全 文 ：世界中西医结合杂志 2012年第 7卷第 8期 World Journal of Integrated Traditional and Western Medicine 2012，Vol. 7，No. 8
·博士论坛·
基金项目:黑龙江省政府博士后启动基金(No． LRB05 － 255) ;哈尔滨
市科技创新专项基金(No． 2010FRXXS052) ;教育部博士点基金(No．
20102307110003D200952)
作者单位:1．黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2．哈尔滨医
科大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150081
通讯作者:张广美，Email:zayswxy@ 126． com
辽东楤木叶总皂苷逆转卵巢癌细胞耐药
作用的实验研究
王春梅1，2 张广美2
【摘要】 目的 探讨辽东楤木叶总皂苷对上皮性卵巢癌细胞耐顺铂株的抑制作用及其逆转耐
药的作用机理。方法 采用MTT 法检测辽东楤木叶总皂苷对 SKOV3 － DDP细胞的抑制作用，绘制抑
制曲线;TUNEL法检测辽东楤木叶总皂苷促进 SKOV3 － DDP 细胞凋亡的作用;蛋白印迹法检测相关
耐药蛋白的表达;流式细胞仪检测辽东楤木叶总皂苷对 SKOV3 － DDP细胞周期进程的影响。结果
辽东楤木叶总皂苷可有效抑制卵巢癌耐顺铂株的生长，且这种抑制作用具有浓度—时间依赖性;辽东
楤木叶总皂苷可促使 SKOV3 － DDP细胞周期停滞于 G1 期，诱导细胞发生凋亡;辽东楤木叶总皂苷可
降低 SKOV3 － DDP细胞耐药蛋白的表达。结论 辽东楤木叶总皂苷可抑制 SKOV3 － DDP 细胞的生
长，这种作用可能与其促使细胞周期停滞、诱导细胞凋亡、降低耐药蛋白的表达相关。
【关键词】 辽东楤木;耐药;抗肿瘤;三萜皂苷
【中图分类号】R737． 31 【文献标识码】A 【文章编号】1673 － 6613(2012)08 － 0713 － 04
Experimental Research of the General Saponins of Aralia Elata Leaves on
its Reversal of Drug Resistance for Ovary Cancer Cells
WANG Chun － mei1，2，ZHANG Guang － mei2
(1． Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin Heilongjiang 150040;2． No． 1 Affiliated
Hospital of Harbin Medical University，Harbin Heilongjiang 150081)
【Abstract】 Objective To explore the mechanisms on the inhibition of TALAS(general saponins of
aralia elata leaves)on SKOV3 － DDP cells and the mechanism of its reversal of drug resistance． Methods
MTT assay was used to detect the inhibition of TALAS on SKOV3 － DDP cells to draw the inhibition curve．
TUNEL assay was applied to detect the promotion of TALAS on SKOV3 － DDP apoptosis． The western blotting
was adopted to detect the expressions of relevant drug － resistance proteins． The flow cytometry was provided
to detect the impacts of TALAS on the progression of SKOV3 － DDP cell period． Results TALAS effectively
inhibited the growth of cisplatin resistance on ovarian cancer cell strain． This inhibition presented the concen-
tration － time dependence． TALAS forced SKOV3 － DDP cell period to be arrested at G1 stage and induced
apoptosis． TALAS reduced the expressions of drug － resistance proteins of SKOV3 － DDP cells． Conclusion
TALAS inhibits the growth of SKOV3 － DDP cells，which is probably related to that TALAS promotes the cell
period arrest，induces apoptosis and reduces the expressions of drug － resistance proteins．
【Key words】 Aralia Elata;Drug Resistance;Anti － Cancer;Triterpenoid Saponins
卵巢癌为致死率最高的妇科肿瘤，常规的治疗
方法以手术为主，化疗、放疗为辅。由于对铂类药
物耐药等原因，五年生存率低于 45%［1 － 2］，肿瘤化
疗耐药问题已经成为肿瘤治疗的关键问题之一。
辽东楤木，又名刺老芽、龙牙楤木，为我国东北地区
常见山野菜［3］，实验证明辽东楤木叶总皂苷(TA-
LAS)具有抑制卵巢癌细胞生长的作用［4］，本实验拟
探讨辽东楤木叶总皂苷抑制卵巢癌耐药株的生长
并逆转卵巢癌细胞耐药的作用。
材料与方法
一、实验材料
1．细胞系及培养:上皮性卵巢癌细胞耐顺铂株
(SKOV3 － DDP)由中国肿瘤研究所馈赠，SKOV3 －
DDP细胞培养于含 10%胎牛血清的 RPMI － 1640 培
养液中，其中加入 0． 1%的青 －链霉素和 0． 3%谷氨
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DOI:10.13935/j.cnki.sjzx.2012.08.022
世界中西医结合杂志 2012年第 7卷第 8期 World Journal of Integrated Traditional and Western Medicine 2012，Vol. 7，No. 8
酰胺，37 ℃、5%CO2 恒温培养箱培养，每隔 3 d传一
代，取对数生长期细胞用于以下实验。
2．药物及试剂:辽东楤木叶总皂苷(粉末状、褐
色、易溶于水，室温保存)由黑龙江中医药大学，中
药化学教研室，匡海学教授赠送，用含 10%胎牛血
清的 RPMI － 1640 培养液配成 1000 μg·mL －1的母
液，－ 20 ℃保存，根据实验需求配成相应浓度。RP-
MI － 1640 培养液(HyClone，美国，HC － 3608) ;胎牛
血清(NQBB，澳大利亚，NQ － 08 － 325) ;TUNEL 原
位凋亡检测试剂盒(罗氏，瑞士，批号:1168481791) ;
蛋白分子量标准(碧云天，中国) ;鼠抗人 － LRP 抗体
(BD公司，美国，批号:BA0656) ;鼠抗人 － MDR － 1
抗体(BD公司，美国，批号:MK2522) ;内参 β － actin
(San － KL － 006)、马抗小鼠 IgG(San － KL － 028)
(北京中衫金桥，SANTA CRUZ 进口分装) ;MTT
(SML －010)、DMSO(S9321)、PI(P4170)、RNase A
(90436528) (sigmal，美国)。
3．实验耗材及仪器设备:细胞培养瓶、细胞培养
板等耗材(corning) ;DYY － 12 型电泳仪(北京六一
仪器厂) ;GDS － 8000 凝胶成像仪(UVP，美国) ;流
式细胞仪(BD，美国) ;多功能酶标仪(Biotek，美
国)等。
二、实验方法
1． MTT法检测辽东楤木叶总皂苷(TALAS)对
SKOV3 － DDP 细胞生长的抑制作用:对数生长期
SKOV3 － DDP细胞以每孔 5 × 103 个种于 96 孔培养
板中，每组设五个副孔，周边孔用 PBS 填补，培养过
夜，加入不同浓度 LATS，并设立阴性对照组(不加
药，只加培养液)及空白对照组(不加细胞，只加培
养液) ，分别培养 24、48、72 h 后，每孔加入 20 μL
MTT，37 ℃孵育 4 h。吸出上清液，各孔加入 150 μL
DMSO，摇床振荡 10 min 后，酶标仪测定 570 nm 波
长时各孔的吸光度值。根据公式:细胞增殖抑制率
= ［1 － 验组 A 值 /(对照组 A 值 －空白组 A 值) ］
× 100%，计算抑制率，SPSS13． 0 制作抑制曲线。
2． TUNEL法检测细胞凋亡:对数生长期 SKOV3
－ DDP细胞以每孔 2 × 105 个种植于 6 孔细胞培养
板中，培养 24 h后，分为对照组，低剂量组(50 μg·
mL －1) ，中剂量组(100 μg·mL －1) ，高剂量组(200
μg·mL －1) ，弃上清液，分别加入不同浓度药液，继
续培养 24 h。依据 TUNEL 原位凋亡检测试剂盒说
明书检测，用荧光倒置显微镜观察，绿色荧光染色
细胞为凋亡细胞，实验重复三次。
3．蛋白印迹法检测耐药蛋白的表达:对数生长
期 SKOV3 － DDP细胞于细胞培养瓶中培养过夜，分
为对照组，低剂量组(50 μg·mL －1) ，中剂量组(100
μg·mL －1) ，高剂量组(200 μg·mL －1) ，继续培养
24 h，各组收集细胞，裂解液裂解 1 h，每隔 15 min 涡
旋一次，11 400 g·m －1品浓度，将样品与上样缓冲
液(含 β －巯基乙醇)混匀，99 ℃煮 5 min。根据浓
度计算上样量，进行聚丙烯胺凝胶电泳 1． 5 h，再将
蛋白质转到硝酸纤维素膜上(2 h) ，1% BSA 封闭过
夜，鼠抗人 － LRP抗体、鼠抗人 － MDR － 1 单克隆抗
体按 1∶ 1000 稀释，β － actin 按 1 ∶ 300 稀释，一抗孵
育 2 h，二抗孵育 2 h，DAB 显色 5 ～ 10 min，UVP 凝
胶成像仪照相，分析结果。
4．流式细胞仪检测细胞周期的变化:对数生长
期 SKOV3 － DDP细胞于六孔培养板中培养过夜，分
为对照组，低剂量组(50 μg·mL －1) ，中剂量组(100
μg·mL －1) ，高剂量组(200 μg·mL －1) ，继续培养
24 h。收集细胞，PBS液冲洗 3 遍，75%冰乙醇固定
48 h 后，PBS 液再冲洗 3 遍，1500 g 离心 5 min，37
℃ PI 染色 30 min，流式细胞仪检测细胞周期的
改变。
三、统计学处理
ModFit LT软件分析结果，实验重复 3 次，取平
均值。
结 果
1． TALAS 对 SKOV3 － DDP 细胞的抑制作用:
MTT法检测 LATS 分别作用 24、48、72 h 后，SKOV3
－ DDP细胞的生长情况，如图 1 所示，TALAS对 SK-
OV3 － DDP的抑制作用具有浓度—时间依赖性，即:
随 TALAS 浓度增高，作用时间延长，对 SKOV3 －
DDP的抑制作用亦随之增强。
图 1 TALAS作用 24、48、72 h后，对 SKOV3 － DDP细胞生长的抑制作用
2． TUNEL法检测 TALAS对 SKOV3 － DDP细胞
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促凋亡作用:应用原位凋亡检测试剂盒检测 TALAS
对 SKOV3 － DDP细胞的促凋亡作用，如图 2 所示，
正常对照组仅见少量细胞凋亡，而加药组随着药物
浓度的增加细胞的凋亡率亦随之增加，且具有浓度
依赖性。
图 2 不同浓度 TALAS作用后，SKOV3 － DDP细胞发生凋亡
3． TALAS对耐药蛋白表达的影响:应用蛋白印
记的方法检测 TALAS对耐药蛋白的影响，如图 3 所
示，与各组内参相比，蛋白 LRP、MDR － 1 的表达随
药物浓度的增加而减弱。
图 3 蛋白印迹法检测耐药蛋白的表达
应用蛋白条带灰度软件进行条带灰度值的分
析，将对照组的灰度值设置为 1，其他各组为相对灰
度值，其结果见表 1。
表 1 条带灰度值分析(μg·mL －1)
0 50 100 200
LRP 1 0． 765 0． 565 0． 212
MDR －1 1 0． 832 0． 413 0． 206
LRP /actin 1 0． 756 0． 566a 0． 209b
MDR －1 /actin 1 0． 822 0． 414a 0． 203b
β － actin 1 1． 012 0． 998 1． 014
注:与正常组比较，aP ＜ 0． 05，bP ＜ 0． 01
4． TALAS对 SKOV3 － DDP细胞周期的影响:流
式细胞仪检测 TALAS对细胞周期的影响，结果如图
4 所示，TALAS 可诱导 SKOV3 － DDP 细胞周期停滞
于 G1 期，随 TALAS 药物浓度的增加，G1 期停滞比
例增加。
图 4 TALAS对 SKOV3 － DDP细胞周期的影响，可促使细胞周期停滞于 G1 期
讨 论
传统中药的抗肿瘤作用已经得到了越来越多
的重视，据统计，已有 700 ～ 800 余种中药被应用于
治疗肿瘤及肿瘤相关症状［6 － 7］上。辽东楤木的传统
功效为治疗糖尿病、抗炎、保护作用等。肿瘤细胞
多药耐药的产生(MDR)会导致化疗失败或化疗效
果逐渐下降，是目前卵巢癌患者化疗失败的主要原
因之一。MDR是指肿瘤对某种抗肿瘤药物出现耐
药性，但同时也对其他类型抗肿瘤药物产生耐药。
多药耐药基因 I(MDR1)与多种肿瘤细胞耐药相关，
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其他的耐药机制还可能与乳腺癌耐药蛋白(BCRP)
或肺耐药蛋白(LRP)有关［8］。
在前期的实验中我们发现，辽东楤木叶中提取
的总皂苷可以抑制卵巢癌细胞 SKOV3 的生长，促进
其发生凋亡。本实验则主要探讨 TALAS 对 SKOV3
－ DDP的抑制作用及其逆转卵巢癌耐药的作用。
结果发现 TALAS 可明显抑制 SKOV3 － DDP 的生
长，并且发现随药物浓度的增加，作用时间的延长
其抑制率也是逐渐的增加，即具有量 －时依赖性，
这与前期对 SKOV3 的抑制作用是一致的，效果相
似。通过 TUNEL 原位凋亡检测试剂盒，发现 TA-
LAS可诱导 SKOV3 － DDP发生凋亡，并使其细胞周
期停滞于 G1 期。通过蛋白印迹实验我们发现，SK-
OV3 － DDP 细胞株 MDR1、LRP 的表达较强，在经
TALAS干预后，其表达明显下降能与其促使细胞周
期停滞、诱导细胞发生凋亡，并下调耐药蛋白的表
达有关。TALAS 可能成为临床上治疗卵巢癌并逆
转其耐药的遴选药物，具有一定的临床意义。
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(收稿日期:2012 － 04 － 03)
(上接第 702 页)
中西医结合是中医发展的未来方向，将中医证型与
现代检测指标及实验室数据融为一体是实现中西
医结合的一条重要途径［5］。本研究在一定程度上
为中西医结合研究和防治脑血管病变提供了理论
依据。研究结果提示，无论是较轻或较重的动脉狭
窄患者，主要以痰浊、瘀血为主要病机，兼有气虚、
风火、阴虚等证，虚实夹杂。鉴于此，我们在治疗缺
血性中风时，主要以运用活血化瘀、行气化浊的药
物为主，根据辨证，配合补气、祛风、益阴等方法，可
望在中医治疗中风上获得较好的疗效。当然，由于
本研究例数偏少，证型较分散，结果可能存在一定
的误差和偏移，因此尚需进一步扩大样本并进行深
入量化研究。
参 考 文 献
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