全 文 ：·基础实验研究· 中国现代医生 2014 年 8 月第 52 卷第 23 期
CHINA MODERN DOCTOR Vol. 52 No. 23 August 2014
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤, 发病率在女性
恶性肿瘤中居第二位[1]。 目前临床治疗使用的化疗药
物多有较强的毒副作用和耐药性问题，从传统中药中
寻找高效、低毒的抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物新药
开发的热门课题[2]。 三叶青是我国浙江、江西、广西等
少部分地区独有的珍稀中药品种[3]，可用于治疗肝炎、
风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病,也是抗肿
瘤常用药物[4,5]。有研究发现三叶青总黄酮能显著地抑
制肝癌、肺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞的生长，且细胞
有明显的凋亡特征性改变[6-9]。本研究主要探讨三叶青
提取物对宫颈癌 Hela细胞的体外细胞毒作用,为其临
床应用于宫颈癌治疗提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 仪器及试剂
MTT 购于 Sigma 公司；RPMI-1640 培养液、胰蛋
白酶、胎牛血清购于 Gibco 公司；HF/60W 二氧化碳培
养箱， 由香港 Hecnforce 公司生产；OLYMPUS（IX50-
S8F2）倒置显微镜 ，酶标仪 （型号 XMARK）由美国
BIO-RAD生产。
1.2 三叶青提取物制备
三叶青药材购自宁波鄞州医药药材公司，称取三
叶青药材 1000 g，采用碱性稀醇浸提，酸化沉淀法[9]得
三叶青提取物 6.9 g。
1.3细胞株及细胞培养
人宫颈癌Hela细胞株购自上海中科院细胞生化所，
接种于含 10%胎牛血清、青霉素、链霉素各 100 mg/L
的 RPMI1640 培养基中， 置于 37℃饱和湿度， 含5%
三叶青提取物诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的研究
李 萍 1 彭 昕 2
1.宁波市鄞州人民医院病理科，浙江宁波 315000； 2.浙江医药高等专科学校，浙江宁波 315100
[摘要] 目的 探讨三叶青提取物对体外培养的人宫颈癌 Hela 细胞诱导凋亡的作用。 方法 四氮噻唑蓝 （MTT）法
检测三叶青提取物对 Hela 细胞的抑制增殖作用及其时效、量效关系；倒置显微镜下观察细胞形态学变化。 结果
随着三叶青提取物浓度升高，作用时间的延长，其对 Hela 细胞的增殖抑制率逐渐增强，与对照组比较有明显差
异（P<0.05），Hela细胞形态出现明显的凋亡特征性改变。 结论 三叶青提取物对人宫颈癌 Hela 细胞具有明显的
体外细胞毒作用，其毒性作用与药物的浓度和作用时间呈明显正相关。
[关键词] 三叶青；Hela细胞；诱导凋亡；MTT法
[中图分类号] R73-36; R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）23-0004-03
Investigation on apoptosis of human cervical cancer Hela cells induced by
extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et gilg
LI Ping1 PENG Xin2
1.Department of Pathology,Yinzhou People′ s Hospital of Ningbo City, Ningbo 315000, China; 2.Zhejiang
Pharmaceutical College, Ningbo 315100, China
[Abstract] Objective To study the effect of extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et gilg on the proliferation of
human cervical cancer Hela cells. Methods MTT assay was used to determine the inhibitory rate of the extracts from
tetrastigma hemsleyanum diels et gilg on the proliferation of HeLa cells. The morphology of cell apoptosis was observed
by inverted microscope. Results The inhibition ratio of tumor cell was gradually increased with the longer extension
time or the increase of dosages of the extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et gilg the treatment groups was
significant differentce（P<0.05） compared with the control group. Under inverted microscope, the tumor cells showed a
special phenomenon of cellular apoptosis. Conclusion The extracts of tetrastigma hemsleyanum diels et gilg has a
significant toxicological effect on human cervical cancer Hela cells, which positively relates with its concentration and
effect time.
[Key words] Tetrastigma hemsleyanum diels et gilg; Hela cells; Apoptosis-inducing; MTT assay
[基金项目]浙江省中医药科技计划 A类资助课题（2013ZA119）
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中国现代医生 2014 年 8 月第 52 卷第 23 期
CHINA MODERN DOCTOR Vol. 52 No. 23 August 2014
·基础实验研究·
CO2的细胞培养箱培养， 当 Hela细胞长满瓶壁80%以
上时，加入 0.25%的胰蛋白酶消化，制成 1×105/mL 细
胞悬液。
1.4实验分组及药物处理
实验分为加药组和对照组（不含药物，加等体积
培养液），加药组每孔加入不同浓度的三叶青提取物，
终浓度分别为 1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL、
16 mg/mL，每组 5个复孔。
1.5 四氮噻唑蓝（MTT）比色法
根据参考文献 [10,11] 方法取对数生长期 Hela 细
胞，接种于 96 孔板，每孔加入 100 μL 细胞悬液，培
养过夜，待细胞贴壁后，加入各浓度的药液 100 μL。
对照组加 100 μL 的培养液， 培养 24 h 或 48 h 后，
弃上清液，在各孔中加入向每孔加入 MTT储液 50 μL
（5 mg/mL），震荡混匀后，继续培养 4 h 小心吸除各孔
培养液，每孔加入 DMSO 200 μL，振荡器上震荡溶解
10 min，空白调零，用酶标仪测波长 570 nm 处各孔吸
光度，按公式细胞增殖抑制率（IR）=（1-A 加药组的平
均值/A对照组的平均值）×100%计算出细胞增殖抑制
率。
1.6光学显微镜下形态学观察
取处于对数生长期的 Hela 细胞，5 个不同浓度药
物（同 MTT）分别处理，并设不加药物只加等量培养液
的为对照组细胞，分别于倒置显微镜下观察细胞并照
相，比较加药组和对照组 Hela细胞的形态变化。
1.7统计学处理
采用 SPSS 13.0统计软件进行统计学处理， 试验
数据以均数±标准差（x±s）表示，组间及组内比较采用
方差分析（F检验），P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1细胞增殖抑制率结果及方差分析
由表 1 可见随着三叶青提取物浓度的增大，处
理时间的延长，Hela 细胞 OD 值逐渐减少， 表明其对
Hela细胞生长的抑制作用随着浓度的增大，处理时间
的增加而加强。 与对照组比较，除了 1mg/mL 药物处
理 24 h组外，其他各药物处理组的 OD值均显著低于
对照组（P<0.05）。 表明三叶青提取物浓度本实验所采
用的浓度范围之内对 Hela 细胞的抑制作用有明显的
剂量及时间依赖。经不同浓度三叶青提取物作用后的
各组 Hela 细胞， 细胞增殖抑制率结果及方差分析结
果如表 2、3所示。
表 2 24 h 细胞增殖抑制率方差分析
表 3 48 h 细胞增殖抑制率方差分析
2.2形态学观察
取对照组细胞及加药组细胞， 倒置显微镜下观
察，可见加药组与对照组相比，出现了非常典型的细
胞凋亡特征 [12]：细胞质致密浓集，体积缩小，细胞核固
缩、有些发生碎裂，并有碎片的凋亡小体形成，且随着
药物浓度提高，凋亡特征性改变越为明显，见图 1～4。
图 1 对照组 Hela 细胞，贴壁生长，呈多角形或梭形，胞质饱满，轮廓
清晰
组间
组内
总计
1.288
0.016
1.304
5
24
29
0.258
0.001
378.531 0.000
差异来源 离差平方和 自由度 均方 F 值 P 值
组间
组内
总
1.009
0.040
1.049
5
24
29
0.202
0.002
120.436 0.000
差异来源 离差平方和 自由度 均方 F 值 P
对照组
加药组
0
1
2
4
8
16
0.5876±0.0241
0.5673±0.0216
0.5242±0.0212*
0.4487±0.0299*
0.3711±0.0184*
0.2873±0.0271*
3.46
10.79
23.64
36.85
51.11
0.6867±0.0142
0.6425±0.0158*
0.6012±0.0201*
0.4532±0.0262*
0.3867±0.0085*
0.2956±0.0176*
6.44
12.45
34.00
43.68
56.95
组别
浓度
（mg/mL）
24 h
OD 抑制率（%）
48 h
OD 抑制率（%）
表 1 三叶青提取物对 Hela 细胞增殖的影响（x±s，n=5）
注：*表示与对照组比较差异显著（P<0.05）
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图 2 2 mg/mL 三叶青提取物作用 48 h 的 Hela 细胞，
细胞逐渐变圆，体积缩小，并有少数从瓶壁脱落
图 3 8 mg/mL 三叶青提取物作用 48 h 的 Hela 细胞，
与低浓度处理组相比变圆的细胞数量进一步增多，体积缩小
图 4 16 mg/mL 三叶青提取物作用 48 h 的 Hela 细胞，
细胞几乎全部从瓶壁脱落，形状变圆，体积进一步缩小
3 讨论
宫颈癌是危害女性健康的生殖系统最常见的恶
性肿瘤，每年全球约有 20多万女性死于宫颈癌。目前
临床多采用以手术和放疗为主、 化疗为辅的治疗方
案，但常规放化疗对肝、肾等器官的毒副作用大，且易
产生多药耐药性，治疗效果不尽如人意 [13]。 寻找疗效
好同时毒副作用较小的天然药物有重要的临床意义。
近年来中药诱导凋亡已成为肿瘤研究领域的一个新
热点，不少学者以体外细胞株为研究对象发现中药可
通过影响细胞周期、改变细胞凋亡基因及蛋白的表达
或相关酶的活性等途径来有效抑制肿瘤细胞增殖和
诱导肿瘤细胞凋亡[14]。 三叶青为浙江省地方性传统中
药，最近因其被发现具有抗多种肿瘤的生物活性而被
广泛关注。 有报道显示[15]，三叶青提取物与肺癌 A549
细胞共培养 48 h， 其细胞活性显著性降低， 且 DNA
琼脂糖凝胶电泳呈现“梯状”条带，是细胞凋亡的一个
重要标志。汪珍等[8]观察三叶青提取物对人结肠癌RKO
细胞的影响，结果显示：三叶青提取物能显著地抑制
人结肠癌细胞系 RKO 细胞的生长， 并能下调 Bcl-
XL、上调 Bid来诱导凋亡，具有浓度依赖性。冯正权等
[16]通过体外培养人胃癌 SGC-7901 细胞，检测三叶青
黄酮对其生长的抑制作用，结果表明：三叶青黄酮能
显著抑制 SGC-7901 细胞增殖， 具有浓度依赖性，且
细胞周期分析显示有明显的凋亡峰出现，并能降低细
胞上清液中基质金属蛋白酶-2的含量。 此外，三叶青
提取物能够改善荷瘤小鼠机体的细胞免疫功能，激活
机体的抗氧化作用途径， 具有一定的体内抑瘤效果，
其高剂量干预后的抑瘤率达 36.06%[17]。
本研究通过定量（MTT）和定性（显微镜观测）的
方法， 对 5 种不同浓度的三叶青的提取物作用后的
Hela细胞凋亡特征性改变进行了研究，发现实验所采
用浓度范围内三叶青提取物均有抑制 Hela 细胞增殖
作用，且呈浓度/时间-效应正相关。 关于增殖抑制率
的评价一般认为 [1]，＜30%为不敏感（耐药），＞50%为敏
感，30%～50%为中度敏感， 由本实验检测结果可知，
8 mg/mL的三叶青提取物作用 24 h 后对 Hela 细胞的
生长即有中度敏感的抑制作用（36.85%），且随其浓度
的增加及作用时间的延长越敏感。通过光学显微镜观
察 Hela 细胞形态，可见细胞变圆、细胞核固缩、核碎
裂及凋亡小体形成等凋亡形态，随着浓度的增加该特
征越明显。 因此， 本研究结果显示三叶青提取物对
Hela细胞具有很好的肿瘤细胞毒作用，是很有潜力的
抗宫颈癌药物。但本研究中的方法仅为初步观察细胞
凋亡的指标 [18]，本课题组拟进一步通过 DNA 琼脂糖
凝胶电泳检测法定性分析凋亡细胞的 DNA 裂解，通
过流式细胞仪定量分析三叶青作用后的细胞凋亡率
及其细胞周期改变，并检测三叶青提取物作用后凋亡
相关基因表达的改变以明确其促凋亡的分子机制，为
开发研制宫颈癌治疗的新候选药物进一步提供可靠
的理论和试验依据。
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（下转第 9页）
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·基础实验研究·
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