全 文 ：RP-HPLC法同时测定马鞭草中木犀草素 、芹菜素和山柰酚
段坤峰 1 ,卢树杰 2 ,陈钟 2 ,朱红1 ,张兰桐1＊
(1.河北医科大学药学院药物分析教研室 , 石家庄 050017;2.河北省中药注射剂工程技术研究中心 ,石家庄 051430)
摘要　目的:建立 HPLC法测定马鞭草药材中木犀草素 、芹菜素和山柰酚的含量。 方法:采用 DiamonsilTM C18(250 mm×4.6
mm, 5 μm)色谱柱 ,以乙腈 -0.05%磷酸水(40∶60)为流动相 ,流速 1.0mL· min-1 ,检测波长 350 nm,柱温 30 ℃。结果:木犀
草素 、芹菜素和山柰酚浓度分别在 1.065 ～ 21.30, 1.146 ～ 22.92, 1.645 ～ 32.91 μg· mL-1范围内与峰面积均呈良好的线性关
系(r=0.9995 ～ 0.9999);平均回收率(n=6)分别为 98.1%(RSD=1.8%), 100.3%(RSD=1.5%), 97.1%(RSD=1.7%)。
结论:本法操作简便 、准确 , 具有良好的重复性 , 为马鞭草药材的合理应用及质量控制奠定基础。
关键词:马鞭草;高效液相色谱;木犀草素;芹菜素;山柰酚
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2010)06-0995-04
RP-HPLCsimultaneousdeterminationofluteolin, apigenin
andkaempferolinVerbenaoficinalisL.
DUANKun-feng1 , LUShu-jie2 , CHENZhong2 , ZHUHong1 , ZHANGLan-tong1＊
(1.DepartmentofPharmaceuticalAnalysis, SchoolofPharmacy, HebeiMedicalUniversity, Shijiazhuang050017, China;
2.HebeiProvinceEngineeringResearchCenterforTraditionalChinesedrugInjections, Shijiazhuang051430, China)
Abstract　Objective:TodevelopanHPLCmethodtosimultaneouslydeterminethecontentsofluteolin, apigenin
andkaempferolinVerbenaoficinalisL..Methods:TheseparationwascariedoutonaC18(250 mm×4.6 mm, 5
μm)columnwiththemixtureofacetonitrile-watercontaining0.05% phosphoricacid(40∶60)asamobilephase
attheflowrateof1.0mL· min-1 anddetectionwavelengthwassetat350nm.Thetemperatureofcolumnwas30
℃.Results:Thelinearrelationshipwasgoodforluteolin, apigeninandkaempferolintherangeof1.065-21.30,
1.146-22.92 and1.645-32.91μg·mL-1(r=0.9995-0.9999).Theaveragerecoveries(n=6)were98.1%
(RSD=1.8%), 100.3%(RSD=1.5%)and97.1%(RSD=1.7%).Conclusion:Thismethodisrapid, accurate
andrepeatableandcanbeusedtodeterminethecontentsofluteolin, apigeninandkaempferolandcontrolqualityof
VerbenaoficinalisL..
Keywords:VerbenaoficinalisL.;RP-HPLC;luteolin;apigenin;kaempferol
　　马鞭草为马鞭草科植物马鞭草 Verbenaoficina-
lisL.的干燥地上部分 ,收载于中国药典 2005年版
一部。马鞭草有活血散瘀 、截疟 、解毒 、利水消肿的
功效 ,用于治疗癥瘕积聚 、经闭痛经 、疟疾 、喉痹 、痈
肿 、水肿 、热淋。中国药典 2005年版一部马鞭草项
下的薄层鉴别和含量测定均以熊果酸为指标 ,熊果
酸为脂溶性成分 ,广泛存在于山茱萸 、夏枯草 、枇杷
叶 、山楂 、栀子等 [ 1]多种中药中。
马鞭草化学成分的研究早在 20世纪初就已开
展 ,但并不深入 ,近年来 ,由于其在临床上的独特疗
效 ,对其化学成分的研究又趋活跃 ,从中已分离鉴定
的化合物主要有环烯醚萜 、黄酮类 、三萜类 、甾体类 、
糖类等[ 2] 。田菁对马鞭草的镇痛和抗白色念珠菌
活性部位中的化学成分进行了分离 、结构鉴定和药
理实验 ,结果分离出 8个黄酮类化合物 ,药理研究表
明 ,镇痛活性物质主要集中在正丁醇部位 ,从该部位
分离得到的化合物主要是环稀醚萜苷类和黄酮类;
抗白色念珠菌活性物质主要集中在乙酸乙酯部位 ,
乙酸乙酯部位分离得到的主要为黄酮苷元 ,其抗菌
活性很强 [ 3, 4] 。陈改敏从马鞭草提取液中分离得到
—995—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(6)
＊ 通讯作者　Tel:(0311)86266419;Fax:(0311)86052053;E-mail:zhanglantong@ 263.net
了 5个黄酮类化合物 ,分别鉴定为木犀草素 、山柰
酚 、槲皮素 、芹菜素和 4′-羟基汉黄芩素 [ 5] 。 Deep-
ak发现马鞭草氯仿 、乙酸乙酯和石油醚等部位提取
物有较强的抗炎作用[ 6] 。总之 ,黄酮类成分是马鞭
草中抗炎和镇痛的主要有效成分 ,其中山柰酚 、木犀
草素 、芹菜素含量最高 ,其他成分含量较低 ,因此 ,同
时检测马鞭草中的木犀草素 、芹菜素和山奈酚的含
量对于马鞭草药效物质基础研究和质量控制都具有
重要意义。
1　仪器与试药
AgilentTechnologies1200 series高效液相色谱
仪(配有紫外二极管阵列检测器 ,四元泵 ,自动进样
器 ,柱温箱);SCQ-200超声波清洗器(上海声谱超
声波设备厂), SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚
荣生化仪器厂)。
对照品木犀草素(批号 111520-200201)、山柰
酚(批号 110861-200405)购自中国药品生物制品
检定所 ,芹菜素(批号 HK20090418,含量 >98%)购
自陕西惠科植物开发有限公司;不同产地马鞭草药
材购自石家庄乐仁堂药店及不同产地的药材公司 ,
经河北药科大学药学院生药学教研室赵丁教授鉴
定 。乙腈为色谱纯(美国迪马公司),水为二次重蒸
水 ,其他试剂均为分析纯。
2　溶液制备
2.1　对照品储备液　取对照品木犀草素 、芹菜素和
山柰酚适量 ,精密称定 ,加 80%甲醇分别制成 1 mL
中含 0.0852 , 0.0764, 0.0942 mg的单一成分溶液 ,
即得。
2.2　供试品溶液 　取药材粉末(过 40目筛)约
0.5g,精密称定 ,置具塞 50 mL锥形瓶中 ,加入 80%
甲醇 15 mL,密塞 ,称定重量 ,超声(220 W, 25 kHz)
处理 0.5 h,放冷 ,称重 ,用 80%甲醇补充减失的重
量 ,摇匀 ,微孔滤膜滤过 ,取续滤液备用 ,即得。
3　色谱条件与系统适用性试验
DikmaDiamonsilC18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)
色谱柱;柱温 30 ℃;流动相为乙腈 -0.05%磷酸水
(40∶60),流速 1.0mL·min-1;检测波长 350nm;进
样量 20 μL。按木犀草素 、芹菜素和山柰酚计算理
论板数均不低于 2000,与相邻峰之间分离度均大于
1.5,对称因子均在 0.95 ～ 1.05。色谱图见图 1。
4　方法学考察
4.1　线性关系和检出限考察　分别精密吸取木犀
草素 、芹菜素和山柰酚的对照品储备液适量 ,加甲醇
稀释 ,制得梯度浓度系列混合对照品溶液 (木犀草
图 1　混和对照品溶液(A)和马鞭草供试品溶液(河北 3号)(B)的
HPLC图谱
Fig1　HPLCchromatogramsofthechemicalreferencesubstancessolu-
tion(A)andtheextractfromVerbenaoficinalisL.(Hebei3)(B)
1.木犀草素(luteolin)　 2.芹菜素(apigenin)　 3.山柰酚(kaempfer-
ol)
素:21.3, 10.7, 5.3, 2.7, 1.0 μg· mL-1;芹菜素:
22.9, 11.5, 5.7, 2.9, 1.1 μg· mL-1;山柰酚:32.9,
16.5, 8.2, 4.1, 1.6 μg· mL-1)。精密吸取上述系
列溶液各 20 μL注入液相色谱仪 ,按 “3”项确定的
色谱条件进样测定。以峰面积(Y)为纵坐标 ,浓度
(X)为横坐标 ,绘制标准曲线 ,经回归处理得木犀草
素 、芹菜素 、山柰酚标准回归方程分别为:
Y=83.12X+30.35　r=0.9999
Y=66.81X+34.99　r=0.9995
Y=98.17X-37.32　r=0.9998
线性范围分别为 1.065 ～ 21.30, 1.146 ～ 22.92,
1.645 ～ 32.91 μg· mL-1。按信噪比 3∶1确定最低
检测限分别为 5, 12 , 20 ng· mL-1;按信噪比 10∶1
确定最低定量限分别为 17 , 40, 67 ng· mL-1;
4.2　精密度试验　取同一批药材粉末 ,按 “ 2.2”项
下方法制得供试品溶液 ,精密吸取溶液 20 μL,连续
进样 6次 ,按上述色谱条件测定峰面积 。结果木犀
草素 、芹菜素和山柰酚峰面积的 RSD(n=6)分别为
1.5%, 0.58%, 1.4%。
4.3　重复性试验　取同一批药材粉末 ,精密称取 6
份 ,按 “2.2”项下方法制备供试品溶液 ,在上述色谱
条件下进样测定。结果木犀草素 、芹菜素和山柰酚
的含量平均值 (n=6)分别为 0.179, 0.324, 0.257
mg· g-1;RSD分别为 1.7%, 0.67%, 0.82%。
4.4　稳定性试验　精密吸取同一在室温下放置的
—996— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(6)
供试品试液 ,分别于 0, 2, 4, 6, 8, 24h测定木犀草素 、
芹菜素和山柰酚的峰面积 , RSD(n=6)分别为 1.9%,
1.2%, 0.85%,表明供试品溶液在 24h内稳定。
4.5　加样回收率试验　精密称取 6份 “ 4.3”项下
已测知质量分数的药材粉末 0.25 g,依次加入稀释
后的混合对照品溶液(含木犀草素 、芹菜素 、山柰酚
分别为 6.54, 97.64, 7.35 μg)15 mL,按 “ 2.2”项下
方法和上述色谱条件每份溶液进样测定 1次 ,计算
木犀草素 、芹菜素和山柰酚的量 ,求得加样回收率和
RSD。结果加样回收率 (n=6)分别为 98.1%,
100.3%, 97.1%;RSD分别为 1.8%, 1.5%, 1.7%。
5　样品测定
取不同来源马鞭草药材粉末各 0.50 g,精密称
定 ,按 “2.2”项下方法制备供试品溶液 ,吸取供试品
溶液 20 μL,注入液相色谱仪 ,以外标法计算木犀草
素 、芹菜素 、山柰酚的含量 ,结果见表 1。
6　讨论
6.1　提取方法考察　以 0.5 g药材粉末为考察对
象 ,采用四因素三水平 L9(34),以木犀草素 、芹菜素
和山柰酚峰面积为考察指标进行提取方法学评价 ,
表 1　不同来源马鞭草药材中 3种黄酮
成分的含量(mg· g-1)
Tab1　Contentsof3flavonecompoundsinVerbena
oficinalisL.fromdifferentsources
来源
(source)
木犀草素
(luteolin)
芹菜素
(apigenin)
山柰酚
(kaempferol)
河北(Hebei) 1 0.064 0.081 0.130
2 0.092 0.151 0.182
3 0.186 0.320 0.252
河南(Henan) 1 0.052 0.095 0.133
2 0.063 0.077 0.119
3 0.092 0.166 0.180
4 0.069 0.085 0.144
山东(Shandong) 0.116 0.095 0.130
广西(Guangxi) 0.077 0.094 0.125
江西(Jiangxi) 0.091 0.125 0.147
实验方案见表 2,结果见表 3。根据表 3结果可直观
地看出对总黄酮提取率的影响因素为溶剂体积﹥提
取方式﹥提取溶剂﹥提取时间 ,并通过方差分析结
果进一步证实了因素 D在实验中对总黄酮提取的
影响最为显著 。
表 2　优化提取方法的主因素和水平表
Tab2　Mainfactorsandtheirlevelsettingusedforoptimizationoftheextraction
水平
(level)
因素(factors)
A提取溶剂(extractionsolvents) B提取时间(extractiontime) C提取方式(extractionmethod) D溶剂体积(volumesolvents)/mL
1 甲醇(methanol) 0.5 超声(ultrasonic) 5
2 80%甲醇(methanol) 1 回流(reflux) 10
3 50%甲醇(methanol) 1.5 冷浸(soakingatroomtemperature) 15
表 3　优化提取方法 L9(34)矩阵表
Tab3　L9(34)matrixastheexperimental
designforoptimizationoftheextraction
试验号
(experimental
number)
A B C D
总黄酮含量
(contentsof3flavone
compounds)/mg· g-1
1 1 1 1 1 0.67
2 1 2 2 2 0.65
3 1 3 3 3 0.70
4 2 1 2 3 0.76
5 2 2 3 1 0.64
6 2 3 1 2 0.74
7 3 1 3 2 0.66
8 3 2 1 3 0.75
9 3 3 2 1 0.62
K1 0.67 0.70 0.72 0.64
K2 0.71 0.68 0.68 0.68
K3 0.68 0.69 0.67 0.74
　　另补做了提取溶剂为 20 mL的试验 ,其结果与
15 mL的并无显著差异 ,故采用 15 mL提取溶剂 。
根据 上 述 结 果 , 得 出 最 佳提 取 方 法 为
A2B1C1D3 ,即溶剂(A)80%甲醇 ,时间(B)0.5 h,提
取方式(C)为超声 ,溶剂体积(D)为 15mL。具体操
作如 “2.2”项所述。
6.2　检测波长的选择　按上述选定的色谱条件在
200 ～ 400 nm进行全波长扫描 ,得到不同波长下的
三维色谱图(HPLC-PAD),对图谱进行比较分析。
结果表明 ,马鞭草中的木犀草素 、芹菜素和山柰酚在
350 nm能够获得很好的分离 ,且分离度及重现性均
令人满意 ,最终确定检测波长为 350 nm。
6.3　流动相的选择　考察了甲醇 -水 、乙腈 -水 、
甲醇 -乙腈 -水溶液 、乙腈 -酸水溶液等不同的系
统 ,在流动相中分别加入 0.1%磷酸 、0.05%磷酸 、
0.1%醋酸和 0.05%醋酸。最后确定以乙腈 -
0.05%磷酸水(40∶60)为流动相等度洗脱。
—997—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(6)
6.4　柱温的选择　分别于 25, 30, 35, 40 ℃条件下 ,
按上述色谱条件进行色谱分析 ,记录色谱图 ,选择合
适的柱温为 30℃。
6.5　小结　本实验采用 HPLC法同时测定马鞭草
药材中的木犀草素 、芹菜素和山柰酚 3种活性成分
的含量 ,方法准确可靠 ,灵敏度高 ,重复性好 。从测
定结果来看 ,不同产地的马鞭草药材中的黄酮含量
存在着一定差异 ,山东 、河北含量较高。山柰酚 、木
犀草素和芹菜素均为马鞭草中的抗炎活性成分 ,且
含量高 ,适合作为马鞭草药材的指标性成分 ,而且质
量控制与活性成分相结合 ,为该药材的质量控制提
供了新方法 。
参考文献
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(本文于 2009年 7月 1日收到)
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