全 文 ：mg·mL-1 and(0.97±0.15)g·mL-1 , and in colon was(0.95±0.26)mg·mL-1 and(0.30±
0.08)mg·mL-1 , respectively.Conclusion:It is given that lactitol is poorly absorbed from the
gast rointestinal tract of rat , and is rapidly metabolized by the bacteria of the colon , and might be ab-
sorbed appropriately.
Key words　high performance liquid chromatog raphy , lacti tol , intestinal liquid
HPLC法分离和测定山荷叶中的鬼臼毒素
俞培忠
(上海医科大学天然药化教研室　200032)
姚莉韵　王丽平
(上海第二医科大学化学教研室　200025)
摘要　目的:建立高效液相色谱法分离和测定山荷叶中鬼臼毒素的方法。 方法:色谱柱 Whatman
PartiShere C18 , 流动相 甲醇-0.1 mol·L-1磷酸氢二钾 (50∶50), 检测波长 290 nm。结果:鬼臼毒
素的线性范围 0.026 ～ 0.130μg , r=0.9997 , 回收率为 101.4%, RSD =1.2%。结论:方法准确 、
快速 、 简便。可用于其它鬼臼类植物中鬼臼毒素的测定。
关键词　山荷叶　鬼臼毒素　高效液相色谱法
　　南方山荷叶 (Diphyl leia sinensis Li)为
小檗科山荷叶属植物 , 分布于陕西 、 甘肃 、
四川 、 云南和湖北等省 , 主要用于治疗蛇咬
伤 、痈疖肿毒 、 跌打 、 风湿筋骨痛及气管炎
等症[ 1] 。其主要成分之一的鬼臼毒素为一系
列人工合成的抗癌新药 (如 VP -16 、 VM-
26等)的前体。对其成分的测定有比色法[ 2]
和薄层色谱扫描法[ 3] , 已有多篇论文报道了
用HPLC法来测定小檗科桃儿七属和八角莲
属植物中鬼臼毒素的含量[ 4～ 6] 。我们也曾参
照了上述方法来分离和检测鬼臼毒素 , 但发
现山荷叶中的 1个未知成分与鬼臼毒素部分
重叠 , 未能完全分离 , 有关这种情况尚未见
上述文献进行探讨 。为此 , 我们对此进行了
研究。最后得到了较满意的高效液相色谱流
动相的组成 , 同时也考察了不同的溶剂和提
取方法对鬼臼毒素含量测定的影响 。
1　仪器 、 试剂和药品
Hewlett-Packard 1100 高效液相色谱仪 ,
四元梯度泵 , DAD检测器 , HP ChemStation
化学工作站。甲醇 (色谱纯), 双蒸水 , 鬼臼
毒素对照品 (98%, Sigma 公司), 生药购自
湖北巴东 , 经江苏植物研究所邓懋彬教授鉴
定为南方山荷叶 (Diphyl leia sinensis Li)。
2　实验方法
2.1 　色谱条件 　色谱柱:Whatman Par-
tiShere C18 (125 mm×4.6 mm , 粒径 5μm),
流动相:甲醇-0.1 mol·L-1磷酸氢二钾 (pH
≈7.5)(50∶50), 流速:1.0 mL·min-1 , 检
测波长:290 nm , 柱温:25 ℃。
2.2　线性范围　精密称取鬼臼毒素对照品 ,
用流动相稀释成浓度为 2.6 、 5.2 、 7.8 、
10.4和 13.0 μg·mL-1的溶液 , 分别进样 10
μL (重复进样 3 次), 测得鬼臼毒素的平均
峰面积分别为 11.85 、 23.65 、 34.54 、 46.28
和 58.91 , 以对照品溶液浓度 (μg·mL-1)
为横坐标 , 色谱峰面积为纵坐标 , 得一线性
方程为:
·35·　19 (1), 1999 　
DOI :10.16155/j.0254-1793.1999.01.012
Y =0.021+4.49 X 　r =0.9994
2.3　加样回收率试验　进行加样回收率试
验 , 按含量测定项下操作 , 测得平均回收率
为 101.4 %, RSD 为 1.2 %, n=3。
2.4　精密度试验　取样品测定项下的溶液 ,
按含量测定项下操作 , 重复进样 6次 , 测得
鬼臼毒素的峰面积 , RSD 为 0.9 %。
2.5　溶剂及抽提方法的试验　分别采用不同
的溶剂 (甲醇 、 乙醇 、 丙酮和氯仿)及提取
方法 (索氏提取和超声波抽提)来测定鬼臼
毒素的提取效果 。其中以 80%的甲醇水溶
液 , 用超声波抽提所得到的溶液中鬼臼毒素
的含量为最高 , 约比用乙醇回流 8 h 高出
10%。另外比较了抽提时间的影响 , 发现用
超声波抽提 30 min和 60 min基本上没有差
别。所以 , 最后确定样品的提取方式为用
80%的甲醇水溶液超声波振荡 30 min 。
2.6　样品测定　分别精密称取3份山荷叶根
茎的粉末 25 mg 于 25 mL 的容量瓶中 , 加
80%的甲醇水溶液适量 , 用超声波振荡 30
min , 溶液冷却至室温后 , 再用 80%的甲醇
水溶液稀释至刻度 。摇匀后离心 , 取上清液
10 μL , 注入高效液相色谱仪 , 重复进样 3
次 , 测得鬼臼毒素的平均峰面积 , 以外标法
测定其含量。测得山荷叶中鬼臼毒素的含量
分别为 7.4 %、 7.5 %和 7.8 %。
3　讨论
3.1　流动相的选择　我们参照文献[ 4 ～ 8] ,
用甲醇-水 (50∶50)作为流动相 , 但同时使
用了 206 、 265 和 290 nm 3 个波长来检测 ,
结果发现在206和290 nm 处 , 鬼臼毒素表现
为峰前延或有一肩峰 , 与文献报道的色谱图
相似 , 而在 265 nm , 则明显有一未知成分未
能与鬼臼毒素分离 (图 1)。由 DAD检测器
测得该杂质在 262 nm 处有最大吸收 , 而鬼
臼毒素在 206和 290 nm 处有最大吸收 , 相对
在265 nm 处吸收较小 , 所以才有上述结果 。
为此 , 我们选择了不同类型和浓度的缓冲液
及离子对试剂对该杂质和鬼臼毒素进行分离 ,
但在酸性条件下 , 与甲醇的比例为 50∶50时 ,
结果与甲醇-水 (50∶50)一样 , 甲醇比例降
低时 , 该杂质峰反而与鬼臼毒素合并为 1 个
峰。于是我们选择了 0.1 mol·L -1的磷酸氢
二钾 (pH ≈7.5)缓冲液 , 当流动相中甲醇
和 0.1 mol·L-1的磷酸氢二钾缓冲液 (pH ≈
7.5)的比例为 50∶50时 , 这一未知成分与鬼
臼毒素达到了完全分离 (图 2), 在此条件
下 , 鬼臼毒素的出峰时间约为 7.5 min , 达
到了快速分析的目的。
图 1　文献流动相山荷叶色谱图
1.鬼臼毒素　2.未知成分
A.λ=290 nm　B.λ=265 nm
图 2　本法流动相山荷叶色谱图
1.鬼臼毒素　2.未知成分
A.λ=290 nm　B.λ=265 nm
3.2　改用超声波法振荡抽提后 , 不仅简化了
提取方法 , 大大地缩短了提取时间 , 而且也
减少了由提取操作引入的误差 , 提高了鬼臼
毒素的提取率 。
3.3　由 HPLC 法测得山荷叶中鬼臼毒素的
含量比文献[ 1]报道的要高 , 这可能与植物的
产地 、干燥程度 、 提取方法以及测定方法等
·36·　 药物分析杂志　
有关 。
参考文献
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人民卫生出版社 , 1975.112
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1979 , 14 (2):101
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7 　Cai rnes DA.High performance liquid chromatography of
podophyllotoxins and Related lignans.J Nat Prod , 1981 ,
44 (1):34
8 　Lim CK.High -performance liquid ch romatography of
aryltet rahydronaphthalene lignans.J Chromatogr , 1983 ,
255:247
(本文于 1998年 8月 10日修改回)
Separation and Determination of Podophyllotoxin
in Diphylleia sinensis Li
Yu Peizhong
(Depar tment o f Chemist ry of Natural Drugs , Shanghai Medical U niversity , Shanghai 200032)
Yao Liyun and Wang Liping
(Department of Chemist ry , Shanghai S econd Medica l U niversi ty , Shanghai 200025)
Abstract　Objective:To develop a HPLC method fo r separation and determination of podophyllo-
toxin in Diphy lleia sinensis Li.Methods:Whatman PartiShere C18 column(4.6 mm×125 mm , 5
μm)was used w ith a mobile phase of methanol and 0.1 mol·L-1 K2HPO4 (50∶50), and UV detec-
tor at 290 nm.Results:The linear range of podophyllotoxin w as 0.026 ～ 0.130 μg.r =0.9997.
The recovery rate w as 101.4%(RSD =1.2%).Conclusion:This method is accurate , rapid , and
simple fo r the determination of podophyllotoxin in podophy llin-bearing plants.
Key words　Diphyl leia sinensis Li , podophylloto xin , HPLC
·37·　19 (1), 1999