全 文 ：·研究报告·
从南方山荷叶分离出一株产鬼臼毒素类似物的内生真菌＊
曾松荣1 ,邵　华2 ,张玲琪3
(1.韶关学院生物工程系 ,广东 韶关　512005;2.云南省微生物研究所 ,云南昆明　650091;
3.云南大学生物系 ,云南 昆明　650091)
摘　要　从南方山荷叶(Diphylleia sinensis)的根 、根状茎及叶柄部位共分离出 54 株内生真菌。通过薄层层析
(TLC)对 54 株内生真菌的液体发酵培养物进行了初步分析 ,再采用高效液相色谱(HPLC)做进一步检测 , 得
到 1 株产鬼臼毒素类似物的内生真菌(SJ21), 经鉴定为纠错青霉(Penicillium implicatum)。
关键词　南方山荷叶;鬼臼毒素;内生真菌;纠错青霉
中图分类号　Q936　　　文献标识码　A　　　文章编号　1005-7021(2004)04-0001-02
　　山荷叶属(Diphyl leia)中的南方山荷叶(Di-
phy lleia sinensis)也被称之为窝儿七 、山荷叶等 ,是
特产于我国的一种传统草药 ,其根状茎入药具有
清热解毒 、活血散瘀 、消炎止痛等功效[ 1] ;在根状
茎等部位含有的鬼臼毒素(Podophylltoxin),是治
疗尖锐湿疣的良好药物 ,亦是合成多种治疗癌症
药物的前体 ,因而具有较大的经济价值[ 2] 。该植
物在云南省主要分布于维西 、丽江 、中甸 、德钦等
县海拔 2 800 ～ 3 000 m 的杂木林中;甘肃南部 、
陕西南部 、湖北西部 、四川亦有[ 3] 。由于南方山荷
叶生长缓慢 ,对生境要求苛刻 ,自然分布较少 ,因
此其野生资源很有限 。人们为了商业上的利益而
不断采挖野生的植株 ,其野生资源已经遭到了极
大的破坏。为避免对有限的鬼臼类植物资源的破
坏 ,保护生物多样性 ,利用微生物资源 ,为微生物
发酵法生产抗癌药物鬼臼毒素进行初步探索 。
1　材料与方法
1.1　材料
样品来源　南方山荷叶样品采自云南中甸。
1.2　方法
1.2.1　内生真菌的分离方法　将南方山荷叶样
品用自来水冲洗干净 ,取其根 、根状茎 、叶柄 ,均剪
切成 2 ～ 3 cm 的小段 。以下全过程在超净工作台
上按无菌操作 。样品的表面消毒按下列程序进
行:75 %酒精漂洗(3 ～ 5 s)※0.1 %升汞漂洗(4
～ 5 min)※无菌水冲洗 4 ～ 5 次。将上述处理过
的根 、根状茎剥开取其韧皮部 ,叶柄剪开去其髓
部 ,然后分别把这 3个部位材料的外围剪去 ,并依
次剪切成 0.5 cm ×0.5 cm小片 ,分别种植于马铃
薯葡萄糖琼脂培养基(简称 PDA)平板上 , 置 28
℃温箱培养 3 ～ 7 d ,即可见样品边缘有真菌菌丝
和细菌菌苔长出。本实验以丝状真菌为分离目
标 ,丝状真菌经纯化后转接到 PDA 斜面上备用。
为了检查材料表面消毒的效果 ,进行如下对照实
验:将上述同样表面消毒过的材料不做剪切 ,直接
种植于 PDA平板上 ,结果对照材料周围均无任何
菌长出 ,证明表面消毒彻底 ,从而保证分离到的真
菌是植株上的内生真菌 ,而不是表面的附生菌 。
1.2.2　真菌的鉴定　按常规鉴定方法进行[ 4] 。
1.2.3　液体培养　将 100 mL 改良的基础培养
基(MM)装入 500 mL 的三角瓶中 ,每个菌号装 5
瓶 ,共 500 mL。挑取适量的菌丝或孢子接种于三
角瓶中 ,置于 28 ℃摇床上(110 r/min)培养 6 d ,
培养物经 2层纱布过滤 ,分别收集菌丝体和滤液;
菌丝体经捣碎后过滤 ,合并滤液 。用等体积氯仿
进行提取 、蒸馏浓缩 ,供测试使用。另外 ,不接种
任何菌株 ,在上述设定条件下 ,一起摇瓶 、提取 、蒸
馏浓缩 ,作为空白对照实验 。
1.2.4　产物的检测　①薄层层析(TLC)分析:鬼
臼毒素标准样品购自 SIGMA 公司;TLC 用硅胶
G板 ,购自青岛海洋化工厂分厂;采用氯仿-甲醇
(95∶5体积比)和氯仿-乙酸乙酯(8∶2 体积比)做
展开剂;显色剂为浓硫酸-乙醇(1∶1 体积比);120
℃烘烤 5 min。将上述每个菌株的发酵浓缩液和
对照一同进行薄层层析(TLC)分析 ,比较。 ②高
效液相色谱(HPLC)分析:为了进一步证实 TLC
初筛到的菌株是否产生鬼臼毒素 ,对这些菌株进
行扩大培养 ,每个菌株发酵 5 L ,按上述同样的发
酵方法培养 6 d 后进行提取和浓缩 , 然后采用
HPLC方法做进一步分析 ,同样做对照实验。
2　结　果
2.1　菌株分离结果
收稿日期:2004-03-04
作者简介:曾松荣　男 ,理学硕士 ,讲师。现主要从事微生物学教学及科研工作。
　　　　　＊国家自然科学基金(39860005)资助项目
1微生物学杂志 2004年 7月 第 24卷第 4期　JOURNAL OF MICROBIOLOGY July 2004 Vol.24 No.4
　　本次实验共分离到 54 株内生真菌。其中根
部 6株 ,根状茎 35 株 ,叶柄 13 株 。
2.2　TLC及 HPLC检测结果
2.2.1　TLC分析结果　对分离到的 54 株真菌
和空白对照的提取物 ,均作薄层层析(TLC)初测 ,
发现根状茎中的 SJ7和 SJ21共 2 株菌的发酵浓
缩液在与标准样品迁移率相同的位置上 ,均有斑
点出现 ,而其它菌及空白对照在相应的位置却没
有斑点出现。为了进一步核实所得结果 ,对这 2
株菌的提取物重复进行 3 次 TLC 实验 ,结果发现
SJ7和 SJ21这 2 株菌的 Rf值在上述 2 种不同的
展开剂中均与标准样品的 Rf值相同。
2.2.2　HPLC分析结果　在上述设定条件下 ,样
品SJ21 的分离效果好。从图 1 可见 ,SJ21 保留
时间 tR4.29 min 的波峰与标准样品保留时间
tR4.34 min的波峰一致 。在相同条件下 ,重复 3
次均如此 ,可见 SJ21 的培养物中可能有鬼臼毒
素。而空白对照和 SJ7在同样条件下通过 HPLC
检测 ,没有与标准样品一致的保留时间 ,从而证明
SJ7不产鬼臼毒素。为了进一步确认 SJ21 能够
产生鬼臼毒素 ,在 SJ21发酵液的浓缩液中加入标
准样品来增加峰高的方法进行实验 。其步骤是:
首先用 SJ21的发酵浓缩液作色谱图 ,然后将标准
样品加到 SJ21的发酵浓缩液中去 ,在相同条件下
作色谱图;对比这 2 个色谱图 ,若后一色谱图中
在相应的保留时间 tR4.29 min的色谱峰相对增
高时 ,则该色谱峰的组分原则上与标准样品是同
一种化合物[ 5] 。最后把标准样品 、SJ21和加有标
准样品的 SJ21的 3 个色谱图叠放在一起 ,则可以
看出它们相应的色谱峰完全重合 。因此 , SJ21菌
株的发酵代谢产物中至少含有鬼臼毒素类似物。
图 1　鬼臼毒素(标准样品)、样品 SJ21 、加有标准
样品的 SJ21的 HPLC和这 3个图的重叠图
2.2.3　产鬼臼毒素类似物菌株种的鉴定　菌落
特征:在查氏培养基上 ,菌落生长局限 、12 ～ 14 d
直径 1.5 ～ 2 cm ,质地致密 ,绒状 ,无气味 ,产生大
量孢子 ,产孢面浓蓝绿色 ,背面及培养基呈黄褐
色;帚状枝特征:帚状枝由小梗组成 ,分生孢子梗
不分枝 ,产生单轮帚状枝 ,小梗 11.7 μm ×2 μm;
孢子特征:分生孢子球形至亚球形 ,表面光滑 ,大
小为 2.8 μm 。根据以上特征 , SJ21 被鉴定为纠
错青霉(Penici ll ium implicatum Biourage)[ 4] 。
3　讨　论
　　本研究的结果表明:在南方山荷叶植株体内 ,
真菌的种类相当丰富 ,经初步分离即获得 54 株。
个别菌株通过发酵能产生与宿主植物相似的生理
活性物质 ,反映了南方山荷叶植物中的内生真菌
具有一定的潜在应用价值。今后 ,将继续深入开
展本研究的有关工作 ,包括对该菌株的代谢产物
中鬼臼毒素类似物确定结构 ,以及对菌种进行加
工和发酵条件的优化等工艺改造工作 ,为将来进
一步的研究和生产奠定基础。
参　考　文　献
[ 1] 　中国医学科学院药物研究所.中药志(第一册)[M ] .北京:人
民卫生出版社 , 1979 , 250～ 252.
[ 2] 　陈毓亨.我国鬼臼类植物资源的研究[ J] .药学学报 , 1979 ,
14:101～ 103.
[ 3] 　中国科学院昆明植物研究所.云南植物志(第七卷)[ M ] .北
京:科学出版社 , 1997 ,7.
[ 4] 　魏景超.真菌鉴定手册[ M ] .上海:上海科学技术出版社 ,
1979 , 534～ 566. [ 5] 　杨根元 ,金瑞祥 ,应武林.实用仪器
分析(第二版)[ M] .北京:北京大学出版社 , 1997 , 176.
An Endophytic Fungus Producing a Substance Analogous to
Podophyllotoxin Isolated from Diphylleia sinensis
ZENG Song rong1 , SHAO Hua2 ,ZHANG Lingqi3(1.Departmen t of Biotechnology , Shaoguan University , Shaoguan 512005;2.Yunnan Inst itute of M icrobiology , Kunming 650091;
3.Department of Biology , Yunnan University , Kunming 650091)
Abstract　54 fungal isolates were isolated from the roo ts , r hizomes and petioles of Diphylleia sinensis w hich grew in
Zhongdian county , Yunnan province.In the light of the test of fung i metabolites by TLC and HPLC , one isolate(SJ21)of the
endophy tic fungi , which could produce a substance analogous to podophy lltoxin , was selected.SJ21 is Penicillium implicatum
through identification.
Keywords　Diphylleia sinensis , Podophyllto xin , Endophytic fungi , Penicillium implicatum .
2 　　　　微　生　物　学　杂　志　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　24卷