全 文 ：书第 43 卷 第 11 期
2015 年 11 月
华 南 理 工 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )
Journal of South China University of Technology
(Natural Science Edition)
Vol． 43 No． 11
November 2015
收稿日期:2015-04-10
* 基金项目:广东省教育部产学研结合项目(2012B090600025)
Foundation item:Supported by the Production，Education and Ｒesearch Cooperative Project of Guangdong Province and the Ministry
of Education(2012B090600025)
作者简介:赵强忠(1976-) ，男，博士，教授，博士生导师，主要从事食品生物技术研究． E-mail:qzzhao@ scut． edu． cn
通信作者:赵谋明(1964-) ，男，博士，教授，博士生导师，主要从事食品生物技术研究． E-mail:femmzhao@ scut． edu． cn
文章编号:1000-565X(2015)11-0008-08
牛大力糖蛋白的分离、鉴定及抗氧化活性*
赵强忠 冯梦莹 林恋竹 赵谋明
(华南理工大学 轻工与食品学院，广东 广州 510640)
摘 要:为深入了解牛大力糖蛋白的结构组成、理化性质和生物活性，根据牛大力粗糖蛋
白(MSCG)的分子质量分布情况，采用超滤、凝胶柱层析(Sephadex G-75)、反相 C-18 色谱
柱层析(ODS)方法，对牛大力粗糖蛋白进行分离纯化，得到两种组分 MSCG-1 和 MSCG-2．
通过 HPLC、GC、GC-MS、红外光谱等方法对两种组分的结构进行了鉴定． 结果表明:
MSCG-1 的分子质量约为 62． 0ku，MSCG-2 的分子质量约为 1． 94ku;MSCG-1 含 50． 22%的
蛋白质和 38． 07% 的糖，糖链主要由→4，6)-Galp-(1→和 Araf-(1→构成;MSCG-2 含
69． 37%的蛋白质和 6． 70%的糖，糖链由→6)-Glcp-(1→构成主链，糖链分支度高;MSCG-1
和 MSCG-2中都含有 O-糖肽键． MSCG-2 中含有的可能对抗氧化有贡献的氨基酸总量比
MSCG-1中的高 31． 3%;MSCG-1 和 MSCG-2 的氧自由基吸收能力分别为(56． 10 ± 18． 49)
和(1077． 19 ± 60． 82)μmol /g;MSCG-2 的抗氧化活性明显高于 MSCG 和 MSCG-1，说明糖
蛋白的分子组成、分子质量大小及结构特性决定了其抗氧化活性．
关键词:牛大力;糖蛋白;分离;纯化;结构鉴定;抗氧化剂
中图分类号:Q513 + ． 2 doi:10． 3969 / j． issn． 1000-565X． 2015． 11． 002
牛大力(Millettia Speciosa Champ．)为蝶形花科
鸡血藤属，其干燥根可入药，性味甘、平，具有补虚润
肺、强筋活络等功用，药用历史悠久，临床上证明其
对多种慢性疾病(如腰痛、肾虚带下、风湿性关节
炎、腰肌劳损、慢性肝炎、病后体虚等)有治疗作
用［1］．近年来的研究表明，牛大力具有提高免疫、抗
氧化、祛痰、镇咳、平喘及保肝作用［2］．
目前对牛大力的研究主要集中在种植、培养等
方面，对其含有的有效成分的结构、活性研究则较
少．对牛大力水提物的研究主要包括牛大力多糖的
提取、部分活性探讨及初步的结构鉴定，对牛大力醇
提物的研究则主要集中在结构鉴定方面．
糖蛋白具有广泛的生物活性和复杂的结构，目
前尚未见有关牛大力糖蛋白的研究报道． 文中重点
研究牛大力糖蛋白的分离纯化方法，进一步对其结
构进行了鉴定，并初步探讨了其抗氧化活性，以期为
牛大力资源的开发和综合利用提供理论依据．
1 实验
1． 1 原料与试剂
以海南野生牛大力块根为原料．
主要试剂如下:水溶性维生素 E(Trolox)、2，2-
偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(AAPH)、荧光黄
(Fluorescein)、各单糖标准品、肌醇，购于美国 Sig-
ma-Aldrich公司;Sephadex G-75 凝胶、十八烷基硅胶
(ODS) ，购于 GE Healthcare Life Science 公司;三氟
第 11 期 赵强忠 等:牛大力糖蛋白的分离、鉴定及抗氧化活性 9
乙酸、冰乙酸、盐酸、氢氧化钠、苯酚、三氯甲烷、正丁
醇、无水乙醇、盐酸羟胺、吡啶、二氯甲烷、醋酸酐、二
甲基亚砜、碘甲烷、硼氢化钠、无水硫酸钠，均为分析
纯;甲醇，色谱纯．
1． 2 实验方法
1． 2． 1 牛大力粗糖蛋白的制备工艺
牛大力块根干燥后，切片粉碎，过 60 目筛．粉末
按照 1∶ 6 的料液比(质量(g)与体积(mL)的比例)
加入 95%乙醇微沸回流提取 3 h 以脱脂、脱色．趁热
过滤，留下残渣，置烘箱中于 50 ℃干燥并除去残留
乙醇．经脱脂脱色后的牛大力块根粉末用超声辅助
热水提取糖蛋白，条件如下:超声时间 30 min，料液
比 1∶ 20，超声功率 800W，提取温度 55℃ ．经抽滤得
到牛大力提取液，提取液经 50℃减压浓缩至一定体
积后，用 Sevage 法除去游离蛋白质． 将除去游离蛋
白后的提取液加入 4 倍体积的无水乙醇，冷藏静置
后得到沉淀，离心除去上清液，经冷冻干燥得到淡黄
色粗糖蛋白粉末，命名为 MSCG．
1． 2． 2 牛大力糖蛋白的分离纯化工艺
使用截留分子质量为 10 ku 的超滤膜分离
MSCG，得到截留液与透过液．截留液经 Sephadex G-
75 凝胶柱层析分离，将去离子水洗脱的第一个峰命
名为 MSCG-1;透过液经反相 C-18 色谱柱层析
(ODS)分离，将 10%乙醇洗脱组分命名为 MSCG-2．
1． 2． 3 纯度鉴定
参考文献［3］方法，通过十二烷基磺酸钠 －聚
丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对牛大力糖蛋白
进行纯度检验．其中分离胶和浓缩胶的含量分别为
150 和 50 g /L，采用考马斯亮蓝染色．
1． 2． 4 分子质量测定
采用高效液相色谱(HPLC)法测定分子质量．色
谱柱为 TSK-G2000SWXL，检测器为示差检测器，流动
相为加 1‰ TFA的磷酸盐缓冲液(20 mmol /L) ，进样
量为 10μL，流速为 1mL /min．以蛋白标准品分子质量
对数(lgM)及保留时间(t)做标准曲线，如图 1所示．
1． 2． 5 基本成分测定
蛋白含量测定参照 GB 5009． 5—2003［4］，采用
凯氏定氮法． 总糖含量测定采用苯酚 －硫酸法［5］，
以葡萄糖为标准品．
1． 2． 6 氨基酸分析
采用 A300 自动氨基酸分析仪测定样品氨基酸
组成［6］． 样品经 6 mol /L 盐酸在 110 ℃ 下水解后
用 HPLC进行分析． 测定条件为:membraPureT259
钠离子交换柱，反应器温度为 115℃，流动相速度为
图 1 HPLC测定分子质量的标准曲线
Fig． 1 Calibration curve of molecular mass by HPLC
160μL /min，茚三酮溶液流速为 80 μL /min，进样体
积为 20μL;采用双可见光光度计检测器，在 570 和
440 nm处进行检测．
1． 2． 7 单糖组成分析
参照 Guerrant等［7］报道的糖腈乙酸酯衍生物气
相色谱法，并稍作修改，来分析单糖组成． 取 50 mg
样品加入 10mL 4mol /L的三氟乙酸中，110℃下水解
2 h后用甲醇洗涤 3 次，减压浓缩干燥．再加入 10 mg
盐酸羟胺、1mg肌醇和 2mL吡啶，90℃下反应 30min
后继续加入 2mL醋酸酐，90℃下反应 30min，最后加
入 2mL蒸馏水终止反应．用二氯甲烷萃取反应液，取
二氯甲烷相，加入无水硫酸钠除水，用 0． 22μm微孔
滤膜过滤后使用 7890A 气相色谱仪检测．测定条件
为:HP-5石英毛细管柱(30m × 0． 32 mm × 0． 25μm) ;
采用 20 PSI恒压模式;进样口采用不分流模式，温度
为 250℃;氢气、空气和氮气流速分别为 30、400 和
25mL /min;进样体积为 1μL．
1． 2． 8 糖苷键连接方式分析
糖苷键的分析参照 Dong 等［8］的方法并稍作修
改．取 50mg 样品，加入 5 mL 二甲基亚砜(DMSO)超
声处理 30 min． 继续加入 200 mg NaOH，超声处理
30min．加入 3mL碘甲烷，避光反应 12 h．反应结束后
用氯仿萃取甲基化反应液，取氯仿相，减压浓缩至干．
加入5mL 4mol /L的三氟乙酸，110℃下水解2h后，用
甲醇洗涤 3 次，旋干．向水解物中加入 4 mL 蒸馏水，
用 NaOH调节 pH至 10 ～12．加入 20mg硼氢化钠，室
温下反应 8 ～ 12 h．反应结束后用乙酸调节 pH 至中
性，减压浓缩至干，再用甲醇洗涤 3 次．加入 2 mL 吡
啶和2mL醋酸酐，90℃下反应30min后，加入2mL蒸
馏水终止反应．用二氯甲烷萃取反应液，取二氯甲烷
相，加入无水硫酸钠除水，用 0． 22μm微孔滤膜过滤
后，使用 Trace DSQ-Ⅱ气相色谱–质谱联用仪检测．测
定条件如下:TＲ-5MS 30 m × 0． 25 mm × 0． 25μm 规格
10 华 南 理 工 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 第 43 卷
的弹性毛细管柱;进样口温度为 250℃;载气为氦气，流
量为 1mL/min，分流比为 10 ∶ 1．质谱条件如下:传输线
温度为 280℃;离子源温度为250℃;电子能量为70eV;
质量扫描范围m/z为 30 ～650;进样体积为 1μL．
1． 2． 9 糖肽键分析
通过 β-消去反应测定牛大力糖蛋白中的 O-糖
肽键［9］．称取 1． 5 mg 样品溶解于 0． 2 mol /L 氢氧化
钠溶液中，另取 1． 5 mg样品溶解于蒸馏水中作为对
照，在 45℃水浴锅中反应 30min．用全波长扫描仪测
定样品在 220 ～ 300 nm波段的吸收值．
1． 2． 10 红外光谱分析
红外光谱分析参照 Kumar 等［10］的溴化钾压片
法．将 2 ～ 4 mg 冷冻干燥后的糖蛋白样品与适量溴
化钾混匀、研磨，将粉末装入压片机压成薄片． 薄片
用红外光谱仪扫描，扫描波长为 400 ～ 4000 cm －1 ．
1． 2． 11 氧自由基吸收能力(OＲAC)测定
OＲAC测定参考文献［11］的方法并作适当修
改．在 96 孔板各微孔中分别加入 20μL 0． 05 mg /mL
的糖蛋白样品、20μL pH =7． 4 的磷酸盐缓冲溶液和
20μL 7nmol /L的荧光素溶液，在 37℃下孵育 15min
后，再用多道移液器迅速在各孔中加入 140 μL
12mmol /L的 AAPH启动反应，维持温度为 37 ℃，于
酶标仪中反应 2 h，每 2min测定一次荧光强度．荧光
测定的激发波长为 485 nm，发射波长为 538 nm．
2 结果与讨论
2． 1 牛大力糖蛋白的分离纯化结果
2． 1． 1 牛大力粗糖蛋白的超滤分离结果
由图 2 所示的 HPLC图谱可以看出，牛大力粗
图 2 MSCG及其超滤液的 HPLC图谱
Fig． 2 HPLC profiles of MSCG and its ultrafiltrate
糖蛋白 MSCG主要由两部分组成，分别是分子质量
大于 10 ku的组分和分子质量为 1 ～ 3 ku 的组分．由
于两组分的分子质量差异较大，因此选用超滤法进
行第一步的分离纯化工作．经超滤分离后，透过液部
分均为分子质量在 1 ～ 3ku之间的组分;而截留液保
留了全部的分子质量大于 10 ku 的组分，但有少量
1～ 3 ku的组分残留．因此，超滤法对牛大力粗糖蛋白
的初步分离起到了较好的效果．
2． 1． 2 截留液的凝胶柱层析分离纯化结果
由超滤实验结果可知，牛大力糖蛋白截留液仍
含有一些小分子物质，需进一步纯化除去．经填料筛
选后，采用 Sephadex G-75 进行柱层析，洗脱液为去
离子水．由洗脱曲线(如图 3 所示)可知，蛋白峰与
糖峰基本重合，推测样品是蛋白质与糖的结合物．第
一个峰为分子质量大于 10ku的糖蛋白，峰的对称性
较好，说明物质较为均一． 收集此峰，减压浓缩后冷
冻干燥，命名为 MSCG-1．
图 3 截留液的 Sephadex G-75 洗脱曲线
Fig． 3 Elution curves of the trapped fluid on Sephadex G-75
column
2． 1． 3 透过液的反相色谱柱层析分离纯化结果
牛大力糖蛋白透过液用 ODS 柱层析，分别用
2%、5%、10%、15%、20%、25%、50%乙醇洗脱，收
集洗脱液． 其中 10%乙醇洗脱组分在 HPLC 检测
(检测条件见 1． 2． 4 节)中呈单一对称峰，说明组分
较纯，故命名为 MSCG-2，供后续研究．
2． 2 糖蛋白纯度鉴定与分子质量测定结果
2． 2． 1 电泳结果分析
图 4 为 MSCG以及纯化后的牛大力糖蛋白组分
MSCG-1、MSCG-2 的电泳条带图． 可以看出，MSCG
成分较杂，主要集中在凝胶中上部和凝胶下部，说明
其中既含有分子质量较大的物质，又含有分子质量
较小的物质． MSCG-1 在凝胶中部形成一个明显的
条带，在其余部分基本不显色，说明组分较纯．
MSCG-2 在凝胶下部形成一个明显的条带，说明
第 11 期 赵强忠 等:牛大力糖蛋白的分离、鉴定及抗氧化活性 11
MSCG-2 富集了 MSCG 中小分子的糖蛋白，组分也
比较纯．电泳结果表明，所采用的分离纯化方法能较
好地纯化牛大力糖蛋白．
图 4 MSCG、MSCG-1 和 MSCG-2 的 SDS-PAGE图谱
Fig． 4 SDS-PAGE pattern of MSCG，MSCG-1 and MSCG-2
A—MSCG;B—MSCG-1;C—MSCG-2
2． 2． 2 分子质量测定结果
采用高效液相色谱法分析 MSCG-1 和 MSCG-2
的分子质量．以蛋白标准品分子质量及保留时间做
标准曲线，将样品的出峰时间代入标准曲线即可得
到样品的分子质量． 计算得到 MSCG-1 的分子质量
约为 62． 0 ku，MSCG-2 的分子质量约为 1． 94 ku． 由
图 5 所示牛大力纯化糖蛋白的分子质量分布图可以
看出，MSCG-1 与 MSCG-2 都是较为对称的单峰． 此
结果与电泳结果一致，表明牛大力粗糖蛋白经纯化
后得到的两种组分都是成分较为均一的物质．
图 5 MSCG-1 和 MSCG-2 的分子质量分布
Fig． 5 Molecular mass distribution of MSCG-1 and MSCG-2
2． 3 基本成分分析
表 1 列出了 MSCG、MSCG-1 和 MSCG-2 的蛋白
与总糖含量．分析表中结果可知:MSCG-1 是一种糖
含量相对较高的糖蛋白，蛋白含量为 50． 22%，总糖
含量为 38． 07%，二者之比为 1． 32∶ 1;而 MSCG-2 中
的主要成分是蛋白质，含量为 69． 37%，总糖含量为
6． 70%，二者之比为 10． 35 ∶ 1． 可见，这两种纯化糖
蛋白除分子质量差异较大外，成分差异也较大．
表 1 MSCG、MSCG-1 和 MSCG-2 的蛋白与总糖含量
Table 1 Protein and carbohydrate contents of MSCG，MSCG-1
and MSCG-2
组分
含量 /%
MSCG MSCG-1 MSCG-2
蛋白质 51． 10 ± 1． 53 50． 22 ± 1． 82 69． 37 ± 1． 55
总糖 15． 58 ± 0． 53 38． 07 ± 0． 80 6． 70 ± 0． 74
2． 4 氨基酸组成分析
采用氨基酸分析仪对各样品中的氨基酸组成进
行分析，结果如表 2 所示． 可以看出，MSCG-1 与
MSCG-2 的氨基酸组成差异很大． MSCG-1 中天冬氨
酸含量最高，占氨基酸总量的 12． 9%，其次是谷氨
酸、丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸和苏氨酸，在总
氨基酸中的占比均在 7%～9%之间． MSCG-2 中含量
最高的氨基酸是脯氨酸，其在总氨基酸中的占比高
达 26． 1%，其次是半胱氨酸，占比为 20． 7%，这两种
氨基酸几乎占总氨基酸的 50% ．
表 2 MSCG、MSCG-1 和 MSCG-2 的氨基酸组成
Table 2 Amino acid composition of MSCG，MSCG-1 and
MSCG-2
氨基酸名称
氨基酸含量 /(mg·g － 1)
MSCG MSCG-1 MSCG-2
酪氨酸 21． 3 26． 0 31． 6
苯丙氨酸 17． 6 37． 2 3． 2
组氨酸 17． 3 16． 9 9． 4
半胱氨酸 102． 0 — 155． 0
丙氨酸 48． 8 37． 5 86． 8
缬氨酸 17． 7 46． 0 1． 1
亮氨酸 30． 1 52． 6 28． 2
天冬氨酸 70． 6 75． 4 22． 8
谷氨酸 64． 4 54． 0 116． 0
赖氨酸 16． 3 24． 7 1． 6
精氨酸 16． 3 17． 6 35． 4
脯氨酸 103． 2 47． 9 195． 0
苏氨酸 19． 1 44． 8 13． 9
丝氨酸 39． 6 53． 8 46． 5
甘氨酸 8． 3 24． 8 —
异亮氨酸 15． 5 25． 1 0． 7
总氨基酸 608． 1 584． 3 747． 1
抗氧化氨基酸 158． 2 80． 1 199． 2
疏水性氨基酸 96． 6 136． 1 116． 1
酸性氨基酸 135． 0 129． 4 138． 8
可能对抗氧化有贡献的氨基酸 389． 8 345． 6 454． 1
12 华 南 理 工 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 第 43 卷
研究表明，肽链中氨基酸的种类与连接方式直
接决定肽的生物活性．对于抗氧化活性肽来说，氨基
酸组成极大地影响其抗氧化活性． 不同的氨基酸抗
氧化机理也不相同，有些氨基酸本身就具有抗氧化
活性，可充当亲核试剂或螯合金属离子，如组氨酸、
半胱氨酸、酪氨酸等［12］;有些氨基酸具有疏水性，其
分子结构与表面活性剂类似，在水溶性和油溶性体
系中起抗氧化作用，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸［13］;
酸性氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)也有抗氧化活
性，这可能与其侧链羧基螯合金属离子有关［14］． 由
表 2 分析可知，MSCG-2 中含有的可能对抗氧化有
贡献的氨基酸总量比 MSCG-1 中高 31． 3%，尤其是
其中的抗氧化氨基酸含量约为 MSCG-1 的 2． 5 倍．
2． 5 单糖组成分析
采用气相色谱法测定各糖蛋白样品的单糖组
成，结果列于表 3． 由表 3 可知，MSCG-1 和 MSCG-2
中均含有自然界中常见的 7 种单糖． 但是岩藻糖在
MSCG中未被检测到，在 MSCG-1 和 MSCG-2 中的含
量(以摩尔分数表示，下同)也很低，均不到 2% ． 分
析其原因，有可能是在分离纯化过程中，MSCG 中的
岩藻糖被富集，因而在纯化糖蛋白中被检出． 显然，
MSCG-1 和 MSCG-2 的单糖组成差异很大． MSCG-1
中阿拉伯糖含量最高，达到 41． 13%，其次是半乳
糖，为 34． 77%，其余单糖含量均不高，鼠李糖、阿拉
伯糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的摩尔
比为 1． 27 ∶ 25． 55 ∶ 1． 16 ∶ 1． 00 ∶ 4． 12 ∶ 7． 42 ∶ 21． 60;
MSCG-2 则主要由葡萄糖构成，含量高达 75． 84%，
其余单糖含量均低于 10%，鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻
糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的摩尔比为
1． 84∶ 5． 35∶ 1． 17∶ 1． 00∶ 3． 13∶ 48． 62∶ 3． 00．
郑元升［15］和陈蓉蓉等［16］对牛大力多糖的单糖
组成进行了检测，发现牛大力多糖主要由葡萄糖和
表 3 MSCG、MSCG-1 和 MSCG-2 的单糖组成分析
Table 3 Monosaccharide composition of MSCG，MSCG-1 and
MSCG-2
标准单糖
摩尔分数 /%
MSCG MSCG-1 MSCG-2
鼠李糖 12． 67 2． 05 2． 87
阿拉伯糖 13． 58 41． 13 8． 34
岩藻糖 — 1． 86 1． 83
木糖 1． 35 1． 61 1． 56
甘露糖 8． 76 6． 64 4． 88
葡萄糖 56． 88 11． 94 75． 84
半乳糖 6． 77 34． 77 4． 68
果糖组成，并含有少量的半乳糖、甘露糖和鼠李糖．
文中并未从牛大力糖蛋白中检测到果糖，但是检测
到了阿拉伯糖、岩藻糖和木糖，可能是因为牛大力糖
蛋白中的单糖组成与牛大力多糖的单糖组成存在差
异．
2． 6 糖苷键连接方式分析
由表 4 结果可知，MSCG-1 中主要糖苷键类型
是→4，6)-Galp-(1→和 Araf-(1→，主要的结构单元
是 Galp(占 42． 4%)和 Araf(占 31． 3%)残基． 1→4，6
连接的半乳糖占比高达 33． 9%，说明 MSCG-1 可能
是以半乳糖为主链，并且支链较多．末端残基阿拉伯
糖含量高达 25． 2%，说明支链可能主要由阿拉伯糖
构成．此外，葡萄糖和甘露糖残基含量也较高． 综上
所述，MSCG-1 中的糖链由 1→4，6 连接的半乳糖构
成主要骨架，大量阿拉伯糖分布在支链中，并含有一
定比例的→6)-Manp-(1→和→6)-Glcp-(1→．
表 4 MSCG-1 和 MSCG-2 的甲基化分析
Table 4 Methylation analysis of MSCG-1 and MSCG-2
保留时间 /min 糖苷键类型
摩尔分数 /%
MSCG-1 MSCG-2
5． 22 Araf-(1→ 25． 2 11． 5
5． 66 Glcp-(1→ 2． 3 10． 6
5． 72 →5)-Araf-(1→ 6． 1 3． 5
7． 08 →6)-Manp-(1→ 11． 3 8． 4
7． 65 →6)-Glcp-(1→ 12． 7 24． 8
8． 73 →4，6)-Glcp-(1→ — 16． 2
8． 92 →4，6)-Galp-(1→ 33． 9 7． 0
9． 15 →3，6)-Glcp-(2→ — 9． 7
9． 50 →3，6)-Galp-(1→ 8． 5 —
9． 78 →2，3，6)-Glcp-(1→ — 8． 3
不同于 MSCG-1，MSCG-2 中最主要的结构单元
是 Glcp残基，总含量高达 69． 6%，远高于其他结构
单元．主要的糖苷键类型为→6)-Glcp-(1→和→4，
6)-Glcp-(1→．葡萄糖连接方式多样，并且从键型来
看，糖链分支度很高． 综合分析，MSCG-2 中的糖链
很有可能是由 1→6 连接的葡萄糖构成主链，分支度
高，且含有一定的 Araf、Manp与 Galp结构单元．
2． 7 糖肽键分析
当糖链以 O-糖肽键的形式与丝氨酸和苏氨酸
结合时，经稀碱处理(β-消去反应)后，糖肽键发生解
离，解离后的丝氨酸和苏氨酸会形成 α-氨基丙烯酸和
α-氨基丁烯酸，这两种氨基酸在紫外 240 nm 处有特
征吸收．因此测定样品在稀碱处理前后 240 nm 处吸
收的变化就可判断该样品中是否含有 O-糖肽键．
第 11 期 赵强忠 等:牛大力糖蛋白的分离、鉴定及抗氧化活性 13
图 6 为 MSCG、MSCG-1 和 MSCG-2 稀碱处理前
后的紫外扫描光谱，碱处理后 3 个样品在 240 nm 处
都有明显的吸收，说明 3个样品中都含有 O-糖肽键．
图 6 碱处理前后的紫外扫描光谱
Fig． 6 Ultraviolet scanning spectrograms before and after alkali
treatment
2． 8 红外光谱分析
图 7显示，MSCG在 4000 ～ 400 cm －1区间有糖类
物质和蛋白类物质的特征吸收峰．其中:1643 cm －1处
是乙酰基中羰基的伸缩振动和非对称伸缩振动峰，
以及 N—H的变角振动峰，1 552 cm －1处是肽链上酰
胺基 NH2 的特征吸收峰，这两处吸收峰是蛋白类物
质的典型吸收峰;3360 cm －1处的宽峰为 O—H 的伸
缩振动峰，属于分子内氢键的吸收，2 962 cm －1处是
甲基、亚甲基等烷基 C—H的伸缩振动峰，这两处吸
收峰则是糖类物质的典型吸收峰;1412 cm －1处是甲
基、亚甲基的面内变角振动峰;1 107 cm －1附近相对
较强的吸收峰表明了吡喃型糖环的存在;881 cm －1
处较弱的吸收峰是 β-型糖苷键的特征吸收峰．
图 7 MSCG、MSCG-1 和 MSCG-2 的红外光谱
Fig． 7 IＲ spectra of MSCG，MSCG-1 and MSCG-2
MSCG-1也含有糖类和蛋白质类的特征吸收峰．
其中:1650 cm －1处是乙酰基中羰基的伸缩振动和非
对称伸缩振动峰，以及 N—H的变角振动;1538 cm －1
处是肽链上酰胺基 NH2 的特征吸收峰;3291 cm
－1处
的宽峰为 O—H的伸缩振动峰;2962 cm －1处是甲基、
亚甲基等烷基 C—H的伸缩振动峰;1408cm －1处是甲
基、亚甲基的面内变角振动峰．与 MSCG 的红外光谱
不同，MSCG-1在 1029、1079 cm －1处有两个明显而尖
锐的吸收峰，这是吡喃环的特征峰;881 cm －1处较弱的
吸收峰是 β-型糖苷键的特征吸收峰．
MSCG-2也含有糖类和蛋白质类的特征吸收峰．
其中:1650 cm －1处是乙酰基中羰基的伸缩振动和非
对称伸缩振动峰，以及 N—H的变角振动;1540 cm －1
处是肽链上酰胺基 NH2 的特征吸收峰;3352 cm
－1处
的宽峰为 O—H的伸缩振动峰;2938 cm －1处是甲基、
亚甲基等烷基 C—H的伸缩振动峰;1407cm －1处是甲
基、亚甲基的面内变角振动峰;1107 cm －1附近相对较
强的吸收峰表明了吡喃型糖环的存在． 不同的是，
MSCG-2除在 907 cm －1有 β-型糖苷键的特征吸收峰
外，在 828 cm －1处还有 α-型糖苷键的特征峰，说明
MSCG-2富集了含有 α-型糖苷键的糖链．
综上所述，MSCG、MSCG-1 和 MSCG-2 的红外光
谱都表现出糖类和蛋白质类的特征吸收，三者的官
能团种类基本类似，但是含量有所不同．
2． 9 氧自由基清除能力
由图 8 可知，经分离纯化后得到的两个牛大力
纯化糖蛋白 MSCG-1 和 MSCG-2 的 OＲAC 值(以
μmol Trolox /g计)差异很大． MSCG-2 的 OＲAC 值为
(1 077． 19 ± 60． 82) ，而 MSCG-1 的 OＲAC 值仅为
14 华 南 理 工 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 第 43 卷
(56． 10 ± 18． 49) ，前者约为后者的 19 倍． MSCG 的
OＲAC值在 MSCG-1和 MSCG-2的之间，为(364． 93 ±
21． 27)． MSCG-1 与 MSCG-2 OＲAC 值的差异可能主
要与其组成及结构的差异有关．
图 8 MSCG、MSCG-1 和 MSCG-2 的 OＲAC值
Fig． 8 OＲAC values of MSCG，MSCG-1 and MSCG-2
OＲAC值以 μmol Trolox /g计
根据前文所述，无论在肽链方面还是在糖链方
面，MSCG-1 和 MSCG-2 的结构都有明显差异．首先，
从氨基酸组成来看，MSCG-2 的抗氧化氨基酸含量
(199． 2 mg /g)明显高于 MSCG-1(80． 1 mg /g) ，这可
能是造成 MSCG-2 抗氧化能力更高的原因之一． 其
次，MSCG-2 的分子质量(1． 94 ku)也明显小于
MSCG-1(62． 0 ku)．肽的分子质量会影响肽的活性，
同样，多糖分子质量也会影响多糖的活性． Liu 等［17］
研究了不同水解度的乳清蛋白对小鼠的抗疲劳活
性，发现分子质量低于 10 ku 的组分具有更高的抗
疲劳活性、自由基清除能力以及亚铁离子螯合能力;
Qi等［18］研究了不同分子质量的海藻多糖与抗氧化
活性的关系，发现低分子质量的多糖组分具有更高
的抗氧化活性;Kao 等［19］的研究也表明，一种低分
子质量的灵芝多糖(3． 979 ku)具有较好的抗氧化活
性． MSCG-2 具有比 MSCG-1 更低的分子质量，这可
能也是其抗氧化能力更高的原因之一．最后，MSCG-
1 与 MSCG-2 中糖链的单糖组成与糖苷键连接方式
也很不相同．上述因素可能共同导致了二者抗氧化
活性的不同．
3 结论
通过对牛大力糖蛋白分离纯化方法、结构组成
及抗氧化活性的研究，文中得到以下结论:
(1)牛大力粗糖蛋白 MSCG 经分离纯化，得到
分子质量约为 62． 0 ku 的 MSCG-1 和分子质量约为
1． 94 ku的 MSCG-2，两种组分都是比较纯的糖蛋白．
(2)MSCG-1 和 MSCG-2 的蛋白含量分别为
50． 22%和 69． 37%;MSCG-1 中天冬氨酸含量最高，
MSCG-2中脯氨酸含量最高;MSCG-2中含有的可能对
抗氧化有贡献的氨基酸总量比MSCG-1中高 31． 3%．
(3)MSCG-1 和 MSCG-2 的总糖含量分别为
38． 07%和 6． 70%;MSCG-1 和 MSCG-2 中均含有鼠
李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半
乳糖，MSCG-1 中上述 7 种单糖的摩尔比为
1． 27 ∶ 25． 55∶ 1． 16∶ 1． 00∶ 4． 12∶ 7． 42∶ 21． 60，而MSCG-2
中为 1． 84 ∶ 5． 35 ∶ 1． 17 ∶ 1． 00 ∶ 3． 13 ∶ 48． 62 ∶ 3． 00;MSCG-1
中的糖链由 1→4，6 连接的半乳糖构成主要骨架，大
量阿拉伯糖分布在支链中，并含有一定比例的→6)-
Manp-(1→和→6)-Glcp-(1→;MSCG-2 中的糖链很
有可能是由 1→6 连接的葡萄糖构成主链，分支度
高，且含有一定的 Araf、Manp 与 Galp 结构单元;
MSCG-1 和 MSCG-2 中都存在吡喃环，并且都存在 β-
型糖苷键，另外，MSCG-2 中还发现了 α-型糖苷键．
(4)MSCG-1 和 MSCG-2 中都含有 O-糖肽键．
(5)MSCG-2 的 OＲAC 值显著高于 MSCG-1，前
者为 1077． 19 ± 60． 82，后者仅位 56． 10 ± 18． 49，说
明糖蛋白的组成及结构特性对于其抗氧化活性有重
要的影响．
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Separation，Identification and Antioxidant Activity of Glycoproteins
from Millettia Speciosa Champ．
Zhao Qiang-zhong Feng Meng-ying Lin Lian-zhu Zhao Mou-ming
(School of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China)
Abstract:In order to understand well the structural characteristics，physical and chemical properties and biologi-
cal activities of glycoprotein from Millettia Speciosa Champ． (MSCG) ，MSCG was purified by means of ultrafiltra-
tion，chromatography Sephadex G-75 and ODS according to its molecular mass distribution，and thus two purified
fractions MSCG-1 and MSCG-2 were obtained． Then，the structures of the two fractions were identified by means
of HPLC，GC，GC-MS and FT-IＲ． The results show that (1)the molecular masses of MSCG-1 and MSCG-2 are
62. 00 ku and 1. 94 ku respectively; (2)MSCG-1 contains 50. 22% protein and 38. 07% sugar，and it is mainly
composed of →4，6)-Galp-(1→ and Araf-(1→; (3)MSCG-2 contains 69. 37% protein and 6. 70% sugar，and
its main chain is composed of →6)-Glcp-(1→ and has a high branch degree; (4)MSCG-1 and MSCG-2 both con-
tain O-link bonds; (5)for the amino acid which may be of antioxidant activities，its content in MSCG-2 is 31. 3%
higher than that in MSCG-1; (6)the oxygen radical absorbance capacities (OＲAC)of MSCG-1 and MSCG-2 are
(56. 10 ± 18. 49)and (1 077. 19 ± 60. 82)μmol /g;and (7)the antioxidant activity of MSCG-2 is significantly
higher than those of MSCG and MSCG-1，which means that the molecular composition，molecular mass and struc-
tural characteristics of glycoprotein determine their antioxidant activities．
Key words:Millettia Speciosa Champ．;glycoprotein;separation;purification;structure identification;antioxidants