全 文 ：基金项目：江苏省农业科技自主创新资金项目(No. CX(12)2019)
收稿日期：2015-05-07 接受日期：2015-06-12
芍药花分生组织决定基因(AP1)克隆、序列分析及其在不同发育时期
花瓣中的表达变化规律
吴彦庆 1 葛金涛 1，2 陶俊 1*
1扬州大学园艺与植物保护学院，扬州 225009；2江苏省连云港农业科学院，连云港 222000
*通讯作者，taojun@yzu.edu.cn
摘 要 为进一步了解芍药(Paeonia lactiflora Pall.)花分生组织决定基因(APETALA1, AP1)的生物学功
能，本研究根据高等植物AP1基因的保守区域设计引物，采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技
术从芍药中克隆了AP1基因(GenBank登录号: KC354376)，利用生物信息学对其蛋白结构及功能进行分
析和预测，并对其在芍药不同花发育时期内外花瓣中差异表达进行系统分析。测序结果表明，获得芍药
AP1基因 cDNA全长为 1 236 bp，其ORF全长为 726 bp，编码 242个氨基酸。生物信息学分析表明，芍药
AP1蛋白为脂溶亲水性的不稳定蛋白，无跨膜结构和信号肽，表明为非分泌蛋白；其二级结构以α螺旋和
无规则卷曲为主；AP1蛋白存在1个N-糖基化位点(89号氨基酸)和1个O-糖基化位点(206号氨基酸)，还
存在 13个潜在的磷酸化位点，其中包括有蛋白激酶 C(protein kinase C, PKC)、表皮生长因子受体
(epidermal growth factor receptor, EGFR)、酪蛋白激酶Ⅱ(casein kinaseⅡ, CKⅡ)、依赖DNA的蛋白激酶
(DNA-Protein kinase, DNAPK)、蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)、蛋白激酶G(protein kinase G, PKG)、毛
细血管扩张共济失调突变蛋白(Ataxia-telangiectasia mutated protein, ATM)和p38分裂原激活的蛋白激酶
(p38-mitogen activated protein kinases, p38MAPK)等8种保守的特异性蛋白质激酶的结合位点；芍药AP1
蛋白包含MADS(2~74位氨基酸)和K-box(89~173位氨基酸)2个超级家族保守结构域。芍药AP1基因表
达谱检测发现，AP1基因在芍药花色嵌合体品种金辉4个发育阶段(花蕾期,初开期,盛开期和衰败期)的
内外花瓣中的表达水平均存在差异表达，在衰败期内外花瓣中表达水平差异极显著(P＜0.01)，进一步表
明，AP1基因表达水平可能与芍药花器官发育有关。本研究成功获得了芍药AP1基因全长cDNA序列，进
一步揭示了芍药AP1蛋白的理化性质、结构以及AP1的潜在功能，为今后系统开展芍药AP1基因的功能
研究提供基础资料。
关键词 芍药，花分生组织决定基因(AP1)，克隆，蛋白结构与功能，差异表达
cDNA Cloning, Sequence Analysis and Tissue Expression Detection of
APETALA1 Gene (AP1) in Paeonia lactiflora Pall. Petals of Different
Development Stages
WU Yan-Qing1 GE Jin-Tao1,2 TAO Jun1*
1 College of Horticulture and Plant Protection, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2 Lianyungang Academy of Agricultural
Sciences, Lianyungang 222000, China
* Corresponding author, taojun@yzu.edu.cn
Abstract In order to understand the biological function of APETALA1 gene (AP1) in Paeonia lactiflora
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2015, 23(12): 1559~1567
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2015.12.004
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
芍药(Paeonia lactiflora Pall.)为芍药科(Paeonia-
ceae)芍药属植物，是原产我国的传统名花，与花中
之王牡丹并称为“花中二绝”，有“花相”之美誉。花
色是决定花卉观赏价值的重要元素，花器官是研究
植物发育、基因和进化三者关联的理想模型系统
(曾英等, 2001)，芍药的花色和器官发育成为重点
关注的研究对象。目前，在芍药花色形成机理方面
已有大量报道，对花色素成分进行了系统分析
(Pelaz et al., 2000; 2001; Theissen, Saedler, 2001)，本
课题组利用RNA-Seq技术分析了芍药花色嵌合体
金辉(外瓣红色,内瓣黄色)形成的分子机理，并筛
选出苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,
PAL)、黄烷酮 -3-羟化酶 (Flavanone 3-hydroxylase,
F3H)、黄酮醇合酶(flavonol synthase, FLS)和花色素
合酶(anthocyanidin synthase, ANS)等与花色相关的
重要候选基因(Zhao et al., 2014)。与芍药花色相
比，芍药花器官发育形成相关的分子机制研究比较
薄弱，已有研究主要集中在拟南芥 (Arabidopsis
thaliana)、牡丹(Paeonia suffruticosa)、草莓(Fragaria
ananassa)等模式植物上，已分离到一系列调节花
发育的重要基因(Mandel et al., 1992;任磊, 2011;邹
冬梅等, 2012)。其中，分离的花分生组织决定基因
(APETALA1, AP1)属于花器官发育ABCDE模型成
员之一，可以调控花序分生组织转变为花分生组
织，激活B类基因的表达，决定花瓣和萼片的形成，
具有影响花器官形态特征的功能 (Mandel et al.,
1992)。研究发现，AP1转基因拟南芥长短日照条件
下的开花时间均早于野生型拟南芥(Weigel, Nils-
son, 1995; Sarah et al., 1999)；在拟南芥植物中分别
转入柳树(Salix babylonica)两个AP1同源基因，其开
花时间提前，并且出现雌蕊、雄蕊和花瓣增多的现
象(Fenando, Zhang, 2006)。上述研究都表明，AP1
基因与花器官发育密切相关，且此基因在不同植物
间具有保守性。目前克隆结合生物信息学分析技
Pall., the present study designed primer based on conserved domain of higher plant AP1 and RACE (rapid-
amplification of cDNA ends) cloned AP1 (GenBank No. KC354376) from Paeonia lactiflora Pall.. The
molecular structure and function of AP1 protein were analyzed and predicted by using bioinformatics.
Moreover, the differential expression of AP1 gene in the inner and outer petals among different development
stages was systematically analyzed. Primers were designed based on the conserved sequence of higher plants
AP1 gene and were used in amplifying the Paeonia lactiflora Pall. AP1 by RACE technology. Sequencing
assays showed that the full- length cDNA of AP1 gene consisted of 1 236 bp and contained a 726 bp ORF
encoding 242 amino acids. Bioinformatics analysis demonstrated that AP1 protein was unstable and
hydrophilic, meanwhile no signal peptide and transmembrane structure indicating AP1 protein of non-secretory.
α-helices and random coils were its main elements of the secondary structure of AP1 protein. AP1 protein had
one N-glycosylation site located in 89th amino acid, one O-glycosylation site located in 206th amino acid, 13
potential phosphorylation sites including 8 conservative binding sites of specific protein kinase such as protein
kinase C(PKC), epidermal growth factor receptor (EGFR), casein kinase Ⅱ (CK Ⅱ), DNA- protein kinase
(DNAPK), protein kinase A (PKA), protein kinase G (PKG), ataxia-telangiectasia mutated protein (ATM), p38-
mitogen activated protein kinases (p38MAPK). AP1 protein had 2 super family conservative domains of
MADS and K- box, which located in the region 2nd ~74th and 89th~173rd amino acid, respectively. Gene
expression profile showed the expression level of AP1 gene was different in the inner and outer petals from a
flower color chimaera cultivar Jinhui among 4 developmental stages (flower-bud stage, initiating bloom stage,
bloom stage and wither stage). Especially, AP1 expressed very significantly different between the inner and
outer petals in wither stage (P＜0.01), which furtherly indicated that the expression level of AP1 gene might be
related to Paeonia lactiflora Pall. flower organ development. This study successfully obtained the full- length
cDNA of AP1 gene and revealed the physicochemical property, structure and potential function of AP1 protein,
which lays a foundation for further studying on the function of Paeonia lactiflora Pall. AP1.
Keywords Paeonia lactiflora Pall., APETAL A1 gene (AP1), Cloning, Protein structure and function,
Differential expression
1560
术已经广泛运用于植物单个基因功能的初步研究
(黄娟等, 2015; 李菲等, 2015)，因此本研究利用不
同植物AP1基因保守性区域，以芍药为研究对象，
通过 cDNA末端快速扩增技术RACE技术克隆芍
药AP1基因，进一步利用生物信息学分析预测芍药
AP1蛋白的理化特性、结构与功能，最后以 4个不
同发育时期(花蕾期, 初开期, 盛开期和衰败期)芍
药花色嵌合体品种金辉为材料，采集内外花瓣进行
AP1基因差异表达分析。本研究获得了芍药花器
官发育相关基因AP1，为进一步分析芍药AP1基因
的功能和调节机制提供了基础资料。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验植物
本研究以芍药(Paeonia lactiflora Pall.)托桂型
品种向阳奇花的内外花瓣为实验材料，进行花分生
组织决定基因(APETALA1, AP1)的克隆；选用芍药
花色嵌合体品种金辉为材料(外瓣红色, 内瓣黄
色)，分别采集其 4个不同发育时期(花蕾期, S1;初
开期, S2;盛开期, S3;衰败期, S4)的内外花瓣用于
基因表达谱检测。供试品种均种植在扬州大学园
艺与植物保护学院芍药种质资源圃，采集的花瓣经
液氮速冻后，置于-80 ℃冰箱中备用。
1.1.2 生化试剂
DL2000、dNTP、PCR Buffer、DNA凝胶回收试
剂盒、RNA纯化试剂盒DNase I、3和 5-full RACE
Core Set Kit试剂盒、LA Taq DNA聚合酶、pMD18-T
载体、DH5α大肠杆菌(Escherichia coli)、dNTP、Prim-
eScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2、限制性内切酶
BamHⅠ和Hind Ⅲ、PrimerScriptTM 1st Strand cDNA
Synthesis Kit、Premix Ex TaqTM等均购于宝生物工
程(大连)有限公司，其他试剂都由国药集团化学试
剂有限公司(上海)提供，cDNA序列测定和引物合
成均委托上海生物工程技术服务有限公司完成。
1.2 实验方法
1.2.1 引物设计
根据GenBank中不同植物 AP1基因序列的保
守区域，运用BioEdit和 Primer Premier 5.0软件设
计目的基因RACE所需 PCR扩增引物和 qRT-PCR
所用特异性扩增引物 (表 1)，采用芍药的 Actin
(JN105299)基因作为本内参基因。所有引物送上
海生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.2 总RNA提取及cDNA合成
芍药内外花瓣总 RNA 的提取参照 Takara
MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒(宝生物
工程(大连)有限公司)说明书进行，RNA提取完放
入DEPC水溶解，-80 ℃保存备用。cDNA合成体
系 10 μL：1 μL总RNA(500 ng/μL)，1 μL 3 RACE
接头 (5 μmol/L)，2 μL 5 × M- MLV Buffer，1 μL
dNTP Mixture(10 mmol/L each)，0.25 μL RNase In-
hibitor(40 U/μL)，0.25 μL Reverse Transcriptase M-
MLV(RNase H- ) (200 U/μL)，4.5 μL RNase Free
ddH2O；反应条件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。反应
结束后反应液于-20 ℃保存。
1.2.3 RACE扩增及测序
以芍药花瓣中所提取的总 RNA为模板 (1.0
μg)，分别进行 3 RACE 和 5 RACE 扩增。 3
RACE：根据 3和 5-full RACE Core Set Kit的说明
书进行 cDNA第一条链的合成。cDNA的 3末和 5
引物
Primer
AP1-1
AP1-2
AP1-3
Actin-F
Actin-R
PlAP1-F
PlAP1-R
序列(5~3)
Sequence
AATACTCCAAACTTAGGGC
GAGGTTGCTTTGATTGTC
TTTCTCCAGTTGATTCATGCACCAAAGC
ACTGCTGAACGGGAAATT
ATGGCTGGAACAGGACTT
AAACCAAAGGCACTTTATG
CATTGCCGTTTCCTTCTT
用途
Purpose
1st of 3RACE
2nd of 3RACE
5RACE
qRT-PCR
qRT-PCR
qRT-PCR
qRT-PCR
Tm/℃
51
50
62
55
55
55
55
表 1 引物序列信息
Table 1 Information of primers
芍药花分生组织决定基因(AP1)基因克隆、序列分析及其在不同发育时期花瓣中的表达变化规律
cDNA Cloning, Sequence Analysis and Tissue Expression of AP1 in P. lactiflora Petals of Different Development Stages 1561
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端扩增由包含所设计的基因特异性引物(表1)和试
剂盒引物在内的两轮PCR完成。反应结束后将最
终的PCR反应液在 1%的琼脂糖凝胶上电泳检测。
PCR产物纯化回收后，将目的片段与克隆载体
pMD18-T连接、转化和挑取质粒送往上海生物工
程有限公司进行测序。
1.2.4 qRT-PCR分析
以反转录 cDNA产物为模板，进行 qRT-PCR。
反应体系 25 μL：SYBR® Premix Ex TaqTM (2×) 12.5
μL，PCR 上下游引物(10 pmol/mL)各 0.5 μL，Rox
Reference Dye Ⅱ(50×)0.5 μL，cDNA(100 ng/μL)模
板2 μL，最后补充ddH2O至25 μL；PCR反应条件：
94 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 15 s，50 ℃退火 15 s，
72 ℃延伸40 s，40个循环；72 ℃延伸10 min。
1.2.5 生物信息学分析
PCR产物经测序分析后，利用DNAStar软件将
AP1基因的核苷酸序列翻译成相应的氨基酸序列，
利用 BioEdit软件对芍药、牡丹(HM143943)、葡萄
(Vitis vinifera, NM_001281281)、芒果 (Mangifera in⁃
dica, GQ152892)、甜橙(Citrus Sinensis, AY338974)、
梨(Pyrus Pyrifolia, KP164004)、碧桃(Prunus persica,
EU079377)等不同物种的AP1基因进行核苷酸和氨
基酸序列同源性分析。此外，通过生物信息学预测
与分析芍药AP1蛋白的结构与功能：首先，在线分
析蛋白的一级结构包括蛋白理化性质、疏水性和信
号肽；其次分析蛋白的二级结构包括α螺旋、β折叠
和自由卷曲等；然后分析蛋白的功能位点及区域，
包括糖基化位点、磷酸化位点、特异性蛋白激酶位
点以及保守性区域，以上预测分析方法见表2。
2 结果与分析
2.1 芍药AP1基因克隆及鉴定
以芍药花瓣中所提取的RNA反转录的 cDNA
产物为模板，采用RACE方法进行 3和 5端 cDNA
片段的扩增。由图1B可以看出，AP1基因3-RACE
扩增得到一条约为 900 bp包含部分ORF框的条
带。根据此条带克隆、测序的结果，设计其上游反
向引物，进行 5-RACE扩增，得到一条约为 400 bp
的条带(图 1A)，将此条带克隆、测序确定为PlAP1
基因 5端 cDNA片段。然后利用CAP3软件(http://
doua.prabi.fr/software/cap3)对 5-RACE和 3-RACE
的测序结果进行拼接得到AP1的cDNA全长序列。
2.2 序列分析
经测序分析，获得 1 236 bp芍药 AP1基因 cD-
表 2 蛋白结构功能的生物信息学分析
Table 2 Bioinformatics analysis of protein structure or function
蛋白结构与功能
Protein structure and function
蛋白理化性质 Physicochemical property
信号肽 Signal peptide
疏水性 Hydrophobicity
跨膜区 Transmembrane region
二级结构 Secondary structure
O-糖基化位点 O-glycosylation sites
N-糖基化位点 N- glycosylation sites
磷酸化位点 Phosphorylation sites
特异性蛋白激酶位点 Specific protein kinase sites
保守域 Conservative domain
分析方法
Analytical method
ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)
SignalP3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)
ProtScale (http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)
TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)
GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)
NetOGlyc (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)
NetNGlyc (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)
NetPhos (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)
NetPhosK 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/)
CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)
图 1 AP1基因5 (A)和3 (B)RACE扩增产物
Figure 1 5 (A) and 3 (B) RACE product of AP1 gene
M：DL2000 分子量标准；1：5端 cDNA的扩增片段；2：3端
cDNA的扩增片段
M: DL2000 marker; 1: 5 cDNA amplified fragment; 2: 3 cD-
NA amplified fragment
A B
2000
1000
750
500
250
100
bp M 1
2000
1000
750
500
250
100
bp M 2
1562
NA全长序列，其中包含一个完整的 726 bp的开放
阅读框 (ORF)；5端含有 265 bp 的 5非翻译区
(UTR)；3端含有 245 bp的 3非翻译区(UTR)，其具
有完整的 PolyA尾巴(12 bp)；其ORF序列共编码
242个氨基酸(图 2)。该基因已提交于GenBank数
据库(登录号: KC354376)。同源性分析发现，芍药
PlAP1基因与牡丹、葡萄、芒果、甜橙、梨、碧桃核苷
酸序列同源性分别为97.9%、80.7%、74.5%、73.7%、
72.6%和 72.8%，氨基酸序列同源性分别为 96.6%、
81.0%、75.1%、69.1%、70.2%和70.9%。
2.3 蛋白结构与功能预测分析
2.3.1 蛋白结构
利用在线软件分析发现，芍药AP1蛋白分子式
为C1220H1971N357O378S12，相对分子质量约为 28.07 kD，
理论等电点pI 8.64，带负电荷和正电荷的氨基酸残
基数分别为33和36个。蛋白质中脂肪链氨基酸含
量表示脂溶指数 (aliphatic index)，主要由亮氨酸
Leu、异亮氨酸 Ile和缬氨酸Val组成。本研究发现，
该AP1蛋白脂溶指数为 77.81，表明该蛋白是脂溶
性蛋白(Gasteiger et al., 2005)。不稳定系数(insta-
bility index)为 51.25 (＞40)，表明该AP1蛋白不稳
定。总平均亲水性(GRAVY)为-0.797，表明该蛋白
为亲水性蛋白(Gasteiger et al., 2005)。芍药AP1蛋
白最大疏水性位于第45号氨基酸(Score: 2.089)，最
大亲水性位于140号氨基酸(Score: -2.622)，整体来
看亲水性区域大于疏水性。经分析，芍药AP1蛋白
无跨膜结构，且不存在信号肽；AP1蛋白二级结构
图 2 芍药AP1基因核酸序列及推断的氨基酸序列Pall.
Figure 2 Nucleotide sequence and amino acid sequence of AP1 gene in Paeonia lactiflora Pall.
单下划线：开放阅读框；双下划线：PolyA尾巴；方框：起始密码子；*：终止密码子
Underlined: Open reading frame; Double underlined: PolyA sequence; Box: Initiation codon; *: Termination codon
芍药花分生组织决定基因(AP1)基因克隆、序列分析及其在不同发育时期花瓣中的表达变化规律
cDNA Cloning, Sequence Analysis and Tissue Expression of AP1 in P. lactiflora Petals of Different Development Stages
GGGAATACGTCAGTGATTGTATACGACTCACTATAGGGCGAATTGAATTTAGCGGCCGCGAATTGCCCTTCTAATACGACTC
ACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGGGGTTCACACAAAAAGTAATCAAGAAATGGAAACAACAACA
AACCTATTTTCCCTCTGAAGAAAAATATTCTCACCCTTTCTCGAGAATAACTGATTCGGGAAATTGTGTGTTTGGGTGGTG
GGAAAAGGAATTAATTACGAGATGGGAAGAGGCAGGGTTCAACTGAAGCGTATAGAAAACAAGATCAATCGACAAGTGACC
M G R G R V Q L K R I E N K I N R Q V T
TTCTCAAAGCGGAGGGGTGGGTTGCTGAAGAAAGCTCATGAGATCTCAGTCTTGTGTGATGCTGAGGTTGCTTTGATTGTC
F S K R R G G L L K K A H E I S V L C D A E V A L I V
TTCTCTACTAAAGGGAAGCTGTTTGAGTACTCCACAGATTCTAGCATGGAGAAGATACTCGACCGTTACGAGCGATATTCT
F S T K G K L F E Y S T D S S M E K I L D R Y E R Y S
ATTGCCGAGCGACAACTGGTTGAGGAACCTGGATCACAGGGAAATTGGTCTCTAGAATACTCCAAACTTAGGGCCAAGATA
I A E R Q L V E E P G S Q G N W S L E Y S K L R A K I
GAGCTTTTACAAAGAAACCAAAGGCACTTTATGGGAGAAGATCTTGACTCATTGAGTCCTAAAGATCTCCAAAATATGGAG
E L L Q R N Q R H F M G E D L D S L S P K D L Q N M E
CAACAACTTGACGTTTCTCTTAAAAACATACGATCAAGAAAAAATCAACTCATGTATGAGTCAATTTCAGAGCTTCAGAAG
Q Q L D V S L K N I R S R K N Q L M Y E S I S E L Q K
AAGGAAACGGCAATGCAGGAGCAGAACAATTTGCTAGCAAAGCAGATTAAGGAGAAAGAGAAGACAATGGCACAGCAGGCG
K E T A M Q E Q N N L L A K Q I K E K E K T M A Q Q A
CAATGGGAGCAGCAAATTCGTCATGGCCCAAATGCATCAGCCTACATATTATCACCACATGAATTTACTACTCTAAACATG
Q W E Q Q I R H G P N A S A Y I L S P H E F T T L N M
GGTGGCAATTACCAAGGAGAACCAACAGAAATGAGGAGGAACGAGCTCGACCTCACACTGGAACCAATATATACGTGTCAC
G G N Y Q G E P T E M R R N E L D L T L E P I Y T C H
CTTGGGTGCTTTGGTGCATGAATCAACTGGAGAAAGCACTCCTTCGGACCGTTTTGAATTGCTGCTCTCTTTGTGAATTTT
L G C F G A *
GAACTCTCCTTGAACGAACTTAAACTACATGTAATTTCAAATTTCCAATATTTCAAACTACTGAAATAGTCACGACTTCTG
TATTTCCATGTATAAAAAGTACGTGGAACATATTTGCTTTTGCAATAAGACCATGTAGCATGCTAACTGAAGTAACATTTT
CCTTACCGAAAAAAAAAAAACGTGGAACATATTTGCTTTTGCAATAAGACCATGTAGCATGCTAACTGAAGTAACATTTTC
CTTACCGAAAAAAAAAAAA
1
83
164
245
326
407
488
569
650
731
812
893
974
1055
1136
1217
1298
1563
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
包括α螺旋(Alpha helix)138个，占57.02%，β延伸链
34个，占14.05%，无规则卷曲70个，占28.93%。
2.3.2 蛋白功能位点
在线软件分析可知，芍药AP1蛋白存在1个N-
糖基化位点，位于 89号氨基酸，潜在值为 0.534(图
3A)，此外还存在1个O-糖基化位点，位于206号氨
基酸，潜在值为0.612(图3B)；该蛋白存在13个潜在
的磷酸化位点，包括10个Ser、0个Thr和3个Tyr(图
4)，上述磷酸化位点所对应的磷酸激酶预测结果显
示，在AP1蛋白上可能有蛋白激酶C(protein kinase
C, PKC)、表皮生长因子受体(epidermal growth fac-
tor receptor, EGFR)、酪蛋白激酶Ⅱ (casein kinase
Ⅱ, CKⅡ)、依赖DNA的蛋白激酶(DNA-Protein ki-
nase, DNAPK)、蛋 白 激 酶 A(protein kinase A,
PKA)、蛋白激酶G(protein kinase G, PKG)、毛细血
管扩张共济失调突变蛋白 (Ataxia- telangiectasia
mutated protein, ATM)和 p38分裂原激活的蛋白激
酶 (p38- mitogen activated protein kinases,
p38MAPK)等8种保守的特异性蛋白质激酶的结合
位点(表3)，其中在22位处PKC分值最高为0.91。
2.3.3 蛋白功能区域
利用 NCBI的 CDD数据库(Marchler-Bauer et
al., 2011)分析AP1蛋白的功能结构域，结果发现，
AP1蛋白包含2个超级家族保守结构域：MADS和
K-box。MADS属于重要的转录调控元件，在植物
同源异型调控中发挥重要的作用 (Huijser et al.,
1992)，位于 2~74位氨基酸，预测评估值E=2.95e-41；
K-box与血清应答因子(serum response factor, SRF)
转录因子的调控有关(Huijser et al., 1992)，位于89~
173位氨基酸，预测评估值E=为5.74e-33。
2.4 基因表达谱检测
以芍药花色嵌合体品种金辉 4个发育阶段(花
蕾期,初开期,盛开期和衰败期)内外花瓣为实验对
象，进行AP1基因的qRT-PCR表达水平检测。结果
发现(图5)，AP1基因在4个不同发育时期的内外花
瓣中的表达水平均存在一定的差异。衰败期时，该
基因在内外花瓣的表达水平呈极显著差异(P＜
0.01)。
图 4 芍药AP1蛋白的磷酸化位点分析
Figure 4 Phosphorylation site analysis of AP1 protein in
Paeonia lactiflora Pall.
89
206
阈值 Threshold
潜在值 Potential
1.00
0.75
0.50
0.25
0 50 100 150 200
氨基酸位置Amino acid position
氨基酸位置Amino acid position
0
50 100 150 200
1.00
0.75
0.50
0.25
潜
在
的
N
-糖
基
化
位
点
Po
te
nt
ia
lN
-g
ly
co
sy
la
tio
n
潜
在
的
O
-糖
基
化
位
点
Po
te
nt
ia
lO
-g
ly
co
sy
la
tio
n 潜在值 Potential
阈值 Threshold
图3 芍药AP1蛋白的糖基化位点分析
Figure3 Glycosylation site analysis ofAP1protein in Paeo⁃
nia lactiflora Pall.
图 5 芍药花瓣中AP1基因表达谱检测
Figure 5 Expression profile of AP1 gene in Paeonia lacti⁃
flora Pall. petal
**：差异极显著(P＜0.01)；内参基因：Actin；n=3；S1、S2、S3和
S4：花蕾期、初开期、盛开期和衰败期
**: Very significant difference (P＜0.01); Reference gene: Ac⁃
tin; n=3; S1, S2, S3 and S4: Flower-bud stage, initiating bloom
stage, bloom stage and wither stage, respectively
相
对
表
达
量
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
le
ve
l
**
外瓣 Outer-petal
内瓣 Inner-petal
S1 S2 S3 S4
0
1
2
3
4
22 61 6274
86
91118
120134
140
147 197
233
丝氨酸 Serine
苏氨酸 Threonine
酪氨酸 Tyrosine
阈值 Threshold
0 50 100 150 200
1
潜
在
的
磷
酸
化
位
点
P
ot
en
ti
al
ph
os
ph
or
yl
at
io
n
氨基酸位置Amino acid position
A
B
1564
3 讨论
花的形态发育是一个高度复杂并且具有较强
稳定性的过程，是植物生长发育不可缺少的重要环
节，其过程主要受到许多基因的表达调控。花器官
发育研究取得了很大的进展，Coen和Meyerowitz
(1991)在模式生物拟南芥、金鱼草(Antirrhinum ma⁃
jus)等花器官同源异型突变体中获得许多花器官发
育调控相关的功能基因，进而提出了器官发育
ABC模型；在此基础上，有关学者又发现了ABCD
模型，并且将胚珠发育调控相关基因归属于D类功
能基因(Colombo et al., 1995；研究发现，控制矮牵
牛(Petumia hybrida)胚珠发育的两个重要功能基因
包括花香结合蛋白(floral binding protein 7, FBP7)
和 FBP11(Angenent et al., 1995)；Pelaz 等 (2000;
2001)成功克隆出拟南芥SEPALLATA1/2/3(SEP1/2/
3)基因全长，并发现三者同时发生基因突变时，整
个发育时期花瓣呈萼片状结构，从而进一步提出了
花器官发育 ABCDE 模型。随着花器官发育
ABCDE模型的深入研究，进一步揭示了MADS-
box在植物不同发育时期中器官形成的作用机
制。AP1作为MADS-box基因家族中的一类重要
转录因子，在植物花器官发育以及信号传导中均起
到调控作用，在植物中不仅参与花原基早期阶段的
发育及花器官起始和发育，也在果实、根、茎、叶的
发育中起着重要的作用，AP1基因突变后的拟南芥
表现为花分生组织缺陷(Coen, Meyerowitz, 1991;
Becker, Theißen, 2003)。目前关于芍药科植物花器
官发育相关功能基因的研究在牡丹中取得了一定
进展(任磊, 2011)，但是关于芍药花器官发育相关
基因的筛选和功能分析相对较少。任磊(2011)从
牡丹不同器官中成功克隆出 PsAP1、PsAP2、Ps⁃
MADS9、PsAG、PsPI、PsMADS1和 PsMADS5等 7个
花器官发育相关基因 cDNA全长序列；先前大量研
究表明，AP1基因可能与花器官发育调控有关
(Mandel et al., 1992; Weigel, Nilsson, 1995; Sarah et
al., 1999; Fernando, Zhang, 2006)，因此本研究利用
获得的AP1基因 cDNA全长序列，将其翻译成相应
的蛋白质序列，通过生物信息学手段分析蛋白质结
构、功能位点及保守域。
真核生物中比较常见的两种组蛋白翻译后修
饰方式为磷酸化和糖基化，磷酸化主要识别 Ser/
Thr/Tyr氨基酸残基，糖基化位点主要修饰天冬酰
胺Asn上的N端，其识别的特征序列为Asn-X-Ser/
Thr(X 表示任何一种氨基酸) (Mellquist et al.,
1998)。本研究表明，AP1蛋白存在2个糖基化位点
(1个O-糖基化和 1个N-糖基化)，以及 13个磷酸化
位点。蛋白糖基化修饰可以通过改变免疫分子的
结构和功能，从而影响到机体对抗原的免疫应答反
应能力(Calarese et al., 2003)。此外，膜蛋白是一类
具有特殊生物学功能的细胞结构蛋白，具有跨膜区
的蛋白质可能为膜受体，也可能为膜锚定蛋白或者
离子通道蛋白(张成岗, 贺福初, 2002)。信号肽是
位于分泌蛋白N端15~35位氨基酸的疏水性区域，
具有引导蛋白肽链进入内质网腔内的功能，本研究
发现，AP1蛋白不包含跨膜结构和信号肽区域，这
进一步表明AP1蛋白不属于分泌性蛋白。对于蛋
白保守功能域而言，AP1蛋白存在MADS(2~74位
氨基酸)和K-box(89~173位氨基酸)2个重要功能区
域，并且其功能与植物同源异型转录调控密切相
关，Honma和Goto(2001)通过酵母双杂交和凝胶阻
滞研究表明，控制花器官发育的MADS-box蛋白能
够形成同源或异源二聚体，进而组装成三元或四元
表 3 芍药AP1保守的特异性蛋白激酶作用位点
Table 3 Conserved and specific phosphkinase binding sites in AP1 protein of Paeonia lactiflora Pall.
激酶 Kinase
PKC
EGFR
CKⅡ
DNAPK
PKA
PKG
ATM
p38MAPK
全称 Full name
蛋白激酶 Protein kinase C
表皮生长因子受体 Epidermal growth factor receptor
酪蛋白激酶Ⅱ Casein kinaseⅡ
依赖DNA的蛋白激酶 DNA-protein kinase
蛋白激酶A Protein kinase A
蛋白激酶G Protein kinase G
毛细血管扩张共济失调突变蛋白 Ataxia-telangiectasia mutated protein
p38分裂原激活的蛋白激酶 p38-mitogen activated protein kinases
位点 Site
22, 49, 50, 95
73
59, 61, 74, 149, 151, 200
62, 86, 91
74
140
86
200
芍药花分生组织决定基因(AP1)基因克隆、序列分析及其在不同发育时期花瓣中的表达变化规律
cDNA Cloning, Sequence Analysis and Tissue Expression of AP1 in P. lactiflora Petals of Different Development Stages 1565
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
蛋白复合体。因此，AP1蛋白结构和功能的分析研
究进一步揭示了AP1基因的调控机制，也为今后进
行蛋白位点修饰、寻找功能区域内的重要变异位点
以及基因定点编辑技术提供参考和依据。
鉴于 AP1基因与花器官发育调控存在一定的
关系，有关学者对其时空表达谱进行了大量研究，
发现AP1基因在日本晚樱(Prunus serrulata)、广玉兰
(Magnolia grandiflora)、桃(Amygdalus persica)、牡丹
等植物不同发育时期的花瓣中均呈现一定的差异
性表达 (刘志雄等, 2010; Chi et al., 2011; 任磊,
2011)：AP1基因在日本晚樱的不同发育时期的花器
官中表达水平无显著差异(刘志雄等, 2010)；AP1基
因在广玉兰的心皮中表达水平最高，而在雄蕊和花
被中表达水平较低(Chi et al., 2011)；AP1基因在牡
丹不同发育时期花器官中均有表达，其中花瓣和心
皮表达最高(任磊, 2011)。本研究利用芍药花色嵌
合体品种金辉，分别分析花蕾期、初开期、盛开期和
衰败期等 4个不同发育时期内外花瓣中的 AP1基
因表达水平，结果发现，衰败期内外花瓣的表达水
平差异极显著，其他时期也存在一定的表达差异。
以上研究结果表明，AP1基因表达水平可能与芍药
器官发育形成有关，今后需要进一步在其他芍药品
种中进行系统地验证与分析，为揭示芍药花器官形
成的分子机理提供重要的理论支持。
4 结论
本研究通过RACE技术首次成功克隆出芍药
AP1基因(GenBank登录号: KC354376)全长序列 1
236 bp，编码242个氨基酸，该蛋白为亲水性非分泌
蛋白，无跨膜结构和信号肽；存在 2个糖基化位点
和13个潜在的磷酸化位点，其二级结构以α螺旋和
无规则卷曲为主，同时AP1蛋白包含MADS和K-
box2个超级家族保守结构域；AP1基因在芍药4个
不同发育阶段(花蕾期, 初开期, 盛开期和衰败期)
的内外花瓣中的表达水平均存在差异表达，在衰败
期内外花瓣中表达水平差异极显著，进一步表明
AP1基因表达水平可能与芍药花器官发育有关。
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(责任编辑 马丽萍)
芍药花分生组织决定基因(AP1)基因克隆、序列分析及其在不同发育时期花瓣中的表达变化规律
cDNA Cloning, Sequence Analysis and Tissue Expression of AP1 in P. lactiflora Petals of Different Development Stages 1567