6):477.
(收稿日期:2007-12-08 修回日期:2008-01-31)
· 1604· China Pharmacy 2008 Vol.19 No.21 中国药房 2008年第 19卷第 21期
人免疫缺陷病毒 (H IV)融合抑制剂是一类新的抗艾滋病
药物 , 其可在 HIV 感染的早期阶段打断 H IV 复制环节 , 具有
明显的优越性 。HIV gp41是 HIV 的跨膜糖蛋白 ,其功能是介
导 HIV 包膜与靶细胞膜的融合 , 在病毒进入靶细胞的早期阶
段发挥关键作用 。青果为橄榄科植物橄榄 Canarium album
Raeusch.的干燥成熟果实 , 前期研究表明 , 其水提液具有较强
的抗艾滋病毒活性 。为进一步从青果中分离获取抗艾滋病毒的
有效成分 ,笔者采用夹心酶联免疫吸附(ELISA)法筛选青果中
以 gp 41为靶点的抑制 H IV -1与靶细胞融合的活性部位 , 并
初步确定活性部位中鞣质含量与活性的关系 。
1 材料
1.1 仪器
RE-201E型旋转薄膜蒸发器 (巩义市予华仪器有限公
司);Genios Pro 型 Tecan酶标仪(美国 Tecan公司);T 6紫外
可见分光光度计(北京普析公司);挥发油提取装置(南京金正
教学仪器有限公司)。
1.2 试药
青果购于广东潮州 , 经南方医科大学中医药学院刘强副教
授鉴定为真品;HIV gp41的 N -多肽(N36)和 C-多肽(C 34)
及单克隆抗体 mAb 21F 5由纽约血液中心姜世勃提供;生物素
标记的羊抗鼠 IgG(美国 Boeh ringer Mannheim公司);链亲合
素标记的辣根过氧化酶 (HRP , 美国 Zymed公司);福林酚试
剂 、单宁酸 、3 , 3′, 5 , 5′-四甲基联苯胺(TM B ,美国 Sigma 公
司);偶氮化合物 ADS-J1(匈牙利 Com Genex 公司);90%纯
度的茶黄素衍生物(TF ,浙江大学茶学系提供);其余试剂均为
分析纯 。
2 方法
2.1 青果分离部位的制备
取新鲜青果去核果肉 500 g , 置挥发油提取器中提取 6 h ,
得黄色透明油状物 ,得率为 0.1%。另取青果干燥果肉200 g ,粉
碎 ,分别回流提取 60 、45 、30 min ,合并 3次提取液 ,过滤并浓缩
至 2 000 mL ;将上述 10%青果水提液 ,依次用石油醚 、氯仿 、乙
酸乙酯 、正丁醇萃取 ,旋转蒸发仪减压回收溶剂后得到石油醚 、
氯仿 、 乙酸乙酯和正丁醇分离部位 , 得率分别为 0.12%、
0.27%、1.1%和 8.7%。
2.2 青果分离部位作用于 gp41的抑制HIV融合的活性检测
方法
将 100μL 小鼠抗 N 36/C 34多抗(2μg ·mL -1 , 溶于 0.1
mol ·L -1 Tris溶液 ,pH8.8)包被在 96孔酶标板上 ,4 ℃过夜 ,
用洗板液洗涤 3次 。加入 200μL 1%脱脂牛奶封闭液 , 37 ℃温
育 1 h ,用洗板液洗涤 3次 。将 30μL 2μmol· L -1的 N 36(衍
生于 HIV gp41 NHR 区的 36个氨基酸的多肽)分别加入不同
浓度(7.81 、15.6 、31.2 、62.5 、125 、250 、500μg ·mL -1)青果分
离部位及对照品 ADS-J1 、90%TF 和 PBS 溶液 30 μL , 37 ℃
温育 30 m in 后 , 再加入 60μL 1μmol ·L -1 的 C 34(衍生于
H IV gp41 CHR区的 34个氨基酸的多肽), 再 37 ℃温育 30
min。将上述混合液 100μL 转入到已封闭好的酶标板中 , 37 ℃
温育 1 h , 洗涤 3次 。加入 100μL 1μg ·mL -1的单克隆抗体
mAb 21F 5的 PBS溶液 , 37 ℃温育 1 h ,洗涤 3次 。加入 100 μL
1∶5 000的生物素标记的羊抗鼠 IgG , 37 ℃温育 1 h , 洗涤 3
次 。加入 100μL 1∶5 000的链亲合素标记的辣根过氧化酶 , 37
℃温育 1h , 洗涤 3次 。加入 100μL TMB , 37 ℃显色 5 ～ 10
m in 。加入 50μL 1 mol ·L -1 H 2SO 4终止反应 , 在酶标仪上检
测 450 nm波长处(以 570 nm 为参比)的吸光度值 。根据抑制
率和半数抑制浓度(IC50)判断青果分离部位以 gp41为靶点的
抑制 H IV 融合的活性大小 。
2.3 抑制率和 IC50的计算方法
样品对 gp 41六股α-螺旋束结构形成的抑制率按下式计
算:抑制率(%)=(样品孔 A 450 —PBS 空白 A 450)/(未加样品的
(N36+C36)孔 A 450 —PBS空白 A 450);IC 50用 CBAS 药理学软
件按 Logit 法计算 。
2.4 青果分离部位中鞣质含量的测定
参照文献 [1 ]方法测定青果水提液的石油醚 、氯仿和乙酸乙
酯分离部位中的鞣质含量 。具体方法:将青果各分离部位浸膏
配制成 1 mg ·mL -1的水溶液 ,取 0.5 mL ,加入 1 mL 福林酚
试剂 , 再加入 3.5 mL 20%Na 2CO 3溶液和 5 mL 蒸馏水 , 室温
反应 10 min , 用紫外可见分光光度计在 700 nm 波长处测定吸
光度 , 根据吸光度和标准曲线计算鞣质含量 。以浓度(C)为横
坐标 , 吸光度(A)为纵坐标进行线性回归 , 得回归方程为 C=
22.63A —0.183 ,(r =0.997)。结果表明 ,青果各分离部位检测
浓度在 0 ～ 40μg ·mL -1范围内与吸光度呈良好的线性关系 。
3 结果
3.1 青果各分离部位抑制 HIV gp41形成六螺旋结构的活性
青果挥发油的抑制率在浓度为 125 μg ·mL -1时仅为
18%,活性很低 。结果表明 ,石油醚 、氯仿和乙酸乙酯 3个部位
都显示了明显的量效关系 。其中 , 石油醚部位与乙酸乙酯部位
的活性明显优于对照品 ADS-J1 , 与对照品 90%TF 接近 。尤
以石油醚部位活性最强 ,在浓度 15.6μg ·mL -1时抑制率已达
96%, IC 50为(3.97±0.38)μg ·mL -1。乙酸乙酯部位在浓度
31.2 μg ·mL -1时抑制率也达 95%, IC 50为 (6.80±0.099)
μg ·mL -1。氯仿部位在低浓度时活性稍差 , IC50为 (26.78±
0.47)μg ·mL -1。极性最大的正丁醇部位无抑制 HIV gp41形
成六螺旋结构的活性 。青果分离部位对 H IV gp41形成六螺旋
结构的抑制率见图 1 。
3.2 青果 10%水提液各溶剂分离部位中鞣质的含量
为进一步研究石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯分离部位的活性与
其中鞣质与非鞣质成分的关系 , 笔者测定了以上 3个分离部位
中的鞣质含量 。结果 ,石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯分离部位的鞣质
含量分别为 8.0%、9.6%、32%。
4 讨论
HIV gp41是 H IV 的跨膜糖蛋白 , 其胞外区存在 N -末
端重复序列(NHR)和 C-末端重复序列(CHR), 它们相互作
用能形成六股α-螺旋束结构 , 将 HIV 包膜与靶细胞拉近 , 介
导二者的融合 [2 ] 。因此 ,任何化合物如能抑制 NHR 和 CHR 的
结合 , 使六股α-螺旋束结构不能形成 , 就能阻止病毒进入靶
细胞 ,从而保护免疫细胞不受感染 。姜世勃等 [3 ,4 ]研究发现 ,从
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H IV gp41的 CHR 端和 NHR端衍生的 C-多肽 C34和 N -
多肽 N36 , 能在溶液中相互形成类似 HIV gp 41六股α-螺旋
束的核心结构 , 利用能特异性识别这一空间构型而不能识别游
离的 C34和 N36的单抗 NC-1 , 建立了夹心 ELISA 法 , 可检
测由 C 34和 N 36形成的六股α-螺旋束和筛选能抑制 gp 41
核心结构形成的物质 。这一方法适用于直接快速筛选中草药提
取物、微生物发酵液等。
目前 , 从中草药中分离得到的作用于 gp41的 HIV 抑制成
分主要为多酚类鞣质 ,如红茶中的茶黄素和绿茶中的儿茶素[5 ] 、
夏枯草和贯众中的多酚类化合物 [ 6 ] 、橄榄叶中的橄榄多酚 [7 ]都
能较强抑制 H IV gp41核心结构形成。鞣质也能以抑制逆转录
酶 、蛋白酶 、整合酶 、干扰 HIV gp120与受体 CD 4结合等多种
机制抑制 HIV 。鞣质为一类结构复杂的分子量从 500 ～ 3 000
的多元酚类化合物 ,较难提纯得到单体 ,且易被氧化 ,口服生物
利用度低 ,使其被开发成为口服抗 H IV 药物受到限制 。笔者筛
选出的青果中的 3个活性部位 , 乙酸乙酯分离部位中鞣质含量
较高 , 若从理论估算 ,在 IC 50时 ,该分离部位中鞣质浓度为 6.8
μg ·mL -1 ×32%=2.2 μg ·mL -1 , 已达对照药物 90%TF
IC 50((3.57±0.43)μg ·mL -1)的 61%。假设该鞣质成分的抑
制活性与 TF 相当 , 则可推测乙酸乙酯分离部位中对抑制活性
的主要贡献是鞣质 。同理可估算出氯仿和石油醚分离部位在
IC 50时的鞣质浓度分别为对照药物 T F IC 50的 72%与 8.9%;
可推测氯仿分离部位起活性作用的主要还是鞣质 , 但石油醚分
离部位中对抑制率作出主要贡献的很可能是非鞣质成分 。青果
水提液经长时间高温煮提 , 石油醚极性又低 , 其萃取得到的可
抑制 HIV -1与细胞融合的活性成分可能是非蛋白 、非多肽类
的小分子化合物 。化学成分定性检测结果表明 , 石油醚分离部
位含有甾体和萜类 , 氯仿和乙酸乙酯分离部位含有鞣质和黄酮
类化合物 , 它们可能单独或相互作用产生抗病毒作用 [8 ] 。进一
步的实验确证可用聚酰氨柱吸附 3个活性部位的鞣质成分后
再进行抗融合活性检测 , 根据结果判断活性物质的归属 , 再以
细胞融合实验确认抗 HIV 活性后继续分离 、 提纯获得目标化
合物 。
本实验结果表明 , 青果中有可能分离出抗 H IV 的小分子
先导化合物 ,从而为研制抗艾滋病新药提供基础。
(致谢:本研究工作得到南方医科大学药学院抗病毒中心刘叔文
教授的大力支持 ,特此致谢! )
参考文献
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