全 文 ：山苍子内生细菌的分离及抑菌活性研究
林 娜1，游 玲2* ，郭 华1，魏 琴2
(1．宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾 644000;2．宜宾学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川宜宾 644000)
摘要 ［目的］探讨山苍子内生细菌的抑菌活性及生防效果。［方法］从山苍子的根、茎、叶和果中分离出内生细菌 52 株(其中根 23株、
茎 8株、叶 7株、果实 14株)，采用对峙生长法检测其对植物病原真菌的抑制效果。［结果］5株来自叶和果的内生细菌分别对杨树溃疡
病菌、小麦纹枯病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、苹果炭疽病菌和辣椒疫霉病菌有较好的拮抗作用。田间试验结果表明，1 株 16S rD-
NA序列(序列号为 JN252095)与 Bacillus megaterium最为接近的山苍子叶内生细菌对辣椒疫霉病的防治效果较好，且可促进辣椒植株生
长。［结论］山苍子内生细菌作为农作物生防细菌效果明显，值得进一步研究。
关键词 山苍子;内生菌;对峙法;抑菌活性
中图分类号 Q946 －33 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)06 －03382 －03
Isolation of Endophytic Bacteria from Litsea cubeba and Study of Their Antifungal Activity
LIN Na et al (College of Life Science and Food Engineering，Yibin University，Yibin，Sichuan 644000)
Abstract ［Objective］To research the antifungal activity and biocontrol efficacy of endophytic bacteria from Litsea cubeba． ［Method］52 bacte-
ria strains were isolated from Litsea cubeba，23 were from roots，8 from stems，7 from leaves and 14 from fruits． The antifungal activity to plant
pathogen fungi of all these 52 strains were detected by antagonistic test． ［Result］5 strains were found to inhibit many pathogen fungi including
Botryosphaeria dothidea;Rhixoctonia cerealis V． Hoeven;Botrytis cinerea;Fusarium graminearum;Colletotrichum gloeosporioides and Phytophthora
capsici Leonian． Field trial was conducted in further，and the results showed one endophytic bacteria strain isolated from the leaf of Litsea cubeba
controlled Phytophthora capsici Leonian well，promoted the growth of chili in addition，this strain was mostly closed to Bacillus megaterium based
on 16S rDNA partial sequence identification(Genbank No． JN252095)． ［Conclusion］The results indicated that the endophytic bacteria of Litsea
cubeba were useful potential antifungal resource in agriculture which needed to be further studied．
Key words Litsea cubeba;Endophytic bacteria;Antagonistic tests;Antifungal activity
基金项目 四川省教育厅青年基金项目(2009JY0149) ;发酵资源与应
用四川省高校重点实验室基金项目(2010KFJ002) ;宜宾市
科技局重点项目(2010NY005)。
作者简介 林娜(1979 － ) ，女，四川内江人，讲师，在职博士研究生，研
究方向:植物学，E-mail:450351692@ qq． com。* 通讯作者，
讲师，从事应用微生物研究，E-mail:linna0009@ yahoo． com．
cn。
收稿日期 2011-10-21
山苍子(Litsea cubeba Pers．)又名山鸡椒，是樟科(Laura-
ceae)木姜子属植物。山苍子各器官均可入药，是一味传统
的中药材。山苍子的根、叶、花及果皮均含芳香油，是我国重
要的芳香植物。从果实中提炼的芳香油，可广泛用于食品、
医药、农药、化妆品以及其他日用品［1］。山苍子油对病虫具
有明显的驱避、抑制、毒杀作用，用于防治各种农作物的黄
霉、绿霉、烟煤病、棉花黄萎病、茶毛虫和红锈草病等;对储粮
害虫、食品害虫、卫生害虫等也具有显著的抑杀作用［2］。
植物内生菌是指在其生活史的一定阶段生活在活体植
物组织内，而不引起植物明显病害的微生物［3］。目前在各种
农作物及果树等经济作物中发现的内生细菌已超过 745 种
(隶属于 9个属)［4］，许多研究表明植物中的内生细菌对宿主
具有抗病促生的能力［5］，作为生物菌剂在生物防治方面和促
进植物生长方面有着重要的应用价值［6 －8］。
国内外关于山苍子的研究主要集中在栽培、挥发油和细
胞培养方面［9］，其内生细菌研究尚未见报道。基于植物内生
菌可产生植物本身所具有的或者更为新颖的生理活性物
质［10］这一特点，笔者对山苍子内生细菌进行了分离鉴定，并
对其室内及大田抑菌活性进行了研究，旨在为生产高效微生
物制剂、保护环境及山苍子的综合开发奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 植物材料。采自四川宜宾县双龙镇山苍子人工林，
在 50 m2 范围内选取无植物病害且树龄接近的植株 20棵，分
别采集根、茎、叶、果实并分离。供试辣椒:江南一品椒王。
1． 1． 2 供试菌种。杨树溃疡病原菌(Botryosphaeria do-
thidea)、小麦纹枯病原菌(Rhixoctonia cerealis V． Hoeven)、番
茄灰霉病原菌(Botrytis cinerea)、小麦赤霉病原菌(Fusarium
graminearum)、苹果炭疽病原菌(Colletotrichum gloeospori-
oides)和辣椒疫霉病原菌(Phytophthora capsici Leonian)由宜
宾学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室提供。
1． 1． 3 培养基。1 000 ml牛肉膏蛋白胨培养基中加入 20 ml
无菌山苍子根茎叶水浸液和 5万单位制霉菌素。
1． 1． 4 主要试剂与仪器。紫外分光光度计 T6;PCR仪及梯
度电泳仪均为 Bio-Rad公司产品;菌株 DNA提取和 16S rD-
NA片段扩增所用的各种酶、Marker、dNTPs、Buffer 等试剂均
为上海生工生物工程技术服务有限公司产品;其余试剂均为
国产分析纯。
1． 2 方法
1． 2． 1 内生细菌的分离纯化。随机挑选根、茎、叶、果实 100
g左右，洗净风干，75%乙醇分别浸泡 2、3、1、1 min，无菌水冲
洗 6次，无菌滤纸吸干，0． 1%HgCl2 分别浸泡 50、60、40、40 s，
无菌水冲洗 6次，加无菌石英砂研磨，梯度稀释至 10 －3，每一
稀释梯度涂布 10个分离平板。每个样品都取最后一次无菌
水洗液涂于相应平板上，以检测表面消毒是否彻底。定期观
察分离平板，挑取单菌落划线纯化于牛肉膏蛋白胨斜面上。
1． 2． 2 内生细菌的鉴定。根据文献［11］并适当修改。提取培
责任编辑 乔利利 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(6):3382 － 3384，3564
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.06.187
养物基因组 DNA后，PCR 扩增 16S rDNA。细菌引物 27f:5-
AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3和 1541r:5-AAGGAGGTGATC-
CAGCCGCA-3，PCR反应体系和反应条件参照文献［5］进行。
扩增的 PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司纯
化并测序，测定序列长度1 000 ～1 100 bp，测得序列用 EzTax-
on server 2． 0［11］在线进行相似性分析，将其鉴定到种。
根据 16S rDNA序列分析结果及菌落的颜色、大小、突起
特征、边缘特征、表面光滑与否和透明度等肉眼可辨的特征，
对从同一分离器官内分离到的菌株去除冗余菌株。
1． 2． 3 平板抑菌活性的测定。将供试植物病原菌用 0． 4 cm
打孔器制成菌饼，取 2块病原菌菌饼，相距约 3 cm放在 PDA
平板上，用接种环挑取内生细菌菌落，在 2 块病原菌菌饼之
间划线，28 ℃下培养，分别于 3、5 d后记录病原菌与待测菌
株的拮抗带宽度，设置 3 次重复，以拮抗带宽度稳定时的平
均值作为抑菌活性强弱的指标［12］。
1． 2． 4 田间试验。用生理盐水从 PDA平板上洗下辣椒疫霉
孢子，制得孢子悬浮液，用血球计数板计数，调节孢子浓度为
106 个 /ml;用生理盐水从平板上洗下山苍子内生细菌 B50，
制成 OD值 0． 5左右的菌悬液，备用。
将防治辣椒土传病害的农药甲基硫菌灵(Thiophanate-
methyl)按说明配制成 800 mg /kg 浓度溶液。选择生长一致
的辣椒苗 100株，平均分为 5组，每组 20株，其中 3组采用灌
根法接种辣椒疫霉病原菌。选择一组有明显感病症状(叶片
发黄，出现黑点)的植株，于盛花后 7 d，注射 B50菌悬液 2 ml
于每株辣椒茎内，作为辣椒疫霉病原菌 + B50 处理组;分别
以无任何处理为空白对照，只以辣椒疫霉病原菌感染为对
照，以辣椒疫霉病原菌感染后农药处理为阳性对照，只以
B50处理为阴性对照。每隔 7 d记录每株辣椒植株的病叶数
(出现卷叶、黑斑)、株高、直径、花、果等数据，取平均值。
2 结果与分析
2． 1 内生细菌的鉴定 从山苍子的根、茎、叶和果中分离出
内生细菌52株，其中根23株、茎8株、叶7株、果实14株。根
分离得到的内生菌最多，占总菌株数的 44． 23%，果实、茎次
之，叶最少。经 16S rDNA部分序列比对并结合菌落的形态
特征，鉴定出 5 株具有较好抑菌效果的菌株(表 1) ，分别为
B48、B50、B52和 B57，尤其是 B50 与巨大芽孢杆菌(Bacillus
megaterium)相似度超过 99%，所以将其归入该种，其菌落直
径大于 20 mm，乳白色，凸起，表面光滑，易挑起，边缘锯齿。
表 1 山苍子内生菌对 6种病原真菌的拮抗效果
编号 来源 种属 序列号
病原真菌
杨树溃疡
病原菌
小麦纹枯
病原菌
番茄灰霉
病原菌
小麦赤霉
病原菌
苹果炭疽
病原菌
辣椒疫霉
病原菌
B48 果实 Bacillus cereus JN252093 + + + + + + +
B50 叶 Bacillus megaterium JN252095 + + + + + + + + + +
B55 叶 Providencia burhodogranariea JN252100 + + +
B52 果实 Providencia rettgeri JN252097 + + + + + + + + +
B57 叶 Pseudomonas sp． JN252101 + + + + + + + + +
注:+ ．拮抗带宽 0 ～0． 5 mm;+ + ．拮抗带宽 0． 5 ～2． 0 mm;+ + + ．拮抗带宽≥2． 0 mm。
2． 2 内生菌的平板抑菌活性 52株内生细菌中有 5株对 6
种植物病原真菌的拮抗效果较好(表 1) ，其中 1 株叶内生细
菌 B50对小麦纹枯病原菌和辣椒疫霉病原菌的拮抗带宽度
大于 2 mm;另 1株叶内生细菌 B57对杨树溃疡病原菌、小麦
纹枯病原菌和小麦赤霉病原菌的拮抗带宽度也在 2 mm以上
(图 1和图 2)。
从来源来看，其中 3 株分离自叶内，2 株分离自果实内;
从种属来看，5株细菌分别与 Bacillus、Providencia属的 2个种
及 Pseudomonas 属的 1个未定种相似度最高，虽然以上 3 个
属的细菌，特别是 Bacillus属细菌是生防细菌的常用菌，但 52
株细菌中与该 5株细菌 16S rDNA部分序列相似甚至相同的
其他菌株并未体现出如此明显的抑菌效果，说明使该 5株细
菌产生抑菌作用的遗传特性与其种属缺乏必然联系，很有可
能是来自于其内生环境的长期驯化。
2． 3 田间试验结果 使用 B50对田间栽培的辣椒植株进行
辣椒疫霉病防治试验，结果表明接种辣椒疫霉病原菌后辣椒
植株出现明显症状，分别使用农药及 B50 菌株处理，14 d后
辣椒植株病症明显减轻(图 3) ，新生叶片感染明显降低，2个
试验组的病叶数均下降到 3%以下，农药的处理效果略好于
B50菌剂。但由于辣椒疫霉病原菌为土传病害，故未接种辣
椒疫霉病原真菌的 2个试验组也有不同程度的轻微感染，其
中空白加 B50菌悬液处理组最初感染情况较重，处理后明显
改善;空白组感染情况较轻，生长一段时间后症状消失，说明
辣椒植株有一定的自愈能力。
图 1 B57对辣椒疫霉病菌的抑制效果
383340 卷 6 期 林 娜等 山苍子内生细菌的分离及抑菌活性研究
图 2 B50对小麦赤霉病菌的抑制效果
图 3 B50对感病辣椒植株的作用
B50对辣椒生长也有一定的促进作用(表 2) ，与空白相
比，感病植株的平均高度低于正常植株，其形成的花朵及果
实数量也明显少于其他组。采用农药或 B50菌剂处理后，辣
椒生长情况均明显改善，但农药处理效果较快，7 d后辣椒植
株的生长即达到正常水平，但 B50 菌剂处理 14 d后，辣椒植
株生长情况及花、果数量均显著高于空白对照及农药处理
组，说明 B50菌剂对辣椒植株有持续的促生作用，仅采用该
菌剂接种的空白组也明显体现出这一规律。
3 讨论
(1)在黄芪中分离到具有高抑菌活性的菌株 Bacillus
subtilius［13］;茄科中分离的内生细菌有抑菌、促生作用的均为
芽孢杆菌(Bacillus sp．)［14］，和该试验分离的菌株同属不同
种，说明不同植物中都能分离到具有抑菌或促生作用的不同
种芽孢杆菌。
(2)有研究认为内生菌可通过自身的代谢产物或存在本
身借助于信号传导作用对植物体施加影响［15］，内生细菌的
良好防病性与其内生性密切相关，因为内生性使细菌受外界
环境影响小，从而使得其功能更加稳定［16］。该研究结果显
示，B50无论是在实验室还是在田间试验中，均对辣椒疫霉
病原菌表现出明显的抑制作用及对辣椒植株的促生作用，推
测其不仅可分泌某种物质抑制辣椒疫霉病原真菌的生长，而
且可通过某种途径刺激植物的应激反应，这种应激反应还可
能具有一定的延续效应，并通过这种延续效应促进植物生长。
(3)植物内生细菌在与寄主植物长期的协同发展过程中
彼此形成了相互依存、相互作用的生态学关系，对植物生长
发育、抵御病虫害、抵抗不良外界环境等具有广泛的生物学
作用，是可应用于改善植物生长条件、提高植物对不良环境
条件的抵御能力、减少病虫为害、提高植物对环境的治理能
力等多方面的天然资源［17 －18］，也是药物筛选的新热点。Ba-
cillus megaterium作为山苍子叶内生细菌，是一种不可多得的
生物药剂源。因此，利用山苍子内生菌制备微生物源农药，
研究适当的增效方式提高药效，同时探明其抑菌机理，进而
研究出一类新型高效微生物制剂，不但在生态环境保护方面
具有重要意义，还可扩大对山苍子资源的综合利用，从而使
其产业具有更广阔的发展前景。
表 2 B50菌株对辣椒生长的影响
处理
7 d后
株高∥cm 直径∥mm 花量∥朵 果量∥个
14 d后
株高∥cm 直径∥mm 花量∥朵 果量∥个
空白 17． 3 21． 2 10 1 22． 6 30． 8 40 8
辣椒疫霉感染组 16． 2 20． 8 6 0 18． 0 32． 7 17 5
辣椒疫霉感染 +农药处理组 17． 9 20． 8 18 1 21． 0 31． 3 36 11
辣椒疫霉感染 + B50处理组 18． 2 22． 0 15 3 19． 9 38． 0 42 15
空白 + B50处理组 19． 2 21． 8 19 3 21． 1 33． 2 40 14
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(下转第 3564页)
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征基本满足目标产品的设计要求。
表 3 表香香基配方
序号 原料名称 配比∥%
1 异戊酸乙酯 0． 40
2 乙酸香叶酯 0． 03
3 10%桂皮油 0． 30
4 10%缬草油 0． 30
5 α-松油醇 0． 30
6 胡萝卜籽油 0． 30
7 10%复盆子酮 0． 30
8 10% γ-十一内酯 0． 05
9 10%β-紫罗兰酮 0． 30
10 1%β-突厥烯酮 2． 50
11 50%茄酮 0． 30
12 10%呋喃酮 0． 50
13 5%乙基麦芽酚 2． 50
14 10%菊苣提取物 5． 00
15 10%秘鲁香膏 5． 00
16 津巴布韦烟挥发物 5． 00
17 1%乙基香兰素葡萄糖苷 10． 00
18 溶剂 66． 92
合计 100． 00
图 1 改造前后卷烟样品的质量特征对比
3 结论
通过潜香类物质乙基香兰素葡萄糖苷在“七匹狼”某牌
号低焦油卷烟 A中的香味补偿作用研究及功能性表香香基
的设计，结果表明:乙基香兰素葡萄糖苷作为糖苷类潜香物
质，在烟支燃吸过程中可发生热裂解，释放出乙基香兰素和
图 2 改造前后卷烟样品的评吸香气风格对比
图 3 改造前后卷烟样品的烟气特征对比
香兰素，而且酮类物质、酸类物质和杂环类物质等致香成分
含量都有不同程度的增加;改造后卷烟样品香气风格更加突
出，香气质、烟气的圆润性和满足感得到了提高，果香、辛香、
烘烤香和甜香部分得到了增强，同时增加了坚果香、奶香和
膏香，其口腔舒适度也得到改善。试验结果表明，乙基香兰
素葡萄糖苷能够起到增香、补香的效果，表明潜香物质在低
焦油卷烟中能够起到香味补偿作用。
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