全 文 ：2011 年 8 月
第 26 卷第 8 期
中国粮油学报
Journal of the Chinese Cereals and Oils Association
Vol． 26，No． 8
Aug. 2011
山核桃外果皮总酚的微波辅助提取工艺
优化及其抗氧化研究
吴峰华1，2 罗自生1 何志平2 庞林江2
(浙江大学生物系统工程与食品科学学院1，杭州 310029)
(浙江农林大学农业与食品科学学院2，临安 311300)
摘 要 在单因素试验的基础上以乙醇浓度、液料比和微波功率为试验因素，以总酚得率为响应值，采用
三因素三水平的响应面分析法进行试验。并通过还原力、DPPH清除能力和 β 胡萝卜素亚油酸三个体系来评
价提取物的抗氧化能力。结果表明，山核桃外果皮中总酚提取的最佳工艺条件为:乙醇体积分数 56． 0%，料液
比 1 ∶ 50，微波功率 502． 4 W提取时间 100 s;实际测得总酚得率为 123． 41 mg /g，与模型预测值基本相符。山核
桃外果皮提取物有很强的抗氧化活性，清除 DPPH自由基的能力与 BHT相当。
关键词 山核桃外果皮 总酚 提取 响应面 抗氧化
中图分类号:TQ432． 2 文献标识码:A 文章编号:1003 － 0174(2011)08 － 0109 － 06
基金项目:浙江省自然科学基金 (Y3090428、Y3100422) ，浙江林
学院科研发展基金 (2290000027)
收稿日期:2010 － 10 － 19
作者简介:吴峰华，男，1979 年出生，实验师，农产品贮藏与加工
通讯作者:罗自生，男，1972 年出生，教授，农产品采后生物学
近年来天然抗氧化剂的研究备受关注，其中多
酚类是主要的抗氧化活性成分之一。研究表明，酚
类物质能有效降低或者抑制由于氧化作用引起的
心血管疾病、癌症和衰老性疾病等多种慢性
病［1 － 2］;同时对食品的保鲜也有积极的作用［3］。山
核桃(Carya cathayensis)属胡桃科山核桃属木本植
物，主要分布于浙、皖两省交界的天目山区周围，是
浙江省乃至世界性特色干果。在利用完山核桃之
后，外果皮基本属于废弃物，没有得到充分利用，并
且还造成了环境污染。通过对该属植物果皮化学
成分的研究，发现其含有黄酮类、萜类、萘醌及其
苷、多酚、有机酸等多种成分［4］，具有开发成为植物
源抗氧化剂、杀菌剂的潜力。目前对山核桃外果皮
的研究主要集中在化学成分鉴定，提取物活体抑菌
活性研究，黄酮提取条件的研究等方面，而对果皮
总酚提取及其抗氧化研究鲜有报道［5 － 7］。采用微
波辅助法提取山核桃外果皮中的总酚物质，并通过
响应曲面法试验设计优化提取工艺，同时通过还原
力、DPPH清除能力和 β-胡萝卜素亚油酸 3 个体系
评价提取物的抗氧化活性，以期为山核桃外果皮的
综合利用提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
山核桃外果皮:9月上旬采自浙江临安昌化山区。
福林酚试剂(Folin － Ciocalteusreagent)、1，1 －二
苯基苦基苯肼(DPPH)、β －胡萝卜素:Sigma公司;其
余试剂均为分析纯。
1． 2 方法
1． 2． 1 微波辅助提取工艺流程
山核桃外果皮原料→45 ℃恒温干燥 72 h→粉碎
后过 60 目筛→山核桃外果皮粉末→加入一定量的乙醇
溶液→微波辅助提取→抽滤→定容→总酚提取液
1． 2． 2 总酚含量测定
1． 2． 2． 1 标准曲线的建立
对 Lim 等［8］报道的方法稍加改动:吸取质量浓
度分别为 0、20、40、60、80、100、200 和 300 μg /mL 的
没食子酸标准溶液 0． 6 mL于 10 mL 的比色管中，加
入稀释 10 倍的福林酚试剂 3 mL，然后加入 7． 5%碳
酸钠溶液 2． 4 mL，混匀，黑暗中放置 30 min，在波长
765 nm测定吸光值，绘制标准曲线:Y = 0． 010 4X +
0． 008 1，R2 = 0． 999 3。
1． 2． 2． 2 提取液中总酚含量的测定
取不同试验条件下各组提取液，稀释适当的倍
数，按照上述方法显色，测定吸光值。将吸光度值代
入标准曲线方程计算样品中总酚含量。结果以每克
山核桃外果皮粉末中含有相当没食子酸的质量表
中国粮油学报 2011 年第 8 期
示，即 mg /g。
1． 2． 3 单因素试验
称取一定量的山核桃外果皮粉末，研究乙醇浓
度、微波功率、液料比和微波处理时间对山核桃外果
皮总酚提取率的影响。
1． 2． 4 山核桃外果皮提取物抗氧化特性测定
按照优化后的最佳工艺提取山核桃外果皮总
酚，将提取液减压浓缩并真空冻干后配置成不同浓
度的样品溶液进行抗氧化活性测定，通过 FC 法测定
提取物粉末中总酚含量为 17． 45%。
1． 2． 4． 1 还原力的测定
还原力的测定参照 Apati 等［9］所报道的方法。
分别吸取质量浓度为 0． 05、0． 1、0． 2、0． 3 和 0． 4 mg /ml
的提取物溶液 1 ml，依次加入 0． 5 mol /L(pH 6． 6)的
磷酸盐缓冲液 2． 5 mL 和 1% 铁氰化钾溶液
(K3Fe(CN)6)2． 5 mL，于 50 ℃水浴中保温 20 min，
取出冷却后，再加入 10%三氯乙酸溶液(TCA)2． 5
mL，以 3 000 r /min的转速离心 10 min，取上清液 2． 5
mL，依次加入 2． 5 mL 蒸馏水，0． 1%三氯化铁溶液
0． 5 mL，充分混匀，静置 10 min后，在 700 nm下测定
其吸光度值，同时用 BHT 作对比试验。还原力的
IC50定义为:吸光值为 0． 5 时样品的浓度
［10］。浓度越
小，还原力越强。
1． 2． 4． 2 DPPH自由基清除率
山核桃外果皮提取物清除 DPPH 自由基能力的
测定参照 Hatano 等［11］的方法。分别取 0． 3 mL质量
浓度为 0． 05、0． 1、0． 2、0． 3 和 0． 4 mg /mL 提取物溶
液，与2． 7 mL DPPH甲醇溶液(0． 1 mmol /L)混合，充
分混匀后在室温下静置 2 h，在 517 nm测吸光值 A1，
空白以提取剂代替样品测得 A0，同时以 BHT 作对比
试验。
DPPH清除率 =［(A0 － A1)/A0］× 100% (1)
1． 2． 4． 3 抗油脂氧化作用的测定
利用 β －胡萝卜素的褪色程度来评价山核桃外
果皮提取物抗油脂氧化作用，测定方法参照 Shahsa-
vari等［12］的方法稍加调整。称取 40 mg 亚油酸和
400 mg吐温 40 于烧瓶内，再加入 3 mL β －胡萝卜
素溶液(5mg β －胡萝卜素溶解于 50mL 氯仿) ，摇
匀。在 35 ℃下，真空旋转除去氯仿，加入 100 mL
重蒸水，混匀，得到 β －胡萝卜素亚油酸乳化液。
取 0． 2 mL 不同质量浓度的山核桃外果皮提取
物溶液，加入上述配置好的乳化液 4 mL，摇匀，将盛
有上述溶液的比色管放置在 50 ℃水浴锅中。2 h
后，在 470 nm 下，测定吸光值 Asample。用不加 β －胡
萝卜素的亚油酸乳化液作空白，不加提取物溶液的
亚油酸乳化液作对照 Acontol。同时以 BHT 作对比试
验。山核桃外果皮提取物的抗氧化活性(Antioxidant
activity，简称 AA)可以通过 β －胡萝卜素颜色变化
(即吸光值)进行计算，公式如下:
AA = (Asample(2 h) － Acontol(2 h))/(Acontol(0 h) －
Aconrol(2 h))× 100% (2)
式中:Asample(2 h)与 Acontol(2 h)为试样和对照样 2 h
后的吸光值，Acontol(0 h)为对照样在保温初始时(t = 0)
的吸光值。
1． 2． 5 统计分析
所有试验数据为 3 次重复试验结果的平均值。
采用 SPSS 13． 0 软件处理数据，并用 ANOVA 进行邓
肯氏多重差异分析(取 P ＜ 0． 05)。
2 结果与分析
2． 1 山核桃外果皮总酚提取单因素试验
2． 1． 1 乙醇浓度对总酚得率的影响
准确称取 2． 00 g 的山核桃外果皮干粉，按料液
比 1 ∶ 30(g /mL)分别加入体积分数为 0、20、40、60、80
和 100%的乙醇，在微波功率为 640 W 条件下提取
60 s，抽滤，定容，计算总酚得率，试验结果见图 1。结
果显示，40%和 60%乙醇提取山核桃外果皮总酚得
率无显著差异，考虑经济因素，选取乙醇体积分数为
40%。
图 1 乙醇浓度对总酚得率的影响
2． 1． 2 料液比对总酚得率的影响
准确称取 6． 00、3． 00、2． 00、1． 50、1． 20 和 1 g
山核桃外果皮干粉，分别加入 40%乙醇 60 mL，在
微波功率为 640 W条件下提取 60 s，抽滤，定容，计
算多酚得率，试验结果见图 2。结果显示，随着料液
比的增大，山核桃外果皮总酚溶出率也增大，当料
液比大于 1 ∶ 50 时，总酚得率变化不大，综合经济因
素考虑确定料液比单因素最佳条件为 1 ∶ 50。
011
第 26 卷第 8 期 吴峰华等 山核桃外果皮总酚的微波辅助提取工艺优化及其抗氧化研究
图 2 料液比对总酚得率的影响
2． 1． 3 微波功率对总酚得率的影响
准确称取 2． 00 g 的山核桃外果皮干粉，按料液
比 1 ∶ 30(g /mL)加入 40%乙醇，分别在微波功率 0、
160、320、480、640 和 800 W 条件下提取 60 s，抽滤，
定容，计算多酚得率，试验结果见图 3。结果显示，微
波功率在 480 W时山核桃总酚得率最高。
图 3 微波功率对总酚得率的影响
2． 1． 4 微波时间对总酚得率的影响
准确称取 2． 00 g 的山核桃外果皮干粉，按料液
比1 ∶ 30(g /mL)加入 40%乙醇，在微波功率 640 W条
件下，分别提取 20、40、60、80、100 和 120 s，抽滤，定
容，计算多酚得率，试验结果见图 4。结果显示，微波
时间 100 s总酚得率最大。
图 4 微波时间对总酚得率的影响
2． 2 响应面法优化微波辅助提取山核桃外果皮总
酚工艺
2． 2． 1 响应面分析因素的选取及分析方案
以单因素试验结果为基础，微波时间选定为 100
s，对影响山核桃外果皮总酚提取率的主要因素(乙
醇浓度、微波功率和液料比)进行中心组合试验(Box
－ Behnken)。试验因素和水平设计见表 1，试验分析
方案及结果见表 2。
表 1 Box － Behnken 设计因素及水平表
水平
A /乙醇体
积分数 /%
B
/料液比
C
/微波功率 /W
－ 1 40 1 ∶ 30 320
0 60 1 ∶ 40 480
+ 1 80 1 ∶ 50 640
表 2 响应面分析方案与结果
试验
序号
A
乙醇体积分数 /%
B
料液比
C
微波功率 /W
Y
总酚得率 /mg /g
1 40 1 ∶ 30 480 99． 95
2 40 1 ∶ 40 640 100． 56
3 60 1 ∶ 30 320 101． 55
4 80 1 ∶ 40 320 76． 53
5 80 1 ∶ 40 640 88． 81
6 60 1 ∶ 40 480 118． 85
7 60 1 ∶ 40 480 121． 50
8 60 1 ∶ 40 480 122． 13
9 60 1 ∶ 30 640 119． 68
10 80 1 ∶ 30 480 82． 54
11 60 1 ∶ 40 480 120． 11
12 40 1 ∶ 40 320 89． 43
13 80 1 ∶ 50 480 87． 81
14 60 1 ∶ 40 480 123． 08
15 60 1 ∶ 50 640 118． 24
16 60 1 ∶ 50 320 114． 57
17 40 1 ∶ 50 480 112． 51
2． 2． 2 总酚提取工艺的模型建立及其显著性检验
对表 2 中试验数据进行回归分析，得二次多元
回归方程(模型)为:
Y = 12． 11 － 0． 83A + 0． 37B + 0． 57C － 0． 18AB +
0． 03AC － 0． 36BC － 2． 5A2 － 0． 039B2 － 0． 73C2 (3)
对该模型进行方差分析，结果见表 3，模型系数
显著性检验见表 4。
表 3 回归模型方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P
模型 3 959． 44 9 439． 94 56． 51 ＜ 0． 0001
残差 54． 49 7 7． 78
失拟 43． 31 3 14． 44 5． 17 0． 073
误差 11． 18 4 2． 79
总和 4 013． 93 16
模型的确定系数 模型的调整确定系数
R － Squared = 0． 986 Adj R － Squared = 0． 969
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中国粮油学报 2011 年第 8 期
表 4 回归系数显著性检验
模型中的系数项 系数估计值 标准误差 F值 P
常量 121． 13 1． 25 56． 51 0． 000 1
A － 8． 34 0． 99 71． 57 0． 000 1
B 3． 68 0． 99 13． 89 0． 007 4
C 5． 65 0． 99 32． 82 0． 000 7
AB － 1． 82 1． 40 1． 71 0． 232 7
AC 0． 29 1． 40 0． 042 0． 842 6
BC － 3． 62 1． 40 6． 72 0． 035 9
A － 25． 05 1． 40 339． 53 0． 000 1
B2 － 0． 38 1． 40 0． 077 0． 789 6
C2 － 7． 25 1． 40 28． 41 0． 001 1
由表 3 回归模型方差分析可知，F回归 = 56． 51 ＞
(F0． 01(9，4)= 14． 66) ;P值 ＜ 0． 000 1，表明模型极显
著。F失拟 = 5． 17 ＜(F0． 05(9，3)= 8． 81，失拟项 P =
0． 073 ＞ 0． 05，表明失拟不显著。该模型的相关系数
R2 = 0． 969，说明该二次模型能够拟合真实的试验结
果，试验误差小［13］。由表 4 回归方程系数显著检验
可知，乙醇浓度的一次项、二次项、料液比的一次项、
微波功率的一次项和二次项均达到极显著水平(P ＜
0． 01) ，料液比和微波功率的交互项达到显著水平(P
＜ 0． 05)。
2． 2． 3 响应面分析与优化
乙醇浓度、料液比和微波功率交互作用对总酚
得率的影响见图 5 ～图 7。由图 5 可知，料液比不变，
随着乙醇浓度的增大，总酚得率呈先上升后下降的
趋势;乙醇浓度恒定，增大料液比有利于提高总酚得
率。由图 6 可知，微波功率不变，随着乙醇浓度的增
大，总酚得率同样呈先上升后下降的趋势;乙醇浓度
恒定，随着微波功率增大，总酚得率也呈先上升后下
降的趋势。由图 7 可知，微波功率不变，总酚得率随
着料液比的增大呈线性增加;料液比恒定，总酚得率
随着微波功率增大而增加，但超过一定值后功率的
增加对总酚得率有负面影响。
图 5 乙醇浓度与料液比对总酚得率影响的响应面图
再对三维非线性回归模型(3)进行求一阶偏导，
并令其为零，得出得率较高的条件:A = － 0． 20，B =
1． 0，C = 0． 14，转化为实际参数，即乙醇体积分数为
56． 0%，料液比为 1 ∶ 50，微波功率为 502． 4 W，在此
条件下总酚得率模型预测值为 125． 60 mg /g，验证值
为 123． 41 mg /g，两者相对偏差为 1． 75% ＜5%。
2． 3 山核桃外果皮提取物抗氧化特性
供给电子能力是酚类物质抗氧化重要作用之
一，还原力体系的机理就是通过测定抗氧化剂提供
电子的多少，来评价抗氧化活性的强弱［14］。由图 8
可知，提取物铁还原力随其浓度增加而上升，呈明显
的量效关系。提取物还原力的 IC50为 0． 431 mg /mL，
而 BHT的 IC50则为 0． 140 mg /mL，说明提取物还原
力相当于 BHT的 0． 325 倍。
DPPH已广泛用来评价各自植物和化合物的清
除自由基的能力［15］。由图 9 可知，提取物的 DPPH
清除能力随着浓度的增大呈上升趋势，当提取物浓
度达到一定值后，清除能力变化变缓。通过对提取
物浓度和 DPPH清除率进行对数拟合，可得到提取物
IC50(即清除率为 50% 时样品的浓度)为 0． 136
mg /mL，BHT的 IC50为 0． 122 mg /mL，说明提取物清
除 DPPH自由基的能力与 BHT相当。
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书第 26 卷第 8 期 吴峰华等 山核桃外果皮总酚的微波辅助提取工艺优化及其抗氧化研究
β －胡萝卜素亚油酸体系的机理，就是通过抗氧化剂
中和亚油酸自由基和体系中其他的自由基，抑制了
其对不饱和 β －胡萝卜素的攻击，从而减缓了 β －胡
萝卜素的褪色;抗氧化活性的强弱可以通过 470 nm
下吸光值的变化幅度来衡量［16］。由图 10 可知，提取
物抗油脂氧化能力随着浓度的增大而增大。通过计
算提取物的 IC50为 0． 221 mg /g，BHT的 IC50为 0． 122
mg /g，说明提取物抗油脂氧化能力弱于 BHT。
图 10 提取物质量浓度与抗油脂氧化能力的关系
3 结论
山核桃外果皮总酚提取最佳工艺条件为:乙醇
体积分数 56． 0%，料液比 1 ∶ 50，微波功率 502． 4 W，
微波时间 100 s。在此条件下总酚得率模型预测值为
125． 60 mg /g，验证值为 123． 41 mg /g，重复性试验结
果较好，真空冷冻干燥后提取物总酚质量分数为
17． 45%。提取物还原力和抗油脂氧化能力弱于
BHT，但对 DPPH自由基的清除能力与 BHT 相当，因
此山核桃外果皮提取物具有较强的抗氧化活性，是
一种具有开发潜力的天然抗氧化剂。
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中国粮油学报 2011 年第 8 期
this method，the detection limit of C40 ester was 0． 106 μg /mL and liner range was 0． 001 06 ～ 0． 106 mg /mL． The
recovery rate of this method was between 98． 8% and 107． 1% ． In the process of testing，the relative standard devia-
tiona (RSD)were respectively 3． 7% and 0． 8% ． The method had such advantages as good repeatability，high recov-
erage rate and so on． The determination of wax content in the olive oil could be used to distinguish The virgin olive oil
(super and medium)．
Key words olive oil，the content of wax，
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
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Wu Fenghua1，2 Luo Zisheng1 He Zhiping2 Pang Linjiang2
(College of Biosystem Engineering and Food Science，Zhejiang University1，Hangzhou 310029)
(School of Agriculture and Food Science，Zhejiang A ＆ F University2，Linan 311300)
Abstract Based on the single － factor experiment，the method of response surface analysis with 3 factors inclu-
ding ethanol concentration，solvent － material ratio and microwave power on the yield of total phenol was adopted． The
antioxidant of extract was studied in three different systems (reducing power，1，1 － diphenyl － 2 － picrylhydrazyl
(DPPH)free radical scavenging activity and β － Carotene bleaching)． The optimal conditions of microwave － assisted
extraction were as follows:ethanol concentration 56． 0%，solvent － material ratio 1 ∶ 50，microwave power 502． 4 W and
time 100 s;the actual value of total phenol was 123． 41 mg /g，in close agreement with the value predicted by the
mathematical model． The exocarp of Carya cathayensis extract obtained at the optimal conditions exhibited a strong
scavenging DPPH ability comparable to BHT．
Key words exocarp of Carya cathayensis，total phenol，extraction，response surface methodology，antioxidant
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