全 文 ：D)on the concentration of cAMP in the primary cul-
tured micoglia stimulated with endotoxin． Methods
The primary cultured microglia cells from brains of
new-born rats were embedded in the 24 well plate be-
fore using． The expressions of PDE4 subtypes (A to
D)protein were assessed by Western bolt． Primary mi-
croglial cells were randomly divided into control group
(no LPS，no transfection) ，LPS group(no transfec-
tion) ，and transfection groups，including vehicle group
(transfected with LipofectaminTM ＲNAiMAX) ，mis-
match group (transfected with mismatch siＲNA) ，
PDE4-siＲNA group A to D(transfected with PDE4-
siＲNA，A to D respectively)． The duration for trans-
fection was 48 h． In each group，the mＲNA expression
of PDE4 A to D was assessed by real-time quantitative
PCＲ，and the cAMP level was determined by ELISA．
After 48h，except in the control group，cells were sim-
ulated with LPS(100 μg·L －1，30 minutes) ，and in-
tracellular cAMP levels were measured again． Ｒesults
The primary microglial cells expressed PDE4A to
PDE4D at protein level． Compared with control group，
siＲNAs inhibited mＲNA expression of PDE4A to D re-
spectively(P ＜ 0. 05)． The intracellular cAMP level
was not significantly different among the transfection
groups(P ＞ 0. 05)． LPS stimulation significantly in-
crease cAMP level in all groups，compared to control．
However， only cells treated with PDE4B-siＲNA
showed intracellular cAMP level significantly higher
than LPS group(P ＜ 0. 05)． Conclusion Among the
PDE4 subtypes，PDE4B-siＲNA can effectively inhibit
the expression of PDE4B mＲNA and increase intracel-
lular cAMP concentration after LPS stimulation．
Key words:primary microglia;phosphodiesterase 4;
neuropathic pain;ＲNAi;lipopolysaccharide;cAMP
网络出版时间:2013 － 10 － 26 15:29 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． Ｒ． 20131026． 1529． 017． html
辽东楤木叶总皂苷对结肠癌 HT-29 细胞
的生长抑制作用及机制研究
尹丽颖，李凤金，边晓燕，牛雯颖，敖 鹏，肖洪彬
(黑龙江中医药大学教学实验中心，黑龙江 哈尔滨 150040)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2013． 11． 017
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2013)11 － 1545 － 04
中国图书分类号:Ｒ － 332;Ｒ284． 1;Ｒ329． 24;Ｒ735. 350. 22;
Ｒ979. 1
摘要:目的 研究辽东楤木叶总皂苷(ETS)对 HT-29 细胞
生长的抑制作用及作用机制。方法 采用 MTT 法检测 ETS
对 HT-29 细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测 ETS对 HT-
29 细胞周期和凋亡的影响;Western blot 法检测 ETS 对 HT-
29 细胞 PLK1 蛋白表达的影响。结果 ETS对结肠癌 HT-29
收稿日期:2013 － 07 － 28，修回日期:2013 － 09 － 02
基金项目:国家自然科学基金项目(No 30772779) ;国家“十二五”重
大新药创制科技重大专项(No 2011ZX11102) ;黑龙江中
医药大学优秀创新人才支持计划项目(No 051226) ;黑龙
江中医药大学科研基金项目(No 201218)
作者简介:尹丽颖(1979 －) ，女，硕士，助理研究员，研究方向:中药
药理学，Tel:0451-82196247，E-mail:yinliying0451 @ sina．
com;
肖洪彬(1957 －) ，男，硕士，教授，研究方向:药理学，通讯
作者，Tel:0451-82196181，E-mail:hrbxiaohongbin @ 126．
com
细胞增殖有明显抑制作用，IC50值为 39. 62 mg·L
－1。在 10
～ 40 mg·L －1剂量作用下，可剂量依赖性诱导 HT-29 细胞凋
亡。ETS主要将细胞周期阻滞在 G0 /G1 期，从而可剂量依赖
性抑制肿瘤细胞增殖。ETS可明显抑制 HT-29 细胞 PLK1 蛋
白的表达。结论 ETS体外可明显抑制 HT-29 细胞的生长，
其抗肿瘤作用与细胞周期阻滞、细胞凋亡及抑制 PLK1 蛋白
表达有关。
关键词:辽东楤木;皂苷;人结肠癌 HT-29 细胞;细胞周期;细
胞凋亡;PLK1 蛋白
辽东楤木(Aralia elata Seem)为五加科楤木属
植物，其药材名为刺老鸦。《中药大辞典》谓其性味
苦、辛、平、有小毒，具有补气安神、强精滋肾、祛风活
血、除湿止痛之功效。其总皂苷(ETS)以五环三萜
皂苷类化合物为主。目前，对辽东楤木抗肿瘤作用
国内外尚未见报道。近年来课题组研究发现，ETS
对人肺腺癌 A549、人胃癌 BGC、人肝癌 BEL-7402、
人结肠癌 HT-29、人膀胱癌 EJ、人宫颈癌 HELA、人
·5451·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Nov;29(11) :1545 ～ 8
乳腺癌 MCF-7 等细胞株均有不同程度的抗肿瘤活
性。其中对人结肠癌 HT-29 细胞最为敏感，但作用
机制尚不明确。因此，本实验主要研究 ETS 对敏感
瘤株人结肠癌 HT-29 细胞生长的抑制作用，并对其
作用机制进行探讨。
1 材料
1． 1 实验药物与细胞株 辽东楤木叶总皂苷，由黑
龙江中医药大学提供，使用时先用 DMSO 溶解，取
所需量用 DMEM/F12 培养基配制用于体外细胞实
验。人结肠癌 HT-29 细胞株购自中国医学科学院
基础医学研究所基础医学细胞中心。
1． 2 主要试剂 DMEM/F12 培养基购于美国 HY-
CLONE公司;胎牛血清(FBS)购于美国 GIBCO 公
司;MTT(噻唑蓝)购于美国 Sigma 公司;细胞凋亡
Annexin V /PI、周期 PI 试剂盒购于美国 BD公司;兔
抗人 PLK 1 单抗购于美国 Cell Signaling 公司;山羊
抗兔二抗 HＲP-Goat Anti-Ｒabbit IgG(H + L)、内参
β-actin购于北京赛诺博生物技术中心。
2 方法
2． 1 ETS对人 HT-29 结肠癌细胞增殖的抑制作用
按文献［1 － 3］用 MTT 法进行实验。取对数生长期
的 HT-29 细胞，以 1 × 108·L －1的密度接种于 96 孔
培养板中，每孔 100 μl，37℃二氧化碳培养箱孵育过
夜。吸弃上清液，给药组分别加入含不同浓度 ETS
(6. 25、12. 5、25、50、100、200 mg·L －1)的 DMEM/
F12 培养基 200 μl，空白组和对照组加入等体积
DMEM/F12 培养基。继续培养 48 h 后，以 MTT 法
在波长 570 nm处测定每孔的光密度值。细胞抑制
率 /% =(1 －受试药组 OD /对照组 OD)× 100%。
2． 2 Annexin V /PI双染法［4 －6］检测 ETS对 HT-29
细胞凋亡的作用 取对数生长期的 HT-29 细胞，以
2 × 108·L －1的密度接种于 6 孔板中，给药组加入含
不同浓度 ETS(10、20、40 mg·L －1)的 DMEM/F12
培养基 2 ml，对照孔加入等体积 DMEM/F12 培养
基。48 h后分别用 0. 25%胰酶消化成单细胞悬液，
离心收集细胞，按照试剂盒说明书加入 Annexin V /
FITC 5 μl和 PI 10 μl，室温避光放置 15 min 后，用
流式细胞仪检测、分析细胞凋亡率。
2． 3 PI单染法［7 －8］检测 ETS对 HT-29 细胞周期的
影响 按测定细胞凋亡所用方法处理细胞，离心收集
细胞，PBS 洗 1 次，按照试剂盒说明书依次加入 250
μl A、200 μl B、200 μl C染色液，轻轻混匀，室温避光
染色 10 min，用 200 目尼龙网膜过滤细胞后，立即用
流式细胞仪检测，分析各组细胞周期变化。
2． 4 Western blot 法［9］检测 ETS 对 HT-29 细胞
PLK1 蛋白表达的影响 取对数生长期的 HT-29 细
胞，以 2 × 108·L －1的密度接种于 6 孔板中，过夜。
给药组加入含不同浓度 ETS(10、20、40 mg·L －1)的
DMEM/F12 培养基 2 ml，对照孔加入等体积
DMEM/F12 培养基。作用 48 h后，用含蛋白磷酸酶
抑制剂、蛋白酶抑制剂混合物的 ＲIPA 加强型裂解
缓冲液在冰浴上提取 HT-29 细胞总蛋白，每个泳道
上样蛋白量为 40 μg，12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离，转到 NC膜上，封闭奶粉室温封闭 4 h，加入兔
抗人的 PLK1 单抗(封闭奶粉 1 ∶ 1 000 稀释)。4℃
孵育过夜后 TBST洗脱 3 次，每次 10 min，再与山羊
抗兔二抗(TBST 1 ∶ 3000 稀释) ，室温孵育 1. 5 h，
TBST洗脱 3 次，每次 10 min。在 NC 膜上滴加 ECL
发光试剂，作用 5 min后，凝胶成像系统拍照。
2． 5 统计学处理 采用 SPSS 16. 0 软件进行分析
处理，实验数据以 珋x ± s 表示，各组间比较采用单因
素方差分析。
3 结果
3． 1 ETS 对 HT-29 细胞增殖的抑制作用 不同
ETS浓度下作用 48 h，对 HT-29 细胞的生长抑制率
分 别 为 14. 86%、18. 08%、26. 35%、50. 44%、
81. 88%、95. 70%，IC50值为 37. 39 mg· L
－1(Tab
1)。表明 ETS具有较强的杀伤肿瘤细胞的作用，且
具有明显的量效关系。
3． 2 ETS对 HT-29 细胞凋亡的影响 经不同浓度
ETS处理 HT-29 细胞 48 h 后，细胞总凋亡率分别为
(39. 3 ± 7. 3)%、(44. 0 ± 4. 0)%、(70. 4 ± 6. 1)%，
与空白对照组比较，差异有显著性(P ＜ 0. 01) ，且呈
现出明显的量效关系(Fig 1，Tab 2)。
Tab 1 Inhibitory effect of ETS on growth
of HT-29 cells (珋x ± s，n = 3)
Group
Concentration /
mg·L －1
OD570 Inhibitory rate /%
Control － 0． 8967 ± 0． 0129
ETS 6． 25 0． 7780 ± 0． 0030＊＊ 14． 86
12． 5 0． 7523 ± 0． 0064＊＊ 18． 08
25 0． 6863 ± 0． 0163＊＊ 26． 35
50 0． 4940 ± 0． 0078＊＊ 50． 44
100 0． 2430 ± 0． 0251＊＊ 81． 88
200 0． 1327 ± 0． 0070＊＊ 95． 70
＊＊P ＜ 0. 01 vs control
Tab 2 Apoptotic effect of ETS on HT-29 cells (珋x ± s，n = 3)
Group Concentration /mg·L －1 Apoptotic rate /%
Control － 19． 0 ± 5． 0
ETS 10 39． 3 ± 7． 3＊＊
20 44． 0 ± 4． 0＊＊
40 70． 4 ± 6． 1＊＊
＊＊P ＜ 0. 01 vs control
·6451· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Nov;29(11)
Fig 1 Apoptotic effect of ETS on HT-29 cells(珋x ± s，n = 3)
Fig 2 Effects of ETS on cell cycle of HT-29 cells (珋x ± s，n = 3)
3． 3 ETS 对 HT-29 细胞周期的影响 不同浓度
ETS处理 HT-29 细胞 48 h 后，细胞周期发生明显
改变，随药物浓度的增加，高剂量组 G0 /G1 期细胞
比率明显增高，S 期和 G2 /M 期细胞比率明显降低
(Fig 2，Tab 3)。
Tab 3 Effects of ETS on cell cycle of HT-29 cells (珋x ± s，n = 3)
Group
Concentration
/mg·L －1
G0 /G1 phase
/%
S phase
/%
G2 /M phase
/%
Control － 71． 0 ± 7． 0 24． 8 ± 6． 8 4． 1 ± 0． 5
ETS 10 76． 4 ± 2． 7 20． 4 ± 3． 0 3． 3 ± 0． 5
20 78． 0 ± 1． 6 19． 0 ± 1． 9 3． 0 ± 0． 4
40 81． 2 ± 1． 4＊＊ 16． 2 ± 1． 2＊＊ 2． 6 ± 0． 6＊＊
＊＊P ＜0. 01 vs control
3． 4 ETS对 HT-29 细胞 PLK1 蛋白表达的影响
不同浓度 ETS(10、20、40 mg·L －1)处理 HT-29 细胞
48 h后，PLK1 蛋白表达量明显降低(Fig 3) ，呈现出
明显的量效关系。
Fig 3 Effect of ETS on PLK1 protein expression in HT-29 cells
4 讨论
MTT法结果显示，ETS 对人结肠癌细胞株 HT-
29 的增殖有明显的抑制作用。随浓度增大抑制率
逐渐增加，浓度为 200 mg· L －1 时抑制率可达
95. 70%，IC50值为 37. 39 mg·L
－1。
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是指细胞在基
因调控下的一种自主性的死亡现象。Annexin V /PI
双染法是近年来较为常用的检测细胞凋亡的方法，
流式细胞仪检测结果显示，ETS 浓度为 40 mg·L －1
时细胞凋亡率可达(70. 4 ± 6. 1)%，明显高于空白
对照组的(19. 0 ± 5. 0)%。说明 ETS 具有明显的诱
导细胞凋亡的作用。
细胞周期是指细胞完成一次分裂增殖所要经历
的过程。主要包括 G0 /G1 期、S 期、G2 /M 期。G0 /
G1 期主要接收增殖信号，进行除 DNA 以外的生物
大分子的合成。S 期主要是进行 DNA 合成。G2 /M
期主要进行 DNA 复制和细胞分裂。流式细胞仪检
测结果显示，ETS 作用 HT-29 细胞 48 h 后，G0 /G1
期细胞比率明显增加，S 期和 G2 /M 期细胞比率明
显减少，并呈现明显的量效关系。说明 ETS 可能是
通过使细胞阻滞于 G0 /G1 期，无法进入 S 期和 G2 /
M期这一途径诱导 HT-29 细胞产生凋亡。
PLK1 蛋白是丝 /苏氨酸激酶的一种，在人类多
种肿瘤细胞中高度表达［10］。Western blot 检测结果
·7451·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Nov;29(11)
显示，ETS作用 HT-29 细胞 48 h 后，与空白对照组
比较，PLK1 蛋白表达量明显降低，高剂量时表达量
最低，进一步说明 ETS诱导 HT-29 细胞凋亡的途径
可能与抑制肿瘤细胞增殖相关蛋白表达有关。
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Growth inhibitory effect of total saponins from leaves of Aralia elatl Seem
on human colon cancer and its related mechanism
YIN Li-ying，LI Feng-jin，BIAN Xiao-yan，NIU Wen-ying，AO Peng，XIAO Hong-bin
(Teaching Experimental Center，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)
Abstract:Aim To investigate the growth inhibitory
effects of total saponins from leaves of Aralia elatl Seem
(ETS)on human colon cancer cells and explore the
related mechanism． Methods The inhibitory rate of
ETS on HT-29 cell proliferation was determined by
MTT method． Annexin V-FITC and PI staining were
used to examine cell apoptosis and cycle． The expres-
sion of PLK 1 protein was analyzed by Western blot
method． Ｒesults Cell proliferation was inhibited in
HT-29 cells treated with ETS，and the value of IC50
was 37. 39 mg·L －1 after 48 h． ETS could induce HT-
29 cells apoptosis and arrest cell at G0 /G1 phase，
while decreasing the expression of PLK1 protein． Con-
clusions ETS can inhibit the proliferation of human
colon cancer cell，and the mechanism may be related
with the induction of cell apoptosis，the change of cell
cycle (G0 /G1 phase arrest)and the down-regulation of
the expression of PLK1 protein．
Key words:total saponins from leaves of Aralia elatl
Seem;HT-29 cells;cell cycle;cell apoptosis;PLK1
protein
·8451· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2013 Nov;29(11)