全 文 ：RP-HPLC-ELSD测定山茱萸中齐墩果酸与熊果酸的含量
赵永席 , 　马国营 , 　梁　恒*
(西安交通大学生物医学信息工程教育部重点实验室 ,分离科学研究所 ,西安 710049)
收稿日期:2004-08-10
基金项目:国家自然科学基金重大研究计划资助项目(90209016)
作者简介:赵永席(1978～ ),男 ,博士研究生 ,研究方向:生化分析 ,电话:029-82663991。
*通讯作者:梁恒 ,博士生导师。
关键词:高效液相色谱;蒸发光散射检测;山茱萸;齐墩果酸;熊果酸
摘要:目的:建立反相高效液相色谱-蒸发光散射检测法(RP-HPLC-ELSD)测定山茱萸中齐墩果酸和熊果酸的含量。方
法:采用 Phenom enex C18(250 mm ×4. 6 mm .i d. , 5 μm)色谱柱 ,流动相为甲醇-0. 5 (体积分数)冰醋酸水溶液(体积比
为 87∶13),流速 0. 8m L m in- 1 , 柱温为室温;蒸发光散射检测器漂移管温度 65 °C, 载气(N2)流速 2. 0 L m in -1 ,撞击器
关闭。结果:在选定的条件下 ,齐墩果酸和熊果酸获得较好的分离。在齐墩果酸和熊果酸进样量分别为 1. 28 ～ 3. 84 μg
(r=0. 998 5)和 1. 16 ～ 3. 48μg(r=0. 997 8)时线性关系良好 ,其检出限分别为 0. 64 μg和 0. 58 μg(按 S /N=3计),平均
回收率分别为 96. 8 和 97. 5 , 相对标准偏差 RSD分别为 1. 36 和 1. 70 。结论:该方法简便可行 、灵敏 、准确 、重现
性好 , 可作为山茱萸药材质量的检测方法。
中图分类号:R284. 2　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2005)11-1314-03
　　山茱萸为山茱萸科(Cornaceae)植物山茱萸(Com us offi-
cinalis S ieb. e t Zucc. )除去果核的干燥成熟果肉 , 具有补益肝
肾 , 涩精固脱之功效 [ 1] 。现代药理研究表明 , 山茱萸具有较
好的调节免疫系统功能和显著的降糖作用。其中齐墩果酸 、
熊果酸为山茱萸的主要的活性成分之一 ,具有抗癌 [ 2] 、抗艾
滋病 [ 3] 、保肝 、降低血糖 、降酶 、抗菌 , 增强机体免疫功能 [ 4-5]
等重要作用。文献报道的其含量测定方法有薄层扫描法 [ 6] ,
HPLC-UV法 [ 7] 、MECC-UV 法 [ 8] 、 GC 法 [ 9] , 还有报道采用
HPLC-ELSD法对山茱萸中的熊果酸进行了含量测定 [ 10] 。
熊果酸和齐墩果酸为三萜酸类同分异构体 ,无共轭结构和强
的生色团 , 在紫外 204 nm有末端吸收 , 如用紫外末端吸收进
行定量分析 , 测定干扰大 ,分析灵敏度较低 ,同时传统的紫外
检测器在低波长时易发生基线漂移;气相法需要衍生化 , 过
程比较繁琐。 ELSD是一种通用型质量检测器 , 基于不挥发
样品分子对光的散射程度与其质量成正比而进行检测 , 对没
有共轭结构和生色基团的物质以及产生末端吸收的物质均
能产生响应 , 与其所含基团性质无关。 本实验采用 (RP-
HPLC-ELSD)同时测定山茱萸中齐墩果酸与熊果酸的含量 ,
结果表明该方法简便可行 、灵敏 、准确 、重现性好 , 可用于山
茱萸药材的质量控制 。
1　仪器与试药
　　Ag ilent 1100高效液相色谱仪 (真空脱气机 、四元泵 、手
动进样器);A llte ch-2000型蒸发光散射检测器(美国 , A lltech
公司);电热恒温水浴锅(北京化玻联医疗器械有限公司);
电子天平(Sa to riu s BL610, 0. 01 g, 及 BP221S, 0. 1 m g德国);
高速离心机 (TDL-5, 上海安亭科学仪器厂);旋转蒸发仪
(EYEIA日本);微孔滤膜(0. 45 μm)。
　　齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所);熊果酸
对照品(陕西惠科有限公司生产 , 纯度为 98 );甲醇(美国
F isher公司)为 HPLC 级 , 水为超纯水 , 其余试剂均为分析
纯;山茱萸药材经兰州军区中药研究中心副主任黄黎明鉴定
为植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb. e t Zucc. ),其产地和采
收时间见表 1。
表 1　 山茱萸药材样品
样品编号 产地 采收时间
1 河南西峡 2002年秋
2 陕西佛坪 2002年秋
3 陕西太白 2003年秋
4 河南西峡 2003年秋
5 陕西丹风 2003年秋
2　方法与结果
2. 1　液相色谱条件和 ELSD参数
色谱条件:色谱柱为 Phenom enex C18柱 (250 mm ×4. 6
mm .i d. , 5 μm):流动相为甲醇-0. 5 (体积分数)冰醋酸水
溶液(体积比为 87∶13),流速 0. 8 mL m in- 1;柱温为室温。
ELSD参数:漂移管温度 65 °C;雾化气体 (氮气 )流速
2. 0 L m in- 1;撞击器关闭式 ( Impaoto r o ff)。在此条件下对
照品及样品的分离结果见图 1。
2. 2　对照品溶液的制备
分别精密称取齐墩果酸标准品 3. 2 m g和熊果酸标准品
2. 9 mg, 置于 10 mL量瓶中 ,用甲醇溶解并稀释至刻度 , 配制
成 0. 32 g L -1齐墩果酸和 0. 29 g L - 1熊果酸的混合标准
溶液 ,摇匀备用。
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图 1　齐墩果酸和熊果酸对照品溶液(A)与山茱萸
样品溶液(B)的色谱图
1.齐墩果酸 2.熊果酸
2. 3　供试品溶液的配制
精密称取经干燥的山茱萸 20 g, 研细并过 60目筛后置
索氏提取器中 , 加 250 mL乙醚 ,水浴加热回流提取至近无色
(10 h), 提取液回收乙醚至干 ,残渣加适量甲醇微热使溶解 ,
定量转移至 50 mL量瓶中 , 加甲醇定容 , 摇匀。经 0. 45 μm
微孔滤膜过滤作为供试品溶液。
2. 4　线性关系考察
精密吸取对照品溶液 4, 6, 8, 10, 12μL, 分别进样进行分
析 , 按上述优化的色谱条件和蒸发光检测器参数测定峰面
积 , 以峰面积积分值的常用对数(1gY)为纵坐标 , 以标准品
进样量(μg)的常用对数( lgX)为横坐标进行回归分析 , 其回
归方程见表 2。
表 2　 齐墩果酸和熊果酸的回归方程
组分 回归方程 相关系数 线性范围(μg)
齐墩果酸 lgY =5. 4553+1. 1445 lgX r=0. 9985 1. 28～ 3. 84
熊果酸 lgY =4. 6977+1. 4330 lgX r=0. 9978 1. 16～ 3. 48
　　结果表明 , 当齐墩果酸和熊果酸的进样量分别在 1. 28
～ 3. 84 μg和 1. 16 ～ 3. 48μg之间时 , 被测物进样量 (μg)的
常用对数与其 ELSD的响应值的常用对数呈良好线性关系。
2. 5　精密度和检测限试验
精密吸取标准品溶液重复进样 5次 , 每次进样 10 μL,
以测得的峰面积为指标 , 齐墩果酸和熊果酸的相对标准偏差
RSD分别为 1. 98 和 1. 67 。以系列浓度的标准溶液进样
分析 , 测得齐墩果酸和熊果酸的最低检测限分别为 0. 64 μg
和 0. 58 μg(按 S /N=3计)。
2. 6　稳定性试验
取熊果酸和齐墩果酸的对照品溶液 , 在放置 1, 2, 4, 8,
16, 24, 48 h后进样 , 每次 10 μL,测定峰面积值 , 结果表明熊
果酸 、齐墩果酸在 48 h内稳定性良好 , RSD分别为 1. 87 和
1. 94 。
2. 7　样品含量的测定
取不同产地的山茱萸药材供试品溶液在上述的色谱条
件下进样。每次进样 20 μL, 测定峰面积 , 按外标法计算其
中的齐墩果酸和熊果酸含量 ,结果见表 3。
2. 8　重复性试验
精密称取同一山茱萸样品 5份 , 按上述供试品溶液制备
方法和色谱条件测定 ,结果熊果酸 RSD =1. 81 , 齐墩果酸
RSD =1. 73 。
表 3　 山茱萸中齐墩果酸和熊果酸的含量(n=3)
产地 齐墩果酸含量
/
RSD /
熊果酸含量
/
RSD
/
河南西峡 0. 0353 2. 18 0. 249 2. 97
陕西佛坪 0. 0188 1. 36 0. 191 1. 70
陕西太白 0. 0275 1. 92 0. 210 1. 97
河南西峡 0. 0459 2. 58 0. 274 2. 14
陕西丹风 0. 0487 2. 76 0. 254 2. 53
2. 9　加样回收率试验
称取已测知齐墩果酸和熊果酸含量的山茱萸样品 1 g,
共 3份 ,分别精密加入一定量的齐墩果酸和熊果酸的对照
品 ,按上述样品溶液的制备方法制备样品和色谱条件测定其
含量 ,计算回收率 , 结果见表 4。
表 4　 齐墩果酸和熊果酸的回收率
样品 样品中含量 /mg
对照品
加入量
/m g
测得
总量 /m g
回收率
( )
回收率
平均值
( )
RSD
/
熊果酸 1. 91 1. 71 3. 57 97. 1
1. 91 1. 64 3. 45 93. 9 95. 3 1. 64
1. 91 2. 12 3. 92 94. 8
齐墩果酸 0. 188 0. 250 0. 430 96. 8
0. 188 0. 185 0. 369 97. 8 96. 3 2. 98
0. 188 0. 164 0. 343 94. 5
3　讨论
3. 1　提取条件的选择
选择 90 乙醇水浴回流提取 、90 乙醇索氏提取 、乙醚
水浴回流提取 、乙醚索氏提取等方法。结果表明 , 用乙醚索
氏提取方法 ,提取 10 h, 提取物杂质较少 , 易于测定 , 所测得
山茱萸中熊果酸和齐墩果酸的含量高于其他方法 , 提取效率
高。
齐墩果酸和熊果酸易溶于乙醚 、氯仿等极性较小的溶
剂 ,可溶于乙醇。相对氯仿而言 , 乙醚易挥发 ,只需较低温度
即可达到提取所需温度 , 操作相对容易 ,实验条件易于控制。
山茱萸中大多数成分都可溶于 90 乙醇 , 只有少数非极性
成分溶于乙醚 ,因此采用乙醚作为提取溶剂 , 提取所得到的
杂质少 ,分离和检测时干扰小。
3. 2　ELSD条件的选择
3. 2. 1　ELSD漂移管(D rift Tube)的温度选择
漂移管温度和载气流速是 ELSD检测器的两个重要参
数 ,温度低时 , 溶剂挥发不够完全;温度高时 , 由于分析样品
部分挥发导致检测器响应下降。载气流速太低时 , 会形成大
量微滴 ,从而导致尖峰信号或噪音信号;另一方面当载气流
速太高时微滴会大量下降 , 导致信号响应降低。在恒定干燥
空气流速 2. 0 L m in- 1条件下 , 从 55 °C到 95°C, 以 10 °C为
步长 ,进 8 μL对照品溶液于高效液相色谱仪中 , 按上述色谱
条件进行测定 ,以熊果酸为基准 , 观察信号与噪音变化情况
(S /N),由图 2可见 ,选定 65°C为理想的实验温度。
3. 2. 2　蒸发光散射检测器气体流速的选择
在恒定温度 65 °C条件下 , 从 1. 8 L mm - 1到 2. 2 L
m in - 1为步长 , 以 0. 1L m in- 1为步长 , 进 8μL对照品溶液
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图 2　温度-信噪比 图 3　压力-信噪比
于高效液相色谱仪中 ,按上述色谱条件进行测定 , 以熊果酸
为基准 , 观察信号与噪音变化情况(S /N), 由图 3可见 , 选定
2. 0 L m in- 1为理想的实验气体流速。
3. 3　色谱流动相的选择
由于 ELSD本身检测方法的限制 , 流动相最好采用具有
挥发性的溶剂(甲醇 、乙腈等),在不对分离和检测产生影响
的情况下 , 同时兼顾分析成本 , 所以选用甲醇和水作为流动
相基本组成成分。熊果酸和齐墩果酸为三萜酸类同分异构
体 , 在中性流动相中三萜酸可解离 , 从而使保留时间缩短 , 分
离效果变差。通过加入适量冰醋酸调节流动相 pH 值 , 可以
抑制齐墩果酸和熊果酸的解离 , 增大其分布系数 , 从而改善
各色谱峰的峰形和分高度 ,并使其保留时间也有所增加。选
择不同配比和不同酸度的甲醇-水作为流动相进行考察 , 结
果发现 , 甲醇浓度的增减对齐墩果酸和熊果酸的分离和保留
时间有显著影响 , 冰醋酸的含量对齐墩果酸和熊果酸分离有
较大影响。冰醋酸含量太高 , 两成分虽可很好地分开 ,但保
留时间过长 , 色谱峰易变宽 、钝 ,同时使流动相气化不完全 ,
基线噪声增大 , 影响分析的灵敏度;冰醋酸含量太低时 , 对于
齐墩果酸和熊果酸两物质的解离抑制作用太小 ,使得其难以
达到很好的分离。经过反复实验 ,选择甲醇-0. 5 冰醋酸水
溶液(体积比 87∶13)作为流动相 ,在此条件下 , 齐墩果酸和
熊果酸达到了较好的分离。
致谢:感谢陕西汉江药业股份有限公司给予本研究的部分经
费支持。
参考文献:
[ 1] 　潘扬 ,王天山.植物山茱萸化学成分的研究概况 [ J] . 南京中
医药大学学报 , 1998, 14(1):61-61.
[ 2] 　H su H Y, Yang J J, Lin C C. E ffoets of oleanolic acid and u rsolic
on inh ib iting tumor grow th and enh ancing the recovery of hem ato-
poietic system pos tirradiation inm icer[ J] . Cancer lett, 1997, 111:
7-13.
[ 3] 　Kash iw ada Y,W ang H K , Nagao T, et a l. An ti-A IDS Agen ts 30.
An ti-H IV activi ty of oleanolic acid, pom olic acid, and structrually
relate triterpenoid es[ J] . J Na tP rod, 1998, 61(9):1090-1095
[ 4] 　田丽婷 ,马龙 ,堵年生.齐墩果酸的药理作用研究概况 [ J] .中
国中药杂志 , 2002, 27(12):884.
[ 5] 　孙来九 ,王文丰 ,郭人民 , 等.以枸骨叶为原料提取熊果酸工
艺的研究 [ J] .现代化工 , 2000, 20(9):47-48.
[ 6] 　冀春茹 ,袁珂 ,胡润淮 ,等.冬凌草中熊果酸 ,齐墩果酸的薄层
扫描测定 [ J] .中医药学报 , 1997, (6):43-44.
[ 7] 　徐德然 ,丁晴 ,王峥涛. HPLC法测定山茱萸及知柏地黄丸中
齐墩果酸 、熊果酸的含量 [ J] . 中草药 , 2002, 33(11):996-
997.
[ 8] 　Liu H X, Sh i Y H , W ang D X, et a l. MECC determ inat ion of
O leanolic acid and Ursolic acid isom ers in Ligu strum lucid um Ait
[ J] . J Pharm B iom ed ica l Ana l, 2003, (32):479-485.
[ 9] 　闫花丽 ,赵陆华 ,朱丹妮 , 等.衍生化气相色谱法测定下枯草
中齐墩果酸和熙果酸的含量 [ J] . 中国中药杂志 , 1999, 24
(12):744-746.
[ 10] 　鄢立新 ,唐卫文 ,及元乔.高效液相色谱法蒸发光散射检测器
测定山茱萸药材中熊果酸的含量 [ J] . 药物分析杂志 , 2003,
23(5):358-360.
新疆大戟挥发油化学成分分析
王武宝 1, 2 , 　巴　杭 2 , 　阿吉艾克拜尔 艾萨 2 , 　廖立新 2 , 　多力坤2
(1中国科学院研究生院 ,北京 100039;2中国科学院新疆理化技术研究所 ,新疆 乌鲁木齐 830011)
收稿日期:2004-08-12
作者简介:王武宝(1980～ ),男 ,山东省临沂市人, 2002级中国科学院新疆理化技术研究所在读硕士研究生 ,研究方向:天然有机专业
电话:0991-3835679, E-mai l:w angwubao1980@yahoo. com. cn.
关键词:新疆大戟;挥发性成分;色谱-质谱仪
摘要:利用气相色谱-质谱联用技术对植物新疆大戟挥发油化学成分进行了分析研究。从该植物挥发油中分到 52个成
分 , 鉴定出 49个成分 , 所鉴定的成分占挥发油色谱总峰面积 97. 54 。
中图分类号:R284. 1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2005)11-1316-02
　　新疆大戟(E uphorbia jaxartica P rokh. )为大戟属(Euphor-
bia L. )半灌木状草本植物 , 又名线叶大戟 , 在国内仅分布于
新疆南部地区 , 国外哈萨克斯坦 、吉尔吉斯斯坦 、塔吉克斯
坦 、乌兹别克斯坦也有分布 [ 1, 2] 。由于大戟属多具有气味 ,
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