全 文 ：[ 收稿日期] 　2002-09-27
[ 基金项目] 　吉林省卫生厅招标项目
[ 作者简介] 　兰英(1968-),女 ,博士研究生 ,副教授 ,主要从事细胞生物学研究.
[ 文章编号] 1000-1832(2003)01-0078-04
核桃楸青果皮(GPJM)水提物诱生小鼠
肿瘤坏死因子的实验研究
兰　英1 ,房金波1 ,张维晶2 ,常雅萍3
(1.东北师范大学遗传与细胞研究所 ,吉林 长春 130024;
2.东北师范大学医院 ,吉林 长春 130024;
3.吉林大学基础医学院 ,吉林 长春 130021)
[摘　要] 　核桃楸青果皮(GPJM)经沸水煮提得水提物 ,应用 MT T 法分析 ,
GPJM 水提物在体外可协同亚剂量 ConA(2.5 μg mL)诱导小鼠脾细胞合成
TNF ;在体内也有诱生内源性 TNF 的作用.这表明核桃楸青果皮水提物
(GPJM)具有一定的免疫调节作用.
[关键词] 　核桃楸青果皮;刀豆蛋白A;肿瘤坏死因子;MTT
[中图分类号] 　R 392.1　　　[文献标识码] 　A
　　利用中药诱生内源性细胞因子 ,以扩大与加强免疫系统对肿瘤的免疫应答是肿瘤治
疗的有效途径之一[ 1 ～ 3] .核桃楸(Juglans M axim)为胡桃科胡桃属植物 , 核桃楸青果皮
(green peel of Jug lans Maxim ,GPJM)为其未成熟果实的外果皮.为观察 GPJM 的免疫调
节作用 ,本研究应用细胞免疫技术对GPJM 诱生 TNF 的作用进行了实验观察.
1　材料与方法
1.1　药品制备
核桃楸青果皮按常规煎剂浓缩至其质量浓度为 200 g L ,用 0.45 μm 微孔滤膜过滤 ,
作为实验用原液 ,4℃保存备用.体外实验用药:用生理盐水将原液稀释成 4 g L , 4℃保存
备用.小鼠体内灌胃用药:用无菌生理盐水将原液稀释成 10 g L ,4℃保存备用.
1.2　动物
健康 Swiss小白鼠 ,雄性 ,体重 18 ～ 20 g ,由吉林大学基础医学院动物部提供.
1.3　主要试剂
IMDM:美国 GIBCO 公司产品;小牛血清:Difco 公司产品;ConA , MTT :Sigma公司
产品;胰酶:Difco 公司产品;L929细胞株:来源于小鼠纤维母细胞 ,由吉林大学基础医学
院免疫室提供.
第 35 卷第 1 期 东 北 师 大 学 报 自 然 科 学 版 Vol.35 No.1
2003 年 3 月 JOURNAL OF NORTHEAST NORMAL UNIVERSITY March 2003
DOI :10.16163/j.cnki.22-1123/n.2003.01.014
1.4　方法
1.4.1　动物分组及给药　小鼠随机分组 ,实验组每日灌胃给药 ,每只小鼠 0.2 mL ,连续
10 d.对照组给予同样剂量生理盐水.10 d后 ,小鼠断髓处死 ,无菌制备脾细胞悬液[ 4] .
1.4.2　诱导上清制备　(1)ConA协同诱导上清:将正常小鼠脾细胞 5×106 个 、亚剂量
ConA(2.5 μg mL)及不同质量浓度的GPJM(0.25 ,0.125 ,0.06 , 0.03 g L)共同培养于 24
孔板中 ,同时设 ConA 对照 ,于 37℃, 5%CO2 培养 48 h 后 ,收获上清 , 4℃保存备用.(2)
GPJM 单独诱导上清:以 IMDM 代替 ConA ,设对照 ,其余步骤同上.
1.4.3　TNF 活性测定　L929体外杀伤法.将 L929细胞配成 2×105 个 mL ,按 100 μL
孔分别加入 96孔板中 ,再加等量不同稀释度的诱导上清 ,于 37℃,5%CO 2 培养 24 h后 ,
采用 MTT 法测定 ,按参考文献[ 5 ～ 7]进行.MTT 法测得其光密度值与 TNF 活性呈负相
关.
2　结果
2.1　GJPM 促进小鼠脾细胞增殖实验
在Sw iss小鼠脾细胞培养物中 ,加入不同浓度 GPJM ,对照孔以培养液代替 GPJM ,检
测培养 48 h后的 MTT 掺入量 ,结果见图 1.适当浓度(0.25 g L , 0.5 g L)可促进小鼠脾
细胞增殖(P <0.05).说明 GPJM 有直接促进小鼠脾细胞增殖的作用.
图 1　GPJM 质量浓度在体外对小鼠脾细胞功能的影响
2.2　GPJM 对正常小鼠脾细胞体外诱生 TNF 的影响
GPJM 在有效浓度范围内单独不能诱生小鼠脾细胞分泌 TNF ,但可协同亚剂量 Co-
nA(2.5 g mL)诱导合成 TNF(见图 2).每种药物浓度不同稀释度(1∶4 ～ 1∶32)的上清中
TNF活性均高于对照组 TNF 活性 , P<0.01 ～ 0.05.说明 GPJM 在体外可促进小鼠脾细
胞产生 TNF.
2.3　小鼠脾淋巴细胞转化实验
每日 0.2 mL(2 g L)剂量的GJPM 可显著促进小鼠脾细胞对 ConA的反应性(见图 3).
2.4　GPJM 在体内对正常小鼠脾细胞诱生 TNF 的作用
实验组小鼠脾细胞不同稀释度的诱生上清中 ,TNF 含量显著高于对照组(见图 4),说
明GJPM 有诱生内源性 TNF 的作用.
79第 1 期 兰英等:核桃楸青果皮(GPJM)水提物诱生小鼠肿瘤坏死因子的实验研究
3　讨论
本研究的体内外实验结果表明 ,GPJM 水提物不仅在体外可协同亚剂量 ConA促进
小鼠脾细胞 TNF 的诱生 ,也可能在体内经代谢产生的中间产物对脾淋巴细胞产生 TNF
的功能有影响 ,或者通过对机体其他系统或途径间接影响脾淋巴细胞功能 ,增强其产生
TNF ,从而起到抗肿瘤及免疫调节作用[ 8 , 9] .
80 东 北 师 大 学 报 自 然 科 学 版 第 35 卷
中药通过细胞因子表达免疫效应具有如下特点[ 10] :
(1)量效关系呈钟罩型剂量依赖性.本实验结果证明了这一点.当核桃揪青果皮水提
物在质量浓度为 2 g L 时 ,可显著抑制小鼠脾细胞活性.但若降低用量 ,则增强其转化增
殖能力.
(2)功能依赖性的双向调节.在一定范围内免疫系统具有相当的自身调节能力 ,而中
药的作用在于启动这个自身调节系统.
(3)中药促进 T 细胞 、B细胞增殖 、增强 NK 细胞活性等作用与它们诱导或促诱导 I L
-2 , IFN等细胞因子的产生相平行.本研究其他实验结果也证实了此观点.
(4)中药体内或体外效应与产生细胞因子效应具有一致性关系.大多数中药体内外使
用 ,其产生细胞因子的效应是一致的.我们也证实了这一点.从免疫药理角度看 ,中药本身
所包括的多种成分可能是它们根据体内功能状态不同而呈调节性影响的物质基础.
[参　考　文　献]
[ 1] 　杜德极.中草药与肿瘤坏死因子[ J] .中草药 , 1992 , 23(2):92.
[ 2] 　Carsw ell E A.Effect of tumor necrosis factor on cultured human melanoma cells[ J] .Nature , 1975 , 258:790 ～
799.
[ 3] 　Old L J.Tumor necrosis factors[ J] .Science , 1985 , 230:921～ 928.
[ 4] 　杨贵贞.免疫生物工程纲要与技术[ M] .长春:吉林科学技术出版社 , 1991.205.
[ 5] 　朱正美 ,刘辉.简明免疫学技术[ M] .北京:科学出版社 , 2002.61.
[ 6] 　司徒镇强 ,吴军正.细胞培养[ M] .北京:世界图书出版公司 , 1996.9～ 186.
[ 7] 　杨贵贞.医学免疫学[ M] .长春:吉林科学技术出版社, 1999.78～ 86.
[ 8] 　喻青.肿瘤坏死因子与充血性心力衰竭[ J] .国外医学,儿科学分册 , 1997 , 24(6):300～ 302.
[ 9] 　Alkhaw ajah A M.Studies on the antimicrobial activity of juglans regia[ J] .Am J Chin Med , 1997 , 25(2):175～
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141.
The experimental study on mice tumor
necrosis factor production of GPJM(aqueous extract)
LAN Ying
1 ,FANG Jin-bo1 ,ZHANG Wei-jing2 ,CHANG Ya-ping3
(1.Inst itute of Genetics and Cy tology , Northeast Normal Universi ty , Changchun 130024 ,China;
2.Northeast Normal University Hospital , C hangchun 130024 , China;
3.Basic School of Medical Sciences , Jilin Universi ty , Changchun 130021 ,China)
Abstract:The aqueous ex tract w as obtained by boiling water of GPJM.Using M TT method ,
can learn that GPJM aqueous ext ract and ConA(2.5 μg mL)stimulated cultured spleeno-
cy tes of mice synergistically to secrete TNF .The experimental proved that GPJM have the
function of producing inner TNF in vivo.GPJM probably acts on mice immune regulation to
a certain deg ree.
Keywords:green peel of jug lans maxim ;ConA;TNF;MT T
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