全 文 ：第 34卷　第 2期
2010年 3月
南京林业大学学报(自然科学版)
JournalofNanjingForestryUniversity(NaturalScienceEdition)
Vol.34, No.2
Mar., 2010
htp://www.nldxb.com
　收稿日期:2009-05-22　　　　修回日期:2009-10-26
　基金项目:“十一五 ”国家科技支撑计划(2006BAD24B08);江苏省高技术项目(BG2006319)
　作者简介:江荣翠(1982—),博士生。 ＊彭方仁(通信作者),教授。 E-mail:frpeng@njfu.edu.cn。
　引文格式:江荣翠 ,彭方仁 ,谭鹏鹏 ,等.楸树体细胞胚胎发生的研究 [ J] .南京林业大学学报:自然科学版 , 2010, 34(2):15-18.
楸树体细胞胚胎发生的研究
江荣翠 ,彭方仁＊ ,谭鹏鹏 ,郝明灼
(南京林业大学森林资源与环境学院 , 江苏　南京　210037)
摘要:以楸树近成熟种子培养无菌苗 ,以无菌苗子叶和下胚轴为外植体进行体细胞胚胎发生研究 ,
观察了体细胞胚胎的发育过程 ,分析了不同生长调节物质对楸树体胚发生的影响。结果表明:各培
养基均能诱导出愈伤组织;1/2MS+0.01 mg/LNAA+1.00 mg/L6-BA可调整愈伤至胚性愈伤 ,
是体细胞胚胎诱导频率最高的培养基;带少量愈伤的体胚可在 1/2MS0和 1/2MS+1.00 mg/L
6-BA+0.01mg/LNAA的培养基上增殖 ,且增殖系数较大。
关键词:楸树;愈伤组织;体细胞胚胎发生
中图分类号:S722;Q948　　　文献标志码:A　　　文章编号:1000-2006(2010)02-0015-04
StudyonsomaticembryogenesisofCatalpabungei
JIANGRong-cui, PENGFang-ren＊ , TANPeng-peng, HAOMing-zhuo
(ColegeofForestResourcesandEnvironment, NanjingForestryUniversity, Nanjing210037, China)
Abstract:Theprocessofsomaticembryogenesis(SE)ofCatalpabungeiandtheeffectsofdiferentgrowthregulatorson
SEwerestudiedwithexplantsofcotyledonsandhypocotylsofseedlings.Theseedlingswereculturedfromnearmatured
seedsofC.bungei.Theresultsshowedthatcaluscouldbeinducedoneachmediuminthispaper.Caluscouldbetrans-
ferredtoembryogeniccallusonthemediumof1/2MS+0.01mg/LNAA+1.00 mg/L6-BA, onwhichtheSEwerein-
ducedwiththehighestfrequency.TheSEwereabletoproliferateonthemediumof1/2MS0 and1/2MS+1.00 mg/L
6-BA+0.01mg/LNAAwithhighmultiplicationcoefficient.
Keywords:CatalpabungeiC.A.Mey;calus;somaticembryogenesis
　　楸树(CatalpabungeiC.A.Mey)材质优良 、用途
广泛 。楸树优良无性系生长速率和单位材积可分别
比原有品种提高 40%和 30%[ 1] 。楸树为异花或异
株授粉 ,单株或同一无性系的植株由于自花授粉不
亲和 ,往往花而不实 ,实生树或不同无性系经昆虫传
粉 ,即使能结实 ,结实量也很少 ,出种率仅 10 %[ 2] 。
其他传统无性繁殖方法因诸多原因造成了楸树繁殖
困难 ,如根插因取材困难 ,不能满足生产需求;而嫁
接繁殖成本高 、技术难度大 、生产周期较长 、后期生
长常表现衰退现象 ,且嫩枝扦插的生根率不高 ,楸树
的广泛利用受到了制约。目前也有学者对楸树的组
织培养和快繁技术进行了研究[ 3-4] ,但未能在生产
实践中大规模应用。
木本植物体细胞胚胎发生比较困难 ,但是部分
树种也取得了很大突破 , 如挪威云杉[ 5-6] (Picea
abies)、白云杉[ 7] (Piceaglauca)、火炬松 [ 8] (Pinus
taedaL.)、辐射松[ 9] (Pinusradiate)、鹅掌楸[ 10-11]
(Liriodendronchinense)、杨树 [ 12] (Populus)等。该
研究以杂交楸树近成熟种子培养无菌苗 ,以无菌苗
子叶和下胚轴为外植体进行体细胞胚胎发生研究 ,
以期为楸树繁育开辟新的途径 ,为进一步在分子水
平上研究胚胎发生及遗传转化奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　材料来源及处理
选取南京林业大学校园内滇楸 ,于花期以楸树
花粉进行人工授粉 ,授粉后 10周采集其细长蒴果 。
将蒴果先用自来水冲洗 1.5 ～ 2.0h,在超净工作台
上以 75 %乙醇处理 30 s,无菌水冲洗 5 ～ 6次 ,再
以 0.1 %氯化汞溶液灭菌 5 min,无菌水冲洗 5 ～ 6
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 34卷
次 。接种时剖开蒴果 ,取出种子接种于培养基上培
养以获得无菌实生苗;培养 15 ～ 20 d,将实生苗的
子叶和下胚轴切下作为诱导体细胞胚胎的外植体。
1.2　培养基及培养条件
(1)培养条件 。培养均采用光照培养 , 12h/d,
光照度为 1 200 lx,室温为 23 ～ 27℃。所有培养基
均附加琼脂 (0.65 %)和蔗糖 (3 %), pH=5.7,
121℃高温高压灭菌 18 min。
(2)无菌实生苗培养。无菌实生苗培养以 N6为
基本培养基 ,分别为不附加任何生长调节物质和附加
6-BA(1.00、2.00mg/L)和 NAA(0.01mg/L)。
(3)愈伤组织诱导 。将培养获得的实生苗子
叶和下胚轴切下 ,分别接入诱导培养基中 。诱导培
养基以 1 /2MS为基本培养基 ,附加生长调节物质
为 6-BA(2.00 mg/L)、NAA(0.01、 0.05、 0.10、
0.50mg/L)和 TDZ(0.10、0.20、0.50 mg/L)。
(4)愈伤组织增殖与状态调整。将诱导出的愈
伤组织转至增殖与调整培养基 ,培养物每 20 d更换
一次新鲜培养基。培养基为 1/2MS+1.00 mg/L
6-BA+0.01 mg/LNAA。
(5)体细胞胚胎诱导与增殖。诱导培养基以
1/2MS为基本培养基 ,附加不同浓度的生长调节物质。
增殖培养基为 1/2MS0(不添加任何生长调节物质)和
1/2MS+1.00mg/L6-BA+0.01mg/LNAA。
2　结果与分析
2.1　楸树无菌实生苗培养
实验将经过灭菌处理的近成熟楸树种子接种
于萌发培养基上 , 3 d即可见种子露白 , 7 d左右种
子子叶展开 、胚轴伸长 ,并开始长出真叶 ,在两种培
养基上成苗率均达 90 %以上 。生长 15 ～ 20 d后
的无菌苗可用于愈伤组织的诱导。
2.2　楸树愈伤组织诱导及激素的影响
2.2.1　愈伤组织诱导结果
子叶在接入诱导培养基 3 ～ 5 d时 ,子叶边缘
和基部等接触培养基的部位先膨大 、变透明 ,第 10
天可观察到子叶部分或全部透明愈伤化 ,以后愈伤
不断增殖。子叶形成的愈伤组织有两种:一种为颗
粒状 、分散 、绿白色愈伤组织(Ⅰ );另一种组织呈
绿色 ,晶莹剔透 ,较紧实 ,含水量高(Ⅱ)。培养 20
d以后 ,有些愈伤组织表面开始发黄 ,如不及时继
代会逐渐褐化死亡。部分子叶接入培养基后 ,仅基
部稍膨大 ,并保持新鲜 15d左右 ,以后从尖端开始
逐渐失活至整片子叶枯黑死亡 。
下胚轴在接种到诱导培养基以后 ,在上端切口
处先膨大发白 ,逐渐愈伤化;培养 1周左右时间 ,下
胚轴就会形成愈伤团 ,以后愈伤团逐渐增长膨大 。
下胚轴诱导形成的愈伤组织绿色透明 、表面晶莹剔
透 ,中间较表面紧实 , 含水量高 (Ⅱ)。培养 25 d
后 ,有些愈伤团表面开始失去光泽 、发黄 ,如不及时
继代将逐渐褐化死亡 。下胚轴一般不会整体愈伤
化 ,只有切口处一段形成愈伤组织 。
2.2.2　NAA和 TDZ对愈伤组织诱导的影响
培养基中的生长调节物质对愈伤组织的诱导
和生长有着重要的影响 ,尤其生长素的影响较明
显。如表 1所示 ,不同浓度 NAA处理下 ,子叶和下
胚轴均能诱导出愈伤组织 ,但诱导频率存在很大差
异。 NAA质量浓度在 0.01 ～ 0.50 mg/L时 ,以子
叶为外植体的诱导频率为 30.77 % ～ 92.06%,以
0.10mg/LNAA处理下为最高 ,其此时愈伤组织生
长较快;以下胚轴为外植体的诱导频率为 32.88%
～ 68.83%,也以 0.10 mg/LNAA处理下为最高 。
TDZ对愈伤组织的诱导和生长有着重要的作用
(表 1)。在含不同浓度 TDZ的 1/2MS培养基上 ,子
叶和下胚轴愈伤组织的诱导频率均能达 80 %以上。
以子叶为外植体 , TDZ质量浓度为 0.50 mg/L时 ,愈
伤组织诱导频率最高 ,为 93.42%;以下胚轴为外植
体 , TDZ质量浓度为 0.20mg/L时 ,诱导频率最高 ,
为 89.66%。随着 TDZ质量浓度的增加 ,子叶和下
胚轴诱导的愈伤组织的生长速度都加快 ,形成的愈
伤组织均呈绿色 、晶莹剔透 ,含水量很高(Ⅱ),在解
剖镜下观察为大的薄壁细胞组成。
表 1　NAA和 TDZ浓度对楸树愈伤组织诱导的影响
Table1　EffectsofconcentrationofNAAandTDZ
oninductionofcalus
激素质量浓度 /
(mg· L-1)
concentration
ofhormone
外植体
explants
接种数
numberof
explants
愈伤组织数
numberof
calus
诱导频率 / %
induction
frequency
NAA
TDZ
0.01
0.05
0.10
0.50
0.1
0.2
0.5
子叶　 　 89 37 41.57
下胚轴 73 24 32.88
子叶　 78 24 30.77
下胚轴 77 29 37.66
子叶　 63 58 92.06
下胚轴 77 53 68.83
子叶　 103 76 73.79
下胚轴 79 43 54.43
子叶　 86 74 84.05
下胚轴 88 71 80.68
子叶　 91 83 91.21
下胚轴 87 78 89.66
子叶　 76 71 93.42
下胚轴 79 67 84.81
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　第 2期 江荣翠 ,等:楸树体细胞胚胎发生的研究
2.3　楸树愈伤组织增殖与状态调整
由子叶和下胚轴诱导形成的愈伤组织只有极
个别Ⅱ类型愈伤组织经诱导可形成体胚 ,大部分须
经过状态调整 , 调整与增殖的培养基相同 , 为
1 /2MS+0.01 mg/LNAA+1.00 mg/L6 -BA。
Ⅰ类型愈伤组织为绿白色 、较 Ⅱ类型颜色浅 ,呈颗
粒状 ,松散 ,较难形成团块 。这种愈伤组织经继代 ,
仍增殖 Ⅰ类型愈伤组织 ,难以形成胚性愈伤组织。
Ⅱ类型愈伤组织为绿色 ,表面晶莹剔透 ,较紧实 ,以
解剖刀切开时脆嫩 、切口整齐 ,含水量很高 ,转移至
调整培养基上 ,愈伤块由边缘至中间逐渐变疏松 ,
但仍能聚成团块状 ,疏松度介于Ⅰ类型和 Ⅱ类型之
间 ,部分愈伤表面还呈现淡紫色(Ⅲ)。
2.4　楸树体细胞胚胎发生
2.4.1　楸树体细胞胚胎的发生和发育过程
将绿色或表面微紫 、较疏松的Ⅲ类型愈伤组织
(图 1A)转入各体胚诱导培养基上 ,光照培养。体胚
发生前可见愈伤组织表面更有光泽 ,第 15天左右 ,
逐渐发现部分愈伤组织表面出现白色的体细胞胚胎
(图 1B), 仔细观察可见球形胚 (图 1C)、心形胚
(图 1D)、鱼雷形胚(图 1E)、子叶形胚(图 1F、1G)
4个阶段的楸树体细胞胚胎。
图 1　楸树体细胞胚胎发生的不同阶段
Fig.1　DifferentperiodsofsomaticembryogenesisofC.bungei
注:A.胚性愈伤组织;B.胚性愈伤上发生体胚;C.球形胚;D.心形胚;E.鱼雷形胚;F.子叶胚早期;G.子叶胚晚期;H.体胚子叶端
萌发;I.体胚发生系数很高。
2.4.2　不同生长调节物质对楸树体胚发生的影响
不同生长调节物质及浓度对楸树体细胞胚胎的
发生有重要的影响(表 2)。不同的诱导培养基多数都
能诱导出体胚 ,但诱导频率差异明显 ,并且总体来说
诱导频率不高。试验所用的各种培养基中 ,以 1/2MS
为基本培养附加 1.00mg/L6-BA+0.01mg/LNAA
的诱导培养基为最好 ,诱导频率为 35.29%,并且在诱
导出体细胞胚胎的同时 ,胚性愈伤组织也有增殖。
2.4.3　体细胞胚胎的增殖与萌发
实验发现 ,将不同时期的体细胞胚胎转移至增
殖和萌发培养基上培养 ,独立的体细胞胚胎难以成
活 ,只有连同少量的愈伤组织一起转至新鲜的培养
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南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 34卷
基中才可成活。将带少量愈伤的体胚转移到不含
生长调节物质的 1/2MS0 和 1 /2MS+1.00 mg/L
6-BA+0.01 mg/LNAA的培养基上 ,体细胞胚胎
均可增殖 ,并且增殖系数很大(图 1C)。将不同发
育时期的体细胞胚胎接种于各种不同的萌发培养
基上培养 ,发现楸树的体细胞胚胎难以萌发形成完
整的植株 ,只有极少数的体胚子叶端萌发 ,下胚轴
端愈伤化(图 1I)。
表 2　不同生长调节剂及浓度对体细胞胚胎发生的影响
Table2　Effectsofdifferentgrowthregulatorsandtheirconcentrationonsomaticembryogenesis
生长调节剂及其浓度
growthregulatorsanditsconcentration
接种数
numberofcalus
产生体胚愈伤数
numberofcaluswith
somaticembryos
诱导频率 /%
inductionfrequency
0.20mg/LTDZ+0.01mg/LNAA 　 96 10 10.42
0.50mg/LTDZ+0.01mg/LNAA 102 5 4.90
0.20mg/LTDZ+0.10mg/LKT+0.01mg/LNAA 135 15 11.11
0.50mg/LTDZ+0.10mg/LKT+0.01mg/LNAA 119 39 32.77
0.50mg/L6-BA+0.01mg/LNAA 80 19 23.75
1.00mg/L6-BA+0.01mg/LNAA 85 30 35.29
2.00mg/L6-BA+0.01mg/LNAA 76 0 0
2.00mg/L6-BA+0.50mg/LNAA 59 18 30.51
3　讨　论
(1)不同培养阶段 ,培养材料对营养元素的要
求不同 ,在愈伤组织诱导阶段 ,材料对基本培养基
的要求不高 , N6 、1 /2MS、MS几种培养基均能够诱
导出楸树愈伤组织;但在愈伤组织的状态调整和胚
状体的诱导阶段 ,只有在 1/2MS或 MS基本培养基
上才可发生 。
(2)研究表明楸树体细胞胚胎的发生与愈伤
组织的状态有密切联系 ,只有合适的胚性愈伤组织
才能诱导出体细胞胚胎 ,楸树体细胞胚胎的发育也
经历其他双子叶植物经历的球形胚 、心形胚 、鱼雷
形胚和子叶胚时期 。研究还发现楸树体细胞胚胎
的增殖系数很大 ,可为进一步在分子水平上研究胚
胎发生的机理及遗传转化奠定基础。
(3)研究中楸树体细胞胚胎发生的频率还不
高 ,体胚发生和发育的同步性比较差 ,另外楸树体细
胞胚胎还难以萌发成苗 ,尚有待于进一步的研究。
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(责任编辑　郑琰燚)
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